이 작품은 NIH 지역 프로그램에서 보조금 GM096076에 의해 지원되었다.

1. 해부를위한 파리 준비 <ol><li> 이전보다 일주하는 원하는 유전자형 (예를 들어, GFP-라벨 단백질을 표현)의 건강 파리를 마취. 둥근 크림색 abdomens으로 10-15 대 여성을 선택합니다. </li><li> 새로운 가볍게 yeasted 음식을 포함하는 유리 병에 선택한 파리와 몇 가지 (3-5) 남성을 송금 파리 25 ° C.에서 이틀 동안 살찌 울 수 Drosophila 준비에 대한 자세한 내용은 Weil 외 6.를 참조하십시오. 대비해 한참 지방을 축적 파리 단계의 다양한, 특히 단계 8-12은 이미지에 사용할 수 있도록합니다. 제대로 살 찌우는 또는 unfattened하는 것이 매우 초기 단계 (1-6)과 성숙 (무​​대 14) oocytes를 포함 이동합니다. </li></ol> 2. 입식 복합 현미경을 사용하여 이미징을위한 Oocytes의 작성 <ol><li> 실리콘 그리이스를 사용하여 약 1cm 간격의 슬라이드에 두 coverslips을 affixing하여 표준 유리 슬라이드를 준비5. 만 coverslip 및 슬라이드 사이 좋은 도장을 보장하기 위해 충분한 기름을 사용합니다. 각 coverslip에 단단히 아래로 누르면 얇게하고 균일하게 기름을 전파합니다. coverslips 및 슬라이드 사이의 시점에 일부 할로 카본 오일에게 27 일 (시그마)를 추가합니다. 그들은 다음 단계로 분리 oocytes의 손상 방지하기 위해 스페이서 역할을합니다. 번호 1.5 coverslips 늦게 무대 oocytes의 것이 일치하는 평균 두께 (0.16-0.18 mm)로 잘 작동합니다. </li><li> 22mm 2 coverslip의 표면에 장소 할로 카본 오일 27로부터 2-3 방울을. 가능한 가장 건강 oocytes를 구하려면 개인 여자는 입 pipetting을 사용하여 식품 유리 병에서 제거하고 부드럽게 첫번째 anesthetizing없이 할로 카본 오일로 입금됩니다. </li><li> 날카로운 해부 포셉 (예 : 뒤몽 # 5)를 사용하여 coverslip에 대한 플라이를 핀과 복부의 끝을 당겨. 기름 아래에있는 coverslip의 표면을 따라 드래그하여 난소를 제거합니다. 이 adhesio을 촉진합니다N coverslip에 oocytes의. </li><li> 부드럽게 oogenesis 중 적어도 무대 10B 아르 oocytes를 찾고, 난소를 분리 애타게. 이 단계에서 Oocytes는 난 모세포가 난자 챔버의 전체 볼륨의 최소 50~60%를 차지하고있는 계란 챔버를 찾아 식별 할 수 있습니다. 이 시점 oogenesis의에서, 난 모세포 놓인 소낭 세포는 원주가 있으며, 간호사 세포에 대한 연결이 남아 작은 지역을 제외한 모든면에서 난 모세포를 둘러싸고 있습니다. ovariole 칼집에서 개별 oocytes을 제거 포셉을 사용합니다. </li><li> 5-8 큰 피해를 oocytes가 coverslip에 격리 될 때까지, 1-3 여성을 사용하여 진행합니다. 모든 unuseable 조직을 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 oocytes가 두 스페이서 사이에 위치되도록 사전 준비를 슬라이드에 oocytes가 포함 된 coverslip을 반전. 그 oocytes를 손상시킬 수로 역 coverslip에 눌러하지 마십시오. 필요한 경우, t에 할로 카본 오일의 작은 금액을 추가&quot;샌드위치&quot;의 그 가장자리 공간 확보를 보장하기위한 가득 차 있습니다. (옵션 :. coverslip의 정착이 가능하도록하기 위해서 몇 분 동안 슬라이드 나머지를 보자) 슬라이드는 이제 이미지에 대한 준비가되었습니다. </li></ol> 3. 역 복합 현미경을 사용하여 이미징을위한 Oocytes의 작성 <ol><li> Oocytes 대신 coverslips의 사용이 유리 하단 삽입 (MatTek 35 ㎜)과 그 작은 페트리 요리를 제외하고 기본적으로 2 절에서 설명 해부 있습니다. 이 표본을 충당 할 필요가 있으며, 절개 후 조직은 요리에 직접 이미징 될 수 있지만, 치료가 oocytes 기름으로 덮여 들어갔다 건조 할 수 없습니다 유지하기 위해주의해야합니다. </li></ol> 4. 영상 라이브 <ol><li> DIC 또는 위상 대비 광학을 사용하여 초점에 난 모세포를 가져와 같은 세포질의 누출, 또는 소낭 세포의 불룩 등의 손상의 징후가 난 모세포을 확인합니다. 건강하고 큰 피해가 표시 이미지 만 oocytes. </li><li> Strea세포질에 난황의 소포는 7 autofluorescent 때문에 명나라는 GFP 라벨 필요없이 직접 모니터링 할 수 있습니다. 이 신호는 범위의 FITC 범위에서 캡처 할 수 있지만 가능성이 GFP-라벨 단백질에 사용되는보다 높은 게인 설정이 필요합니다. </li><li> 스트리밍의 가장 좋은 이미지는 단지 유리 coverslip / 페트리 유리에 대해 쉬고 난 모세포의 표면 이하의 광학 섹션에서 얻을 수 있습니다. 다음은 난 모세포가 약간 초점이 더 나은 비행기를 만들고 평평하게되어 있습니다. 이미지는 200X에서 캡처 할 수 - 1,000 X. coverslip의 난 모세포와 목표 사이에 장벽을 형성부터 배열을 사용하면 여기에 설명 된, 공기의 목표는 사용해야합니다. 가 크게 샘플의 드리프트와 움직임을 최소화하기 때문에 최적입니다. </li><li> 관심 지역 초점이되면 brighfield 광학을 해제하고 공 촛점 이미징로 전환합니다. 소프트웨어의 빠른 검색 / 미리보기 기능을 사용하여 초점을 조정하고 얻을 수필요에 따라. </li><li> 캡처를위한 설정 현미경의 현미경을 다를 수 있지만, 일반적으로 매개 변수는 다음과 같습니다 ~ 488 nm의 여기 파장과 ~ 515 nm의 방출 파장을 사용합니다. Z-축 Z 축 프레임 사이의 10 초를 지연으로 일정하게 유지되도록 캡처 설정합니다. 난 모세포는 고정하고 초점 비행기가 적절한 보장하기 위해 5-10 프레임의 테스트 시퀀스를 캡처합니다. </li><li> 전형적인 시간 경과 순서는 20 사이에 캡처됩니다 - 50 프레임, 및 비디오 품질을 평가하는 종료 후 즉시 확인 할 수 있습니다. 과정은 슬라이드에있는 다른 세포에 대해 반복 할 수 있습니다, 또는 필요에 따라 추가 여성은 해부 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 문제 해결 및 일반적인 문제 <ol><li> 드리프트 - 수직 현미경을 사용하는 경우, 전지는 때때로 인해 기름의 확산에 표류 할 수 있습니다. 이것은 coverslip 아래 영역을 커버 만 충분한 오일을 사용하여 최소화 할 수 있습니다. 문제가 계속되면, 더 적은 실리콘 g를 사용하여슬라이드에 부착 스페이서에 rease. </li></ol> 참고 : 일부 공 촛점 소프트웨어 패키지가 셀 추적 할 수 있지만, 일반적으로는 떠도는 oocytes의 이미지를 포기하고 대신 다른 표본을 사용하는 것이 좋습니다. <ol start="2"><li> 더 스트리밍의 흔적 - 스트리밍이 분명하지 않은 경우가 주로 두 원인 중 하나 일 수 있습니다, 두 이미지 캡처에 대한 초점 평면이 정확하지 않습니다 (보통 난 모세포의 내부에 너무 깊이) 또는 난 모세포가 손상되었습니다. 시간과 연습은 모두 오류를 최소화 할 수 있습니다. </li></ol>

