qFSM의 발달은 NIH 부여 U01 GM06230에 의해 후원됩니다.

섹션 1 : FSM에 대한 찬란 분류 굴지 구하기 자료가 필요합니다 : 굴지, 형광단을 (알렉사, X - rhodamine 권장) 정화. G - 버퍼, 초원 심 분리기 <ol><li> 좋은 FSM 영화를 인수하는 핵심 구성 요소는 선택의 형광단과 굴지의 적절한 라벨링 (또는 다른 cytoskeletal 단백질)이 필요합니다. 우리는 알렉사의 fluorophores (488, 568 파장)와 굴지의 표면에 리신 잔류물을 노출 대상 X - rhodamine succinimidyl 에스테르 유도체를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 귀하의 형광단과 적절한 파장을 선택하면 형광 태그를 수용하기 위해 (수은 아크 램프 및 / 또는 레이저)하여 현미경 설치 프로그램이 적절한 필터 (여기 및 방출)과 illuminators을 가지고 있는지 확인합니다. 우리는 자동 형광 및 사진 손상의 영향을 최소화하고, GFP - conjugates와의 호환성을 보장하기 위해 빨간색 파장 (560-630 nm의)에 주황색의 파장을 선택하는 것이 좋습니다. </li><li> 순수의 굴지는 쥐 또는 치킨에 속하는 근육 조직에서 추출한지만, 근육 아세톤 분말에서 장기 적출 수술을 필요로하실 수 있습니다. 근육 아세톤 가루는 Invitrogen에서 구입하실 수 있습니다. 라벨의 절차는이 프로토콜에 설명되어 있지 않지만, 여기에 [1]에서 찾을 수 있습니다 </li><li> 또는 Cytoskeleton 주식 및 Invitrogen 포함한 여러 공급 업체에서 표시 굴지의 단백질을 구입할 수 있습니다. 사용자 정의 라벨 서비스는 Invitrogen 통해서도 사용할 수 있습니다. 정화가 아닌 레이블 굴지는 (근육 nonmuscle의 굴지 모두) Cytoskeleton 주식 회사에서 구입하실 수 있습니다 </li><li> 자신의 레이블 굴지 구매하거나 준비할지 여부를 결정, 당신은 상표의 비율이 굴지의 모노머 당 0.3-0.7 염료 근처 있는지 확인 싶어. 너무 높은 상표의 비율이 너무 낮은 라벨의 비율이 가난​​한 찾고 speckles (소음이 낮은 신호)로 연결되지만, 굴지의 필라멘트의 매출의 반응 속도론 (및 연관된 단백질에 결합) 효과를 수 있으며, microinjection 문제를 (아래 참조)가 발생할 수 있습니다. 이것은 좋은가 이미지를 작은 반점 얻을 수 중요한 요소입니다. </li><li> 장기 보관하기 전에, 표시 굴지 솔루션은 75,000의 회전에 의해 명확히해야합니다 - 섭씨 4도 20 분 동안 80,000 XG합니다. 분류 굴지는 G - 버퍼 솔루션에 저장되며 -80도 섭씨 보관해야합니다. 이 UL aliquots을 준비하는 것은 매우 반복 (불용성 집계로 연결) 냉동 - 해동의 해로운 영향을 감소하는 것이 좋습니다. (fluorophores의 photobleaching됩니다) 직접 조명으로 표시 굴지 솔루션을 노출 자제. 우리는 장기 저장을 위해 불투명 microcentrifuge 튜브를 사용하는 것이 좋습니다. </li></ol> 섹션 2 : 레이블 굴지의 세포 Microinjection의 작성 자료가 필요합니다 : microinjection의 바늘, microsyringe, microloaders, prewarmed 세포 미디어, 사출 버퍼, 얼음 양동이, 현미경 (위상 링, 40X 위상 대비 목표, transjector, 바늘 풀러, micromanipulator)를 <ol><li> 많은 세포 유형은 FSM 의무가 있지만, 좋은가 이미지를 작은 반점 받고하면 microinjection 절차의 성공에 직접적으로 의존한다. FSM에 대한 세포를 선택할 때, 세포가 (&gt; 50 음 직경) 대형되어야 확산해야 할 때 도금하고, 기판 (또는 플라스틱 조직 문화 요리)로 자연 자기편 수 있습니다. 세포의 cytosol는 핵보다 큰 영역을 차지하고있다면 그것은 또한 도움이됩니다. 상기 기준은 세포 microinjection 의무가 있는지 확인합니다. 성공적인 후보 세포 라인 (그러나 이에 국한되지 않음) PtK1 [2,3], 뉴트의 폐 세포 [4], 그리고 Aplysia의 뉴런 [3]. 포함 </li><li> 산성 - 세탁되었습니다, 전지는 평방 유​​리 coverslips (NO 1-1/2. 22 X 22mm)를 도금한다. 표준 기판 코팅은 coverslip에 적용할 수 있으며 microinjection에 영향을 미치지 않습니다. </li><li> microinjection의 바늘의 올바른 선택 팁 개방의 크기에 따라 달라집니다. 일반적으로, 구멍 크기는 수 매우 크기 0.5 음의 크기 3으로 음. 