이 작품은 정신 건강 보건 / 국립 연구소 (NIH / NIMH)의 국립 연구소 # 1R21MH085267을 부여하여 지원했다.

1 부 : 다중 구획을위한 마스터 몰드를 준비 신경 세포 공동 배양 장치 제작 <ol><li> PMMA 마스터를 조작하는 첫 번째 단계는 3.5 mm 깊이 구획을하는 것입니다. 한 소마 구획 여섯 축삭 / glia 구획은 마이크로 밀링 머신 (MDX - 40, 롤랜드 또는 기타 CNC 밀링 머신)을 사용하여 PMMA 블록에 정의됩니다. PMMA 마스터는 다음 파편을 제거하는 10 분 동안 이소 프로필 알코올에 sonicated됩니다. </li><li> 2.5 μm의 하이 리지 구조의 배열은 유리의 서부 유럽 표준시 에칭 다음 표준 석판술 프로세스에 의해 50.8 mm X 50.8 mm 유리 슬라이드에 패턴입니다. 첫째, 리지 구조의 배열 석판술를 사용하여 긍정적인 포토 레지스트 S1818과 함께 청소를 유리 기판에 패턴입니다. S1818은 110을 기반으로 부드러운 기판 (4000 RPM)에 스핀 - 코팅 ° 후 5 분 C 및 40 MF319에 포토 레지스트의 개발하여 다음 마스크 aligner를 사용하여 자외선 (84 MJ / cm 2)에 노출 초. 다음, 포토 레지스트 패턴 유리 기판은 2.5 μm의 톨 리지 구조를 얻기 위해 6-7분 위해 상온에서 산화 에칭 버퍼 (BOE)에 포장되어 있습니다. 마지막으로 포토 레지스트 층 드 이온화 (DI) 물에 rinsing 철저한 다음, 아세톤과 이소 프로필 알코올에 의해 제거됩니다. </li><li> 마이크로 리지 구조와 유리 기판의 패턴을 전송하는 PMMA 마스터에 대한 핫 - 양각입니다. 첫째, PMMA의 금형 마스터와 유리 기판은 수동 정렬 및 핫 언론에 게재됩니다. 그러면, 온도가 115로 올랐을 ° C. 일단 원하는 온도 중량 0.5 톤 5 분 적용, 도달합니다. 5 분 후에, 온도는 40 ° C와 압력이 릴리스로 냉각합니다. PMMA 마스터는 다음 50.8 mm X 50.8 mm 크기의 블록으로 절단됩니다. </li><li> 무게 : 1 PDMS 사전 중합체 (Sylgard 184은) 10의 비율로 치료 요원과 함께 혼합됩니다. </li><li> PMMA 마스터는 캐스크와 PDMS 혼합물은 PDMS 마스터를 조작하는 PMMA 마스터 위에 부어 안에 있습니다. 그것은 다음 진공 펌프에 연결된 건조기에 배치됩니다. PDMS 다음 PDMS 믹싱 과정에서 발생하는 거품을 제거하는 15 분 동안 degassed입니다 PMMA 마스터 위에 부어. </li><li> 모든 거품을 제거하는 경우, PDMS는 중합 한 시간 동안 뻗었 85 ° C 오븐 안에 넣어 수 있습니다. </li><li> 일단 PDMS이 완전히 치료되어 PDMS 마스터는 PMMA 마스터에서 출발 벗겨 trichlorosilane로부터 2-3 방울과 건조기 안에와 수증기 코팅 15 분 PDMS 마스터 표면을 위해 진공 청소기로 청소를합니다. Trichlorosilane 코팅은 PDMS 마스터에서 최종 PDMS 신경 세포 공동 배양 장치의 릴리스를 용이하게합니다. 코팅 후, PDMS 마스터는 간단히 과도한 trichlorosilane을 제거하는 이소 프로필 알코올로 씻어서이며, N 2 가스로 건조. </li></ol> 2 부 : 뉴런 문화 장치 복제 <ol><li> 무게 : 1 PDMS 사전 중합체 (Sylgard 184은) 10의 비율로 치료 요원과 함께 혼합됩니다. </li><li> PDMS 혼합물의 PDMS 마스터 위에 붓고 15 분 동안 진공 펌프에 연결된 건조기 내부 degassed입니다. 이것은 마스터에서 3.5 mm 높은 PDMS의 구조가 완전히 잠겨되지 않도록 너무 PDMS 잔하지 않는 것이 중요합니다. </li><li> 모든 거품을 제거하는 경우, PDMS는 중합 한 시간 동안 뻗었 85 ° C 오븐 안에 넣어 수 있습니다. </li><li> PDMS 한 시간 후 오븐에서 제거하고 진정 실온에서 왼쪽입니다. 그런 다음, PDMS 뉴런 문화 장치 부드럽게 PDMS 마스터에서 해제 벗겨 수 있습니다. PDMS 장치 해제 벗겨 먼지 또는 파편으로부터 그들을 보호하기 위해 parafilm으로 싸여있다. </li><li> parafilm과 포장 PDMS 기기, 블레이드 장착된 드릴 프레스를 사용하여 개별 조각으로 절단됩니다. </li></ol> 제 3 부 : 장치 조립 <ol><li> PDMS 뉴런 문화 장치는 플라즈마 청소기 내부 배치와 PDMS 장치의 표면이 친수성 ​​만들어 90 초 동안 공기 플라즈마에 노출됩니다. 