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	<li>Becalska, A. N., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+mRNA+localization+in+Drosophila+oogenesis.">Lighting up mRNA localization in Drosophila oogenesis.</a> Dev. 136, 2493-2503 (2009).</li><li>He, L., Wang, X., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+light+on+Drosophila+oogenesis:+Live+imaging+of+egg+development.">Shining light on Drosophila oogenesis: Live imaging of egg development.</a> Curr. Opin. Gen. Dev. 21, 612-619 (2011).</li><li>King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ovarian development Drosophila melanogaster. , (1970).</li><li>Spradling, A. C., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+genetics+of+oogenesis.">Developmental genetics of oogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 1, 1-70 (1993).</li><li>Serbus, L. R., Cha, B. -. J., Theurkauf, W. E., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+and+the+actin+cytoskeleton+control+kinesin-driven+cytoplasmic+streaming+in+Drosophila+oocytes.">Dynein and the actin cytoskeleton control kinesin-driven cytoplasmic streaming in Drosophila oocytes.</a> Dev. 132, 3743-3752 (2005).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+Individual+Drosophila+Egg+Chambers+for+Live+Imaging.">Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (60), e3679 (2012).</li><li>Theurkauf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+microtubule-dependent+cytoplasmic+streaming+in+cappuccino+and+spire+mutant+oocytes.">Premature microtubule-dependent cytoplasmic streaming in cappuccino and spire mutant oocytes.</a> Science. 265, 2093-2096 (1998).</li><li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila.">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> PNAS. 98, 15050-15055 (2001).</li><li>R&#246;per, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rtnl1+is+enriched+in+a+specialized+germline+ER+that+associates+with+ribonucleoprotein+granule+components.">Rtnl1 is enriched in a specialized germline ER that associates with ribonucleoprotein granule components.</a> J. Cell Sci. 120, 1081-1092 (2007).</li><li>Pokrywka, N. J., Payne-Tobin, A., Raley-Susman, K. M., Swartzman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules,+the+ER+and+Exu:+New+associations+revealed+by+analysis+of+mini+spindles+mutations.">Microtubules, the ER and Exu: New associations revealed by analysis of mini spindles mutations.</a> Mech. Dev. 126, 289-300 (2009).</li><li>Petri, W. H., Mindrinos, M. N., Lombard, M. F., Margaritis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+the+Drosophila+chorion.ih+a+chemically+defined+organ+culture+medium.">In vitro development of the Drosophila chorion.ih a chemically defined organ culture medium.</a> Wilhelm Roux's Arch., Devl. Biol. 186, 351-362 (1979).</li></ol>