그러나, 우리는 굴지의 주입은 0.5-1 음 사이의 최적의 오프닝 크기를 필요로하는 것이 좋습니다. 막히는 문제가 지속적으로 발생하는 경우에는 큰 구멍 크기는 monomeric의 전달뿐만 아니라 불필요한 polymerized 굴지의 필라멘트에 대해 수용할 수 있습니다. Microinjection의 바늘은 femtotip의 microinjection의 바늘을 Eppendorf 시스템을 포함한 여러 공급 업체를 통해 구입할 수 있습니다. 상업 바늘 풀러를 사용할 수있는 또는 경우, 유리 microinjection 튜브는 셔터에서 구입하고 사양을 뽑았 수 있습니다. 초보자를위한, 우리는 사출 절차를 시작하기 전에 손에 10-20 뽑아 바늘을 가지고하는 것이 좋습니다. </li><li> 굴지의 이상적인 &#39;주입 농도&#39;(당신의 바늘에 로드된 굴지의 최종 농도)는 UG / UL 1.0-0.5 사이의 굴지의 단량체에 염료의 40 % 라벨 비율에 따라 달라집니다. 당신의 굴지의 낮은 라벨 비율은 높은 농도 (1-3 UG / UL)의 주사에 의해 보상을 수 있습니다. 그러나 바늘의 막히는 빈도 것입니다수 증가. 이것은 부분적으로 큰 구멍 바늘을 사용하여 완화 할 수 있습니다. 굴지의 주식 농도는 얼음처럼 차가운 분사 버퍼를 추가하여 희석 수 있습니다. 차가운 ddH2O도 빠른 주사를 위해 희석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 시점에서 모든 작업 솔루션은 얼음에 보관해야합니다. </li><li> microsyringe를 (좁은 게이지 - 해밀턴)를 사용하여 굴지 솔루션의 1.0 UL 로드할 0.5, 또는 양자 택일로 microloader 피펫 팁을 사용하여. </li><li> 조심스럽게 부드럽게 솔루션을 발표하여 굴지의 솔루션을 분배. 버블은 피해야한다지만, 쉽게 거품을 둘러싼 여분의 액체를 복용하여 제거할 수 있습니다. </li><li> 굴지 솔루션 바늘 끝에 완전히 쉬고 있는지 확인하십시오. 어디 바늘의 모세관을 따라 초과 솔루션은 사출 흐름을 중단하실 수 있습니다. </li><li> 이제 조심스럽게 인젝터 홀더로, 바늘 끝과 접촉을 피하기 위해, 바늘을 부착합니다. 바늘이 현미경 단계의 기본에 35-50도 각도를 만드는 있도록 홀더를 놓습니다. 낮은 각도가 선호됩니다. </li><li> 그것이 거의 당신의 세포를 목욕 매체의 표면을 나누기 전까지는 바늘의 팁을 낮춥니다. </li><li> 그것이 바로 목적의 중앙 위에 달려 있도록 이제 바늘 팁을 (낮추는없이) 위치. 바늘 끝이 목적에 부합하는 경우, 당신은 접안 렌즈를 통해 밝은 후광이 나타납니다. 이것은 바늘 끝의 끝 부분입니다. 천천히 (조작하는 사람을 사용하여)쪽으로 바늘 측면 이동은 헤일로를 찾아 더 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 당신의 세포 클리어 뷰에있는 때까지 현미경에 Z - 초점을 조정합니다. 결국 바늘 끝에 수렴까지 헤일로가 점차 수축까지 이제 천천히 팁을 낮은 - 당신은 동시에 초점 (Z 위치)를 제어해야합니다. 찾기 위해 추가적인 기능은 선형 그림자됩니다 바늘의 샤프트입니다. 바늘을 줄이면 서서히 바늘 샤프트를 정의합니다. 정확하게 바늘과 세포의 끝을 마치면 모두 클리어 뷰에 있어야합니다. 상 반지의 약간의 조정은 대비를 향상시키기 위해 필요할 수 있습니다. </li><li> 탐색하면 바늘 끝이 잘 바늘 끝을 위반 방지하여 세포 위에 있는지 확인하십시오. </li><li> 주입하는 세포를 선택하면 무료로 가장자리와 세포는 바늘 끝에 직면해야합니다. 이것은 병렬 실행보다 바늘 팁, 오히려을 맞이할 것입니다 (핵이 얇고 지점​​, 첨단을있는 두꺼운 지점에서) 세포의 감소 기울기를 보장합니다. </li><li> 바늘 압력이 0.3-0.8 PSI에 설정되어야합니다. 적용 정압은 굴지 솔루션의 지속적인 흐름이 발생합니다. </li><li> 팁이 핵 (perinuclear 지역 핵은 바로 아래에 있지 않은 세포의 두꺼운 부분) 옆에되도록 주입하는 세포 결정 후 바늘을 위치. </li><li> 천천히 낮은, 그리고 바늘 끝이 막을 관통 때까지 팁을 지금, 점차적으로 낮은 멤브레인을 누르 때까지 바늘의 위치를​​ 재조정. 바늘이 완전히 막을 피어싱이있다면 당신이 더 이상 세포를 감동하지 않습니다 때까지이 차이점은 바늘을 올려 볼 수 있듯이, 세포는 곧 밝은 나타납니다. 실제 천공 및 주입 과정은 0.5-2 초 걸립니다. </li><li> 너무 많이 주입은 세포의 가장자리에 신속하게 철회가 발생합니다 반면, 제대로하면, 세포 모양이 변하지 나타나며 어떤 경우에는 당신은 실제로 세포 폭발 볼 수 있습니다. </li><li> (밝게하지 않음) microinjecting 때 세포의 변화를 볼 수 없다면, 바늘 끝이 닫혀있을 수 있습니다. 