이 플라즈마 처리는 폴리 - D - 라이신 코팅 기판에 조립 후 문화 매체와 기입에 microchannels를 촉진합니다. </li><li> 플라즈마로 처리 장치는 다음 살균을 위해 30 분 동안 70 %의 에탄올에 열중하고 소독 바이오 후드 안쪽 이동됩니다. </li><li> 멸균 장치는 70 % 에탄올에서 제거하고 Millipore 여과 N 2 가스로 건조됩니다. 말린 디바이스는 6 잘 문화 플레이트와 부드러운 압력이 기판과 장치 사이의 밀봉을 보장하기 위해 적용되는 폴리 - D - 라이신 코팅 폴리스티렌 상단에 표시됩니다. </li><li> 문화 미디어 다음 여섯 축삭 / glia 구획을 작성하여 다음, 소마 짐칸에 가득 차 있습니다. 이것은 거품이 microchannels 내에 갇혀되지 않습니다 않도록 소마의 구획으로 문화 미디어를 삽입한 후 축삭 / glia 구획을 작성하기 전에 1~2분에게 주저하는 것이 좋습니다. </li><li> 문화 미디어로 가득 장치는 37 가능한 모든 이물질이나 독성 잔류물을 씻어하기 ° C 배양기 안에서 하룻밤 incubated입니다. </li></ol> 4 부: 셀 로딩 및 신경 세포 - oligodendrocyte 공동 문화 <ol><li> 세포 배양의 첫 날, 배아 날부터 기본 forebrain의 신경 세포는 16-18 쥐 500 세포 / mm 2 면적 밀도에서 소마 짐칸에로드됩니다. 첫째, 소마 구획 및 축삭 / glia 구획 모두 내부 문화 미디어는 이전의 셀 로딩에 피펫을 사용하여 aspirated 있습니다. 그런 다음, 문화 미디어 40 μl에 희석 38,500 전지는, microchannel 인레츠 주변의 소마 구획에로드됩니다. 그것은 장치와 기판 사이의 봉인을 깰 수 있기 때문에 그것은 세포를 로딩하는 동안 PDMS 장치를 만지지 않는 것이 중요합니다. </li><li> 기판에 세포 부착을 향상시키기 위해 37 ° C 배양기 안에서 30 분 동안 셀 로드된 장치를 품어. 부화 후, 모든 구획은 문화 미디어로 가득 차 있습니다. </li><li> 전지는 37 양식 아르 ° humidified 5% CO 2 배양기에서 C 및 문화 매체의 절반 밖에이 모든 3~4일 밖으로 변경됩니다. </li><li> 체외에서 신경 세포 문화 날로부터 14 일 후, oligodendrocytes가 공동 문화 축삭 / glia 구획에 추가됩니다. 출생 후의 일 1-2에서 스프 라그 - 돌리 쥐의 대뇌 반구의 해부 Oligodendrocytes은 1000 셀 / mm 2 면적 밀도 각 축삭 / glia 구획에 추가됩니다. 이전 로딩 세포로 구획 내부 문화 미디어의 약 60 %는 피펫과 aspirated 있습니다. 이 기판에 형성 axonal 네트워크를 손상 수 있기 때문에주의가 바닥 기판을 만지지 않도록하셔야합니다. 그런 다음, 문화 미디어 5 μl에 희석 6,700 oligodendrocyte 세포, 축삭 / glia 구획에 추가됩니다. 세포는 1 시간 동안 incubated하고 구획은 문화 미디어로 가득 차 있습니다. </li><li> 전지는 37 양식 아르 ° humidified 5% CO 2 인큐베이터에만 문화 미디어의 절반이 두 주 동안 매일 3-4일 밖 변경에 C. </li></ol> 제 5 부 : 대표 결과 : 실험이 제대로 수행되면 소마 구획에 로드된 신경 세포는 문화의 일주 후 축삭 / glia 구획 내부 형태로 시작 가까운 microchannel 인레츠 및 axonal 레이어 찾을 수 없습니다. 소마 구획 내부에 신경 세포의 집합의 로그인 세포가 건강하지 않는 표시하실 수 있습니다. 신경 세포 문화의 2 주 후에 oligodendrocytes를 로드할 때, 축삭 / glia 구획을 axons와 oligodendrocytes의 밀도 층으로 덮여 있어야이 axonal 레이어 위에 적재해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig1tmb.jpg" border="0" alt="그림 1" /> 그림 1. 높은 처리량 microfluidic 다중 구획 CNS 신경 공동 문화 플랫폼의 도식 그림. 소마의 연결 및 dendrites뿐만 아니라 분 유체 수준의 차이와 구획 사이의 유체 고립에서 axons의 고립을 보여주는 교차 단면 볼 수 있습니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig2tmb.jpg" border="0" alt="그림 2" /> 그림 2. 제작 및 다중 구획을 위해 조립 단계 PDMS microfluidic 공동 문화 장치. 각 장치는 종래의 6 자 폴리스티렌 세포 배양 접시 하나에 잘 맞는 데요. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig2.jpg">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