나는 공개 할 아무 것도 없습니다.

Drosophila의 oocytes는 세포와 subcellular 구성 요소의 기능과 조직에 관한 질문의 다양한 해결을 위해 다양한 모델 시스템입니다. 단백질 기능의 전체 이해 단백질 행동 모두 공간과 시간적 측면의 모니터링이 필요합니다. Drosophilists 사용할 수 이미징 시스템과 유전 도구 모두에서 진보는 가능도 작은 실험실 생활 oocytes에서 고품질의 영상 실험을 수행 할 수 있도록. 난 여기 단백질 기능을 조사하기 위해 유전 배경을 다양한와 함께 사용할 수있는 늦은 oogenesis 중순에하는 동안 GFP-태그 또는 autofluorescent 단백질과 구조의 동작을 분석 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에서 나는 oocytes는 이미징 및 형광 단백질과 구조의 시간 경과 영상 취득이 활성화됩니다 기본 공 촛점 설정을 위해 준비하는 과정을 설명합니다. 추가 detai난 모세포 준비에이게는 Weil 외 의해 설명되어 있습니다. 6 다양한 endogenously 엑손 - 트래핑를 통해 태그 된 단백질을 표현 플라이 변종 8 이용하실 수 있으며, 무한 더 많은 단백질 변형이 설계 및 파리에 다시 제출 할 수 있습니다. 생활 조직과 협력에서, 표본의 건강은 가장 중요한 중요합니다. 무대 10B에서 알 챔버는 단기 이미징 연구에 이상적입니다, 기본적으로 자율적 인 방식으로 11 oogenesis을 완료 할 수 있습니다. 케어는 고품질의 데이터를 얻을 수 몇 가지 주요 단계에서 촬영해야합니다. 해부하는 동안은 가능한 한 작은으로 난소와 oocytes를 조작하고, 해부 및 이미징의 완료 사이의 시간의 양을 최소화하는 것이 중요합니다. 이상적으로, 작은 절개 역은 공 촛점 범위를 소장 같은 방에 있어야하고, 한 번에 몇 계란 챔버는 이미징해야합니다. 번호 (5-8 여기에 권장) 좋은 품질의 이미지를 얻을 가능성을 극대화 해부 시간이 최소화 될 수 있도록합니다. I 이미지 품질을 평가하고 캡처 설정이 더 이상 시간 경과 순서를 캡처하기 전에 최적화되어 있는지 확인 이미지의 짧은 시리즈를 캡처하는 것이 좋습니다. 대부분의 소프트웨어는 개별 프레임을 저장할 수 있으며, 이러한 이미지는 다음 ImageJ 12 다른 소프트웨어를 사용하여 다양한 방법으로 분석 할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 할로 카본 오일 27 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> H8773-100ML </td><td></td></tr><tr><td> # 5SF 집게 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11252-00 </td><td></td></tr><tr><td> 실리콘 그리스 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> Z273554 - 1EA </td><td></td></tr><tr><td> 유리 바닥 배양 접시 </td><td> MatTek </td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of gfp-labeled proteins in drosophila oocytes

Drosophila의 난 모세포는 같은 cytoskeletal 기능, 세포 조직 및 세포 기관의 구조와 기능 등의 근본적인 질문에 대해 조사를위한 다양한 시스템으로 설립되었습니다. 다양한 GFP 태그 단백질의 가용성은 여러 세포 프로세스가 몇 분, 아님 몇 시간의 과정을 통해 세포를 사는,이 기술을 사용하여 모니터링 할 수 있다는 것을 의미합니다, 이러한 RNP 교통, 상피 morphogenesis 및 조직 리모델링과 같은 프로세스는 훌륭한 자세히 설명되어 Drosophila의 oocytes의 1,2 인치 돌연변이의 풍부한 레퍼토리와 함께 비디오 이미징을 수행 할 수있는 능력은 유전자 및 프로세스의 거대한 다양한 종류의 놀라운 세부 사항에서 검토 할 수 있습니다. 하나의 예는 중간 oogenesis 3,4에서 시작 ooplasmic 스트리밍의 과정입니다. 세포질 소포의 활발한 움직임은 미세 소관과 kinesin 종속적 인 5 및 유용한 치세요을 제공합니다이 단계에서 세포 골격 기능을 조사하는 TEM. 난 여기 거의 모든 공 촛점 현미경 설정을 사용하여 생활 oocytes의 시간 경과 영상을위한 프로토콜을 제시한다.

GFP-분류 단백질의 영상은 태그 단백질이 표현되는 방식을 강하게에 따라 달라집니다. reticulon은과 같은 1 (Rtnl-1), 엑손은 GFP 8,9 태그를 표현하는 중간 단계 난 모세포는 강력한 신호를 생성한다. Rtnl-1에 나타납니다 10 ooplasmic 스트리밍 (그림 1A) 동안 현재의 긴 미소와 함께 공동 현지화. Rtnl-1 스트리밍을 관찰하기에 좋은 표시입니다, 또한 늦은 무대 oocytes의 미세 소관 기관의 지표입니다. 한 프레임의 캡쳐 속도마다 10 초 (그림 1B)를 사용할 때 wildtype 달걀 챔버에서 Ooplasmic 스트리밍은 autofluorescent 난황의 소포의 눈에 띄는 움직임으로 분명하다. 다섯 프레임의 최대 돌출부는 이동 소포의 경로를 표시 생성 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50044/50044fig1.jpg" /> 1 그림. autofl 모두의 영상을 라이브uorescent와 GFP 태그 구조. 400 배로 확대 한 Rtnl1-GFP를 표현 무대 11 난 모세포의 A) 하나의 시간 경과 이미지입니다. Rtnl1-GFP 섬유는 스트리밍 oocytes의 파도와 같은 모션으로 이동합니다. autofluorescent 난황의 소포가 400 배로 확대 한 확대, 50 초 총마다 10 초를 이미지로 된에 무대 10B 계란 챔버의 B)는 5 프레임 최대 프로젝션입니다. 스케일 바 = 30 μm

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Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

개인의 GFP 태그 단백질 또는 autofluorescent 구조의 라이브 영상을위한 프로토콜<em&gt; Drosophila</em&gt; oocytes가 설명되어 있습니다.

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The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

11.2K 조회수.  Vassar College. 개인의 GFP 태그 단백질 또는 autofluorescent 구조의 라이브 영상을위한 프로토콜 Drosophila oocytes가 설명되어 있습니다.

비디오: Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

연구

생물학

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

의 준비 Drosophila</em공중 드롭 프로토콜을 사용하여 라이브 영상을위한> 태아

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

COS - 7 형광 라벨링는 라이브 셀 이미징에 대한 SNAP - 태그 퓨전 단백질 표현

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

개별 준비 Drosophila</em라이브 이미징을위한> 계란 회의소

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

에 GFP-라벨 단백질의 영상을 라​​이브

에 GFP-라벨 단백질의 영상을 라이브