당신은 &#39;청소&#39;버튼을 귀하의 transjector에서 사용할 수있는 경우를 눌러이 테스트할 수 있습니다. 열려면, 이것은 크게 eyepieces을 통해 볼 수있는 일정한 압력의 흐름을 증가 - 파문 주변 부스러기가 분산 볼 수로 나타납니다. </li><li> 바늘 끝이 닫혀있다면, 따라서 팁의 끝부분의 원인, 새로운 microinjection 바늘이나 부드럽게 유리 coverslip에 대한 바늘 프레스 끝까지 바늘을 낮추는 방법으로 바늘의 팁을 깰 시도를 삽입하도록 선택할 수 있습니다 휴식 있습니다. 파손 영역은 바늘 지점 (A 지점으로 수렴 시작 바늘의 부분)의 면적의 1 / 5 일보다 더 이상이어야합니다. </li><li> 각 microinjection 세션 (세포 유형에 따라 달라집니다) 45 분 - 20 자 이하를 지출, 주사를 계속합니다. 일반적으로, 짧은 세션은 세포에 스트레스를 최소화하기 위해 권장합니다. </li><li> microinjection을 마치신 후, 신선한 prewarmed 미디어를 추가하여 접시에있는 세포 미디어를 변경합니다. 그렇다면 세포 이미징 전에 인큐베이터에서 30 분 동안 복구할 수 있습니다. 굴지는 기존의 cytoskeleton 네트워크에 통합할 수 있도록이 또한 수 있습니다. </li></ol> 섹션 3 : 이미징 회의소 조립 자료가 필요합니다 : coverglass, 이중 양면 테이프, Q - 팁, 포셉, valap, 김, oxyrase, 영상 미디어, 면도기 칼날, p200 파이를 닦아pette, 순수 에탄올 <ol><li> 영상 미디어를 prewarming 및 Oxyrase의 15 UL 나누어지는를 해동하여 시작합니다. 빛과 감광성의 oxyrase를 보호해야합니다. oxyrase의 또한 크게 photobleaching의 영향을 줄일 수 있습니다. </li><li> 낮은 핫 플레이트 온도를 설정하여, valap을 Prewarm. 그것이 밀봉 재로서의 효능을 잃게됩니다위한 valap를 과열 / 레코딩하지 마십시오. </li><li> 작은 부스러기를 청소하고 제거하는 순수한 에탄올과 함께 묻은 거 같아요 kimwipe와 coverglass을 닦아주십시오. </li><li> 플랫폼으로 깨끗한 평면을 사용하여 서로의 상단에 양면 테이프 두 동일한 크기의 길이를 (2.5 cm 길이), 스택. 완전히 평면 비행기를 만들 수있는 갇힌 공기 방울을 누르십시오. </li><li> 면도날을 사용하여, 각 스트립은 폭 0.5 cm를 측정하므로, 긴 축을 따라 2 명이나 스트립 잘라. </li><li> 포셉를 사용하여 테이프의 두 스트립이 coverglass의 중심에있는 격차를 만들어 있도록 coverglass의 긴 가장자리에 대해 각각의 스트립을 놓으십시오. 유리로 좋은 도장을 확인하기 위해 테이프에 부드럽게 누르십시오. 테이프의 스트립은 coverglass과 coverslip 사이에 스페이서 역할을합니다. </li><li> 당신이 다음 단계를 시작하기 전에 valap 완전히 액화 있는지 확인하십시오. </li><li> 미디어의 모든 500 UL에 oxyrase 15 UL을 추가하여 prewarmed 영상 미디어를 검색합니다. </li><li> 삼각형으로 접어 kimwipes 3 하드 가장자리를 만들 수 있습니다. 이것은에 붙어 테이프 건조 표면을 만드는 데 사용됩니다. </li><li> 인큐베이터에서 세포를 검색할 수 있습니다. 포셉 사용하여 coverslip의 모서리를 잡아. 빠르게 kimwipe에 coverslip (셀 사이드의 조직을 감동하지 최대 직면입니다) 장소, (당신의 세포의 나머지 표면에) 세미 드라이 표면을 만들 coverslip 두 반대 측면을 닦아 접힌 kimwipe을 사용합니다. </li><li> 포셉를 사용하여 건조 표면이 테이프의 두 스트립으로 정렬되도록 코너에게 coverslip를 잡아와 coverglass에 놓으십시오. 두 개의 닫힌 측면 두 열 가늘고 길게 찢어진 곳을 가지고 지금 확인할 수 있습니다. 가까운 오프닝에 영상 미디어 - oxyrase 솔루션 천천히 피펫 200 UL. 중요한 것은, 기포가 도입되지 않을 것입니다. 솔루션은 따라서 완전히 솔루션에서 세포를 immersing, 모세관 힘에 의해 새로 조립 챔버 속에 빨려해야합니다. </li><li> Q - 팁 소량 빠르게 접사에 녹아 valap하여 coverslip의 네 모퉁이를 사용하여 coverslip을 안정. 당신이 알게 될 그 즉시 valap 증발 (실온에서 초 이내). </li><li> 이제 오픈 측면 (비 테이프 쪽)으로 시작, Q - 팁을 사용하고 솔질 뇌졸중을 흉내낸하여 valap의 얇은 스트립이 있었 으니까요. 닫힌 측면에 대해 반복합니다. 천천히 따라서 코팅 단계를 반복하여 도장을 강화, valap의 겉옷을 구성할 수있었습니다. valap는 coverslip의 중심은 분명두고, 가장자리에 감금하셔야합니다. </li><li> 세포를 부셔하지 염두하고, 잔여 미디어를 제거하는 ddH2O과 Q - 팁을 사용하여 coverslip의 중심 부분을 부드럽게 닦아주십시오. 순수 에탄올로 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 이제 이미지를 작은 반점에 최적화된 완전히 둘러싸인 이미징 챔버를해야합니다. 완전히 밀폐된 인클로저를 갖는 것은 빠르게 photobleaching에서 fluorophores 수 없게됩니다. </li></ol> 섹션 4 : 이미징 세포 자료가 필요합니다 : 거꾸로 위드 현미경, mecury 램프, 적절한 필터는 6.7 마이크론 픽셀, 높은 수치 개구, 오일 침지 계획 - Apochromatic 목표 (60X 100X하는 단계 또는 DIC)와 CCD 카메라를 냉각. 진동 테이블. 이미징 소프트웨어. <ol><li> 37도로 현미경의 무대를 Prewarm. 새로 완성된 이미지 챔버를 삽입하고, 이미지 이전 안정화 온도 10~15분을 기다립니다. </li><li> 브라이트 - 입력란에 세포를 집중하여 시작한 다음 올바른 형광 설정을 토글하여 주입 세포를 찾으십시오. photobleaching 줄이기 위해 형광 노출 시간을 최소화하기 위해보십시오. </li><li> 건강 곡선 최고의 가장자리를 주입 세포를 찾습니다. 오버 주입 전지 (셀 폭발) 수많은 filopodia를 닮은, 철회와 들쭉날쭉한 가장자리 특징으로한다 - 이미징이 세포를 피하십시오. </li><li> 인수 설정은 셀 유형, 레이블 굴지의 품질과 현미경 구성 요소에 따라 달라집니다. 그러나, 노출 설정이 이초보다 커야하지 말아야하고, 프레임 사이의 시간 간격은 5 10 초 사이로 설정해야합니다. 시계열에 대한 일반적인 길이 (몇 군데 세포 당) 어디 10~30분마다 다를 수 있으며, photobleaching 효과에 의해 제한됩니다. 카메라 게인 설정은 노이즈 신호를 증가까지 설정할 수 있습니다. </li><li> 이상이 특성은 다음 인근은 작은 반점으로 직경이 작은 반점 각각 ~ 2 간격 작은 반점 있어야 작은 반점을 찍다. 이것은 굴지 구조의 최적의 공간 및 시간적 샘플링을 보증합니다. 상피 세포의 경우 스페클드 굴지의 네트워크는 균일하게 떨어져 확산 speckles와 균일한 나타납니다. 조밀한 스트레스 섬유 또는 lamellipodia 기능 셀 라인구별되지만, 점선 / 스페클드 모양 것입니다. 노출 설정은 최고의 스페클드 이미지를 조정해야합니다. </li><li> 오버 microinjected 전지는 이산으로 나타나지 않는 밀도 포장 speckles을 것입니다. 스트레스 섬유와 lamellipodia은 점선 모양을 잃게됩니다. </li><li> 아래 - microinjected 세포가 멀리 떨어져 (&gt; 10 speckles 간격)와 무작위로 흩어져 나타나는 speckles을 포함, 접안 렌즈를 통해 매우 희미 나타납니다. 이러한 세포의 스트레스 섬유 lamellipodia는 구별할 수있을 것입니다. </li><li> &#39;좋은&#39;을 구하기 위해 주요 영화에 초점을 유지합니다 작은 반점을 찍다. 이것은 흐름과 매출 측정 작은 반점 관련된 사후 분석을 위해 특히 중요합니다. 따라서 정량 분석​​의 품질은 시간 경과 기간에 대한 초점 잠금에 따라 달라집니다. 이미지 비행기가 매우 얇은 경우 이것은 특히 도전하실 수 있습니다. 다른 요인은 특히 현미경 시스템의 안정성, 무대 주택 및 이미징 챔버에 따라 달라집니다. 이미지 간격 길이이 기능을 수용할 수 있도록 충분한있다면 대비 기반 초점을 사용할 수 있습니다. 다른 옵션은 안정적인 실시간 초점 조정을 제공하는 가까운 적외선 기반의 초점 시스템을 구입 있습니다. 당신은 니콘, 올림푸스와 ASI에서 이러한 제품을 찾을 수 있습니다. </li></ol> 섹션 5 : qFSM 분석 이 부분은 자세히 설명하지 않습니다,하지만 분석 소프트웨어에 대한 정보는 여기 [5]에서 찾을 수 있습니다. 소프트웨어 다운로드 요청은 홈페이지 (lccb.scripps.edu)에 만들 수 있습니다. 다루는 주제 : <ul><li> 노이즈 보정 </li><li> 감지 스페클 </li><li> 의 거친 움직임의 이미지 상관 관계 기반 추적의 하이브리드 접근 방식을 사용하여 추적하는 것은 지역과 개인 speckles의 세부 운동의 단일 입자 추적을 작은 반점을 찍다. </li><li> 동안 강도 변동의 폴리머 조립 및 분해 속도의 계산은 외관 및 실종 사건을 작은 반점을 찍다. </li></ul>

<ol>
	<li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+speckle+microscopy+(FSM)+of+microtubules+and+actin+in+living+cells.">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li><li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells.">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li><li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow.">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li><li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells.">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li><li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics.">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

성공적으로 이미지를 작은 반점 얻기위한 몇 가지 주요 요소가 중요한, 그러나 좋은 speckles 시작하고 찬란 레이블 굴지의 품질과 끝. 레이블이 붙은 단백질 자체가 용해 및 집계 무료되어야하는 동안 0.7-0.4 주위 설정 굴지 단량체에 염료의 높은 상표 비율은 speckles가 밝고 개별 나타납니다되도록합니다. 마찬가지로 중요한 microinjection 절차입니다. (과 생존) 정상 세포 항상성을 보장하기 위해, 전지...

사출 버퍼 (IB) 50 MM 칼륨의 글루 탐 산염 0.5 M MgCl2 (부록 2A) -20 ° C에서 2 년 최대 쇼핑몰 &nbsp; G - 버퍼 이 MM 트리스 ⋅ Club 호텔, 산도 8.0 (부록 2A) 0.2 MM CaCl2 (부록 2A) 바로 사용하기 전에 추가 : 0.2 MM ATP (100 MM을위한 요리법을 참조) 2 - 메르 캅 토 에탄올 0.5 MM 4 일일까지 저장 ° C

live cell imaging of f-actin dynamics via fluorescent speckle microscopy (fsm)

이 프로토콜에서는 형광등의 사용이 PtK1 셀에 굴지 역학 고해상도 이미지를 캡처하는 현미경 (FSM)을 스페클 설명합니다. FSM의 독특한 장점은 살아있는 세포 내에서 F - 굴지 네트워크의 움직임과 매출의 속도론 (조립 / 해체)을 캡처하는 능력입니다. 이 기술은 컴퓨터 비전 소프트웨어 (qFSM)와 결합하여 F - 굴지 역학의 양적 측정을 파생에 특히 유용합니다. 우리는 선택, microinjection 및 생활 세포에 형광 프로브 굴지의 시각화를 설명합니다. 중요한 것은, 유사한 절차는 다른 macomolecular 어셈블리를 시각화하기 위해 적용됩니다. FSM은 microtubules, 중급 필라멘트 및 부착 단지에 대한 증명되었습니다.

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Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

의 선택, microinjection, 그리고 영상은 형광을 통해 F - 굴지 찬란 - 라벨 (FSM) 현미경을 작은 반점을 찍다.

형광등을 통해 F - 굴지 역학 라이브 셀 이미징은 현미경을 스페클 (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

15.8K 조회수.  Scripps Institute. 의 선택, microinjection, 그리고 영상은 형광을 통해 F - 굴지 찬란 - 라벨 (FSM) 현미경을 작은 반점을 찍다.

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Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

연구

생물학

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

조립, 로딩 및 분석 초원 심 분리기 샘플 셀 정렬

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

COS - 7 형광 라벨링는 라이브 셀 이미징에 대한 SNAP - 태그 퓨전 단백질 표현

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면 역학의 실시간 영상

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

입체 슈퍼의 간섭 광 활성화 현지화 현미경으로 F-액틴 필라멘트의 해상도 현미경 (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, misunderstood, or misinterpreted by the fixed-cell analysis. While the fixed cell imaging and analysis is robust and sufficient to observe cellular steady-state, it can be limited in defining a temporal order of events at the cellular level and is ill-equipped to assess the transient nature of dynamic processes including mitotic progression. In contrast, live cell imaging is an eloquent tool that can be used to observe cellular processes at the single-cell level over time and has the capacity to capture the dynamics of processes that would otherwise be poorly represented in fixed cell imaging. Here we describe an approach to generate cells carrying fluorescently labeled markers of chromatin and microtubules and their use in live cell imaging approaches to monitor metaphase chromosome alignment and mitotic exit. We describe imaging-based techniques to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression, including the identification of cells at various stages in mitosis, identification&#160;and tracking of mitotic defects, and analysis of spindle dynamics and mitotic cell fate following the treatment with mitotic inhibitors.

Here we present a protocol to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression. Our application of time-lapse imaging enables the user to identify cells at various stages of mitosis, track and identify mitotic defects, and analyze spindle dynamics and mitotic cell fate upon exposure to anti-mitotic drugs.

미토틱 스핀들 교란에 따른 메타페이즈 타이밍 및 세포 운명의 역학을 평가하기 위한 라이브 셀 이미징

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...