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	<li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth.">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. 37, 550-575 (1998).</li><li>Taylor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2005).</li><li>Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxynitrite+generated+by+inducible+nitric+oxide+synthase+and+NADPH+oxidase+mediates+microglial+toxicity+to+oligodendrocytes.">Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

우리는 포유 동물 CNS 축삭 - glia 상호 작용을 연구를위한 다중 구획 공동 문화 플랫폼을 개발했습니다. CNS의 axons가 성공적으로 세포의 연결 기관 / dendrites과 격리되어 있었고, oligodendrocytes가 성공적으로 장치 내부에 공동 교양되었습니다. 신경 세포 밀도는 애플 리케이션에 의해 변경될 수 있지만, 너무 낮게 또는 너무 높은 농도는 세포가 죽는 원인이 될 수 있습니다. 또한, 기판의 셀 또는 axonal ?...

a multi-compartment cns neuron-glia co-culture microfluidic platform

우리는 더 높은 처리량을위한 병렬 여섯 독립적인 실험까지 수행 능력이 체외의 CNS에서 축삭 - glia 상호 작용 연구를위한 새로운 다중 구획 신경 공동 문화 microsystem 플랫폼을 제시한다. 우리는 좋은 repeatability와 대량 제조를 가능하게 한 부드러운 리소그래피 프로세스를 통해 동일한 장치 내에서 마이크로 및 매크로 모두 규모 구조를 가지고 microfluidic 장치를 만들 수있는 새로운 제조 방법을 개발했습니다. 다중 구획 microfluidic 공동 문화 플랫폼 oligodendrocytes (OLs)의 뉴런 여섯 축삭 / glia 구획 하나의 소마 구획으로 구성되어 있습니다. 소마 구획 및 축삭 / glia 구획은의 배열에 의해 연결되어 있습니다 축삭 -지도 microchannels 그 axons은 축삭 / glia의 구획으로 성장할 수 있도록하면서 물리적 장벽이 소마 구획에의 연결 소마 범위를 제한하는 등 기능을 수행합니다. 축삭 / glia 구획에 로드된 OLs은화된 축삭 - glia 상호 작용 연구를 활성화, axons과 함께하지만 소마의 연결 또는 dendrites에만 연계해서 실행할 수 있습니다. microchannels은 또한 6 독립적인 실험이 더 높은 처리량을위한 단일 장치에서 실시 수 있도록, 구획 사이에 유체 절연을 활성화. 폴리 (dimethylsiloxane) (PDMS)을 사용하여 소프트 리소그래피는 생물 의학 microdevices에서 일반적으로 사용되는 기법입니다. 이러한 장치에 대한 저수지는 일반적으로 수동 펀칭에 의해 정의됩니다. 간단 가난한 정렬 및 프로세스의 시간이 소요되는 자연은 저수지 많은 수의 반복 작성해야 할 때이 과정이 적합하지합니다. 있지만 새로 개발된 방법은 이러한 한계를 극복, 저수지의 수동 펀칭을 필요로하지 않았다. 첫 번째, 일곱 저수지 (깊이 : 3.5 mm)는 마이크로 밀링 머신을 사용하여 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트) (PMMA) 블록에되었다. 그런 다음, 유리 기판에 대한 조작 리지 microstructures의 배열은, 소마와 축삭 / glia 구획을 연결 microchannels을 정의하는 PMMA 블록에 대한 핫 - 양각되었다. 이 프로세스는 하나의 PMMA 마스터 내에서 일치하는 매크로 규모의 저수지 (3.5 ㎜)와 마이크로 규모의 채널 (2.5 μm의) 결과. 금형 마스터 역할을 PDMS 복제는 소프트 리소그래피와 최종 PDMS 장치가이 마스터에서 복제되었다를 사용하여 얻은 것입니다. E16 - 18 쥐의 기본 뉴런은 소마의 구획을 읽어 두 주 동안 교양되었습니다. 세포 배양 후 일주일 후, axons가 microchannels를 건너와 축삭 / glia 구획 안에 axonal는 네트워크 계층을 형성했다. Axons은 P1 - 2 쥐 6 축삭 / glia 구획 및 OLs에 걸쳐 균일하게 성장은 공동 문화 체외에 14 일 동안 축삭 / glia 구획에 추가되었습니다.

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A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

우리는 시험 관내 CNS 축삭 - glia의 상호 작용 연구를위한 새로운 다중 구획 신경 공동 문화 microsystem 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 병렬 여섯 독립적인 실험까지 실시 수 있으며, 새로 개발된 마이크로 / 매크로 하이브리드 제조 방법을 사용하여 가공했습니다.

다중 구획 CNS 뉴런 - glia 공동 문화 Microfluidic 플랫폼

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

a-multi-compartment-cns-neuron-glia-co-culture-microfluidic-platform

Research

JoVE Journal

Biology

11.9K 조회수.  Texas A&M University (TAMU). 우리는 시험 관내 CNS 축삭 - glia의 상호 작용 연구를위한 새로운 다중 구획 신경 공동 문화 microsystem 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 병렬 여섯 독립적인 실험까지 실시 수 있으며, 새로 개발된 마이크로 / 매크로 하이브리드 제조 방법을 사용하여 가공했습니다.

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Drosophila Melanogaster에서 애벌레 CNS의 해부

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

연구

생물학

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

세포 생물학을위한 그라디언트 생성 Microfluidic 장치

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Microfluidic 장치를 사용하여 셀 캡처

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

Microfluidic 프로브 : 운영 및 현지화된 표면 처리에 사용

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Microfluidic 흐름 전지를 사용하여 흐름에서 혈소판 접착 및 집계

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes. The device consists of three layers: first layer contains an array of microscale wells (500 &mu;m diameter and 150 &mu;m depth) that help to immobilize the islets while exposed to flow and maximize the exposed surface area of the islets; the second layer contains a circular perifusion chamber (3 mm deep, 7 mm diameter); and the third layer contains an inlet-mixing channel that fans out before injection into the perifusion chamber (2 mm in width, 19 mm in length, and 500 &mu;m in height) for optimizing the mixing efficiency prior to entering the perifusion chamber. The creation of various glucose gradients including a linear, bell shape, and square shapes also can be created in the microfluidic perifusion network and is demonstrated.

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence imaging of calcium influx and mitochondrial potential changes.

Microfluidic Perifusion 장치 내에서 멀티 파라메 트릭 아일릿 Perifusion 시스템

A microfluidic islet perifusion device was developed for the assessment of dynamic insulin secretion of multiple islets and simultaneous fluorescence ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidic 가용성식이 중재 신호의 상호 작용을 조사하는 상피 세포 박테리아의 공동 문화

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

안정적인 농도 기울기에 박테리아 Chemotaxis을 Quantifying위한 Microfluidic 장치

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo and for characterizing the earliest genes involved in hematopoiesis, without having to deal with embryonic lethalities. The ES/OP9 co-culture system was originally designed to produce hematopoietic progeny, without the over production of macrophages, as the OP9 stromal cell line is derived from the calvaria of osteopetrosis mutant mice that lack functional M-CSF. The in vitro ES/OP9 co-culture system can be used in order to recapitulate early hematopoietic development. When cultured on OP9 stromal cells, ES cells differentiate into Flk-1+ hemangioblasts, hematopoietic progenitors, and finally mature, terminally differentiated lineages. The standard ES/OP9 co-culture protocol entails the placement of ES cells onto a confluent layer of OP9 cells; as well as, periodic replating steps in order to remove old, contaminating OP9 cells. Furthermore, current protocols involve evaluating only the hematopoietic cells found in suspension and are not optimized for evaluation of ES-derived progeny at each day of differentiation. However, with replating steps and the harvesting of only suspension cells one potentially misses a large portion of ES-derived progeny and developing hematopoietic cells. This issue becomes important to address when trying to characterize hematopoietic defects associated with knockout ES lines. Here we describe a modified ES/mStrawberry OP9 co-culture, which allows for the elimination of contaminating OP9 cells from downstream assays. This method allows for the complete evaluation of all ES-derived progeny at all days of co-culture, resulting in a hematopoietic differentiation pattern, which more directly corresponds to the hematopoietic differentiation pattern observed within the embryo.

mStrawberry OP9 cells allow for complete evaluation of all ES-derived progeny from co-culture.

수정 ES / OP9 공동 문화 프로토콜 조혈 제니의 향상된 특성화를 제공합니다

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo ...