D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada's Discovery Grant program.

참고 : 영상의 전날 1, 2 포획 장소 스테이지; 모든 미디어 및 보충 전이나 영상의 날이 평형을에 사용할 수 있도록. 평형은 5 % CO 2로 설정 배양기에서 37 ° C 미디어와 보충 온난화을 통해 달성된다. 모든 세포 배양 작업과 커버 슬립 도금 단계 층류 후드 하에서 무균 조건에서 일어난다. 1. 세포 형질 <ol><li> 형질 T 세포는 플라스미드 형광 융합 F 액틴 GFP 표지 및 이미징 구성 인코딩 실험 전 24 시간을 묘화한다. 참고 : 세포가 이전에 형질 전환 (이전 영상에 48 시간) 세포가 최적의 건강에 자신의 대수 성장 단계에 있는지 확인하기 위해 24 시간을 분할해야한다. <ol><li> 평형 인큐베이터로 6 웰 플레이트의 단일 잘 RPMI 보충의 5 ㎖ (RPMI 1640 플러스 10 % FBS와 1 % 펜 연쇄상 구균 (옵션)) 놓습니다. </li><li> 2 × 10 7 T 세포 숭배 펠렛5 분 동안 327 XG에서 원심 분리 튜브를 사용하여 보충 RPMI에서 37 ° C 5%의 CO 2에서와 ured는 예열 일렉트로 매체의 동일 부피로 세척 하였다. 주 : 일렉트로 매체 버퍼와 보조제 (소모품 참조)를 함유하는 감소 된 혈청 배지이다. </li><li> 5 분 동안 327 XG에서 다시 펠렛 후, 전기 미디어의 500 μL의 세포를 재현 탁 천천히, 큐벳에 추가 라벨 F - 굴지에 대한 PCR 학년 DH 2 O에서 플라스미드의 5 μg의를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 전기 아크가 발생할 수 있습니다 미디어 내에서 고르게 세포를 배포하는 매체의 기포의 제거를 보장하기 위해 후드 작업 공간에 큐벳을 누릅니다. </li><li> 290 Ω에 전기 장치 및 설정 전압 300 V 및 용량의 전원을 켭니다. 20 밀리 초에 대한 지수 부패를 사용 Electroporate 샘플. 참고 : 최적화가 다른 세포와 다른 플라스미드 구조 필요할 수 있습니다. </li><li> 형질 감염 프로토콜되면계속하기 전에 1 분 동안 얼음에 완료, 저장 세포. </li><li> 신중 단계 1.1.1에서 평형화 RPMI 보충 5 ㎖를 함유하는 6- 웰 플레이트에 세포를 큐벳에서 전송. </li><li> 37 ° C ~ + 5 % CO 2의 세포 O / N을 품어. </li></ol></li></ol> 2. 코트 커버 슬립과 사전 따뜻한 영상 보충 <ol><li> 항체 코팅 된 커버는 T 세포의 자극을 유도한다. <ol><li> 코트 200 μL PBS에 1 μg의 / ㎖ αCD3 및 αCD28와 8 잘 커버 슬립의 각 실. </li><li> 4 ° CO / N 스토어. 대안 적으로, 2 시간 이미징 이전과 코팅 된 커버는 커버 슬립에 대한 온도 변화를 최소화하여 촬상 과정 드리프트를 감소시키기 위해 37 ℃ 배양기에서 유지. </li></ol></li><li> 0.1 μm의 서브 회절 형광 마이크로 스피어와 coverslip에 테스트 샘플을 만듭니다. <ol><li> 구슬의 소용돌이 원액 덩어리를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 일의 새로운, 깨끗한 커버 슬립에(제조업체의 지침에 따라) 표면에 단계 2.1.1에서 사용되는, 피펫 5 μL 형광 마이크로 스피어 원액으로 전자 같은 유형입니다. </li><li> 피펫 팁과 커버 슬립을 통해 마이크로 스피어 솔루션을 확산. </li><li> 다음, 건조 등의 PBS와 같은 매체를 장착 200 μl를 적용 할 수 있습니다. 참고 : 설치 매체는 이미징 세포 샘플에 사용되는 일치해야합니다. </li></ol></li><li> HBSS를 평형 37 ° C ~ + 5 % CO 2에서 할 사전 따뜻한 O / N 인큐베이터에 배치하여 원심 분리기 튜브 (이하 &#39;HBSS 보충&#39;라고 + 20 mM의 HEPES). 주 : HEPES의 첨가가이 보충 이동 CO 2 입력으로 배양 챔버를 사용하는 경우, CO 2 버퍼이다. </li></ol> 3. 현미경 셋업 <ol><li> 완전히 가열 요소의 기초를 충당하기 위해 현미경의 저수지에서 TIRF-SIM 현미경과 장소 충분히 증류수 무대 정상 인큐베이터를 켭니다. 물이 전자 허용37 ℃로 quilibrate. 또한 37 ° C로 설정 대물 렌즈로 가열 칼라를 추가합니다. 참고 : 셋업의 감도로, 다음 단계는 그래서 전날 밤을 완료 인해 광학 부품은 안정적인 온도에서 촬영에 앞서 있습니다. </li><li> 현미경의 빛 경로에 TIRF 488 호환 격자 블록을 놓고 제자리에 고정합니다. <ol><li> TIRF-SIM 모드에 대한 올바른 광 경로를 참여하는 각각의 레이저 침대와 현미경 무대에 &#39;싱글&#39;위치로 채널 모드와 광섬유 케이블을 전환합니다. 참고 :이 단계를 건너 뛰는 것은 소프트웨어 창에서 오류 (그림 1A)로 이어질 것입니다. </li></ol></li><li> 모든 현미경과 컴퓨터 구성 요소의 전원을 켜고 수집 제어 소프트웨어를 엽니 다. <ol><li> OC 패널을 열고, 티 패드, N-SIM 패드와 ND 획득 창 (그림 1B). &#39;OC 패널&#39;에서 &#39;옵션 TIRF 488&#39;(그림 2B, 노란색 화살표)을 선택합니다. </li&gt; <li> N-SIM 패드 창에서 &#39;TIRF-SIM&#39;와 &#39;이동&#39;설정 (그림 2C, 노란색 화살표)을 선택합니다. 설정 버튼 (그림 1C, 노란색 상자)을 선택하고 드롭 다운 메뉴에서, 히트 &#39;488 (100 배 TIRF 488nm의 경우) TIRF는&#39; &#39;확인&#39; &#39;적용&#39;을 선택합니다. </li><li> 프레임 속도 50 밀리 초, 판독 모드, EM 게인 14 비트에서 3 MHz의 1의 변환 이득과 EM 게인 승수 (300) (그림 1C, 녹색 상자)에 &#39;DU897 설정&#39;에서 카메라 설정을 설정합니다. 참고 : 프레임 속도 고려 사항 대표 결과를 참조하십시오. </li><li> &#39;N-SIM 패드&#39;에 100 배 1.49 NA CFI 고차 색지움 TIRF 목표를 선택하여 TIRF-SIM에 대한 현미경의 조명을 보정 10 % 488 nm의 레이저 전원을 켭니다. 참고로 이미지의 픽셀 크기는 볼 (512) X 512 픽셀 필드에, 60 ㎚이다. </li><li> 먼지와 기름을 제거하기 위해 렌즈 용 티슈를 사용하여 대물 렌즈를 청소합니다. </li></ol></li&gt; <li> TIRF-SIM 초점면을 찾아보십시오. <ol><li> 가장 낮은 Z 평면의 목적으로 시작합니다. 목적에 렌즈 오일 한 방울을 놓고 현미경 단계 단계 2.2에서 형광 마이크로 스피어 샘플을 추가합니다. </li><li> 현미경의 몸에있는 완벽한 초점 시스템 (PFS) 기능을 선택합니다. </li><li> PFS 버튼에 도달 초점면을 확인하기 위해 깜박 멈출 때까지 천천히 Z 평면을 통해 목표를 위로 이동합니다. </li><li> 제어 소프트웨어 및 이미지 PFS 마이크로 조작 휠을 사용하여 만든 최종 조정에 대한 미세에 &#39;라이브&#39;보기로 전환. </li></ol></li><li> 75 nm의 소산 파 위없는 아웃 - 오브 - 초점 형광 방출과 균일 한 조명을 준수하십시오. 참고 : 구조화 된 조명은 형광 마이크로 스피어 샘플에서 변동 조명 패턴을 관찰하여 충족 확인합니다. </li><li> 형광 마이크로 스피어 샘플을 측정하고 개선 이미징 resolut을 정량화강도 프로파일의 반가 폭 (FWHM)을 관찰함으로써 이온. <ol><li> 설치 NIS-N-SIM 분석 모듈, 분석 소프트웨어 (v4.20.01)을 열고 &#39;응용 프로그램&#39;을 선택 -&gt; &#39;쇼 N-SIM 창&#39;. </li><li> TIRF-SIM 데이터 셋 (도 2)에 대해 1로 설정된 조명 변조 콘트라스트 (IMC)와 높은 해상도의 잡음 억제 (HRNS)로, (30)의 화소 크기 024 X 024 픽셀의 복원 영상을 생성하는 마이크로 스피어의 샘플 이미지를 재구성 나노. </li><li> 1 픽셀 (도 3A, 노란 박스)의 폭을 갖는 라인 프로파일 도구를 사용하여 하나의 마이크로 스피어의 중심을 통해 선을 그린다. </li><li> FWHM 버튼 (그림 3B, 노란색 상자)을 선택하고 그 세기 최소치 다음에 가우스 분포의 강도 맥시을 클릭합니다. </li><li> 마이크로 스피어의 FWHM이 100 nm 인 (도 3c)의 범위 인 것을 확인. 주 : 해상도가 ACH를ieved 촬상 생물학적 시료는 표지 효율 및 백그라운드 형광으로부터 신호 대 잡음비에 따라 달라질 것이다. </li></ol></li></ol> 이미징 4. 샘플 준비 <ol><li> coverslip에 준비. <ol><li> 냉장고 또는 인큐베이터에서 2.1 단계에서 αCD 코팅 커버 슬립을 검색하고 각 우물에서 PBS 포함 αCD3과 αCD28를 제거합니다. </li><li> 커버 슬립의 각 웰에 단계 2.3에서 미리 예열 HBSS 보충 200 μl를 추가합니다. 씻고 최소한의 αCD3 보장하기 위해 제거하고 αCD28 용액에 남아 있습니다. coverslip에 우물에 HBSS 보충의 또 다른 200 μl를 추가합니다. </li><li> 석유와 미립자를 제거하기 위해 렌즈 티슈 커버 슬립의 밑바닥을 청소합니다. </li></ol></li><li> 단계 3.4에서 볼 수있는 현미경 단계에 위치 커버 슬립과는 PFS의 Z 평면을 사용하여 커버 슬립의 TIRF 초점면을 찾을 수 있습니다. </li><li> 셀 준비. <ol><li> 미디어 콘의 200 μl를 피펫마이크로 원심 분리기 튜브에 단계 1.1.8에서 형질 전환 된 세포를 이닝. </li><li> 20 초 동안 268 XG에 마이크로 원심 분리기에서 펠렛의 세포와 세포 용지를 제거합니다. </li><li> 200 μL에 재현 탁 세포 단계 2.3에서 HBSS 보충을 따뜻하게가 미리. </li></ol></li></ol> 5. 이미징 세포 <ol><li> 현미경으로 세포 함유 HBSS 보충을 가지고 부드럽게 우물 중 하나에 200 μl를 피펫. </li><li> (PFS 모드)로 커버 슬립 TIRF 초점면에 잔류하는 동안, 커버 슬립 접근 형광 세포를 추적하기 위해 현미경 및 접안 렌즈 표면 형광 조명을 사용한다. </li><li> 세포는 커버 슬립에 도착하면, 모니터 상에 화상을 불러 온 세포는 컴퓨터 화면에 포커스가 확인 N-SIM 패드 &#39;라이브&#39;모드로 전환. </li><li> 클릭 ND 취득 창을 열고 &#39;시간&#39;탭을 선택, 시간 과정을 기록 없음 지연, &#39;시간&#39;에 &#39;추가&#39;와 &#39;간격&#39;설정10 분, 1로 설정되어있는 &#39;루프&#39;. 주 : 기간 관심 과정에 따라 변경 될 수있다; &#39;지연&#39;캡처 할 때 STICS 소프트웨어는 ≈10 프레임의 이미지 스택과 함께 정량적 인 결과를 추출 할 수 있습니다. </li><li> 비드 샘플과 동일한 인수 설정으로, ND 취득 창에서 &#39;지금 실행&#39;을 선택하여 데이터 기록을 시작합니다. </li></ol> 6. 재구성 SIM 이미지 <ol><li> 이미지가 완료되면, 설치 NIS-N-SIM 분석 모듈, 분석 소프트웨어 (v4.20.01)를 열고 &#39;응용 프로그램&#39;을 선택 -&gt; &#39;쇼 N-SIM 창&#39;. </li><li> TIRF-SIM 데이터 세트 1로 설정된 조명 변조 콘트라스트 (IMC)와 높은 해상도의 잡음 억제 (HRNS) (도 2)와, 하나 (또는 배치 툴하여 여러) 재구성 된 SIM 이미지를 생성하기 위하여 원시 SIM 파일을 재구성. </li><li> 재구성 된 파일을 확인하는 것은 표시된 30nm의 픽셀 크기를 갖는다이미지 상태 표시 줄. 주 : 화소 크기가 STICS 분석에 영향을 미치지 않는다하지만 화소 간의 공간적 상관 관계를 보장하기 위해 PSF 차원 공간 분해능보다 적어도 2 배 작아야한다. </li><li> STICS 분석을위한 준비 .TIFF 파일로 데이터를 내 보냅니다. </li></ol> 7. STICS 분석 <ol><li> (; 보충 정보로 사용할 수 와이즈만 연구소) 다운로드 및 STIC (C)를 추출은 matlab에 소프트웨어 패키지를 S. 스크립트 stics_vectormapping.m는 단일 채널 STICS 분석의 핵심이며, 코드의 처음 30 라인들은 매뉴얼의 섹션 2.1에 정의 된 입력 매개 변수를 정의하기 위해 사용된다. 이 스크립트를 열고 TIRF-SIM 데이터 분석에 대한 입력 매개 변수를 정의합니다. 매뉴얼의 부록에 설명 된대로 그것은 또한 로컬 시스템의 MATLAB 경로에 하위 폴더와 STIC (C) S 폴더를 추가하는 것이 좋습니다. <ol><li> 코드의 해당 라인을 편집하여 데이터 분석을위한 입력 매개 변수를 정의 </li><li> 아나을 수행하려면TIRF-SIM 데이터의 용해는, 1 벡터 맵을 생성 벡터 맵의 시계열을 얻기 위해 프레임의 최대 수와 (1)에 라인 (32)의 시간적 변화에 라인 (31)에 시간적 부분 영역에 시간 매개 변수를 설정하기 위해 이들 파라미터를 변화 . </li><li> 부동 제거 필터의 경우, 21 &#39;MoveAverage&#39;매개 변수 (라인 24) 평균 이동 &#39;과 설정에 매개 변수&#39;필터링 &#39;(라인 23)을 설정합니다. 주 : 분석되고 프레임으로부터 일련의 프레임을 감산에 기초로이 설정은, 느린 이동 및 큰 형광 신호에 대해 작동하는 것으로 나타났다. </li><li> 라인 33-38 변화는 출력 파일과 출력 벡터 맵 타이틀 이름뿐만 아니라 출력 디렉터리 경로를 설정하고 벡터지도 이미지가 저장되어야 하는지를 정의하는 형식. </li></ol></li></ol><table><tbody><tr><td> 픽셀 크기 (μm의) </td><td> 0.03 μm의 </td><td> 선 (19) </td></tr><tr><td> 프레임 속도 (초) </td><td> 1 초 </td><td> 선 (20) </td></tr><tr><td> 최대 지연 시간 (프레임) </td><td> 20 프레임 </td><td> 선 (21) </td></tr><tr><td> 아구 크기 (픽셀) </td><td> 8 픽셀 </td><td> 선 (29) </td></tr><tr><td> 아구 간격 (픽셀) </td><td> 1 픽셀 </td><td> 선 (30) </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> matlab에 편집기 창에 스크립트 run1ChannelSTICS를 엽니 다. 라인이 스크립트의 1-23를 실행하여 이미지 시리즈를로드합니다. 주 :이 스크립트는로드 전처리 이미지 시리즈, 벡터지도 및 속도 히스토그램 플롯 많은 파일을 일괄 처리를 실행하는 데 사용될 수있다. 필요한 경우,이 스크립트의 라인 24 ~ 26을 사용하여 관심 영역에 이미지를 자릅니다. <ol><li> 실행 라인 run1ChannelSTICS의 29 ~ 35은 STICS 분석을 시작합니다. 메시지가 표시되면, 원하는 경우, 관심 (ROI)의 특정 영역을 표시하기 위해 다각형을 선택합니다. 경계 유물이 발생할 STICS이 다시 분석하면 투자 수익 (ROI)은, 셀 가장자리와 중복되지 않는지 확인gions. </li><li> 실행 라인 38-52은 벡터지도를 표시합니다. 속도 크기 히스토그램을 플롯하려면 라인 53-72을 실행합니다. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

이 기술은 이미지에 대한 연구를 허용하고 형광을 발현하는 세포에서 이전에 확인할 수없는 정보를 정량화한다. 본 연구 결과에서는 F-T는 액틴 세포는 IS에 셀 중심쪽으로 셀 주변에서 대칭으로 흐르는 것을 보여준다. 이러한 결과는 1D 라인 프로파일 kymograph 데이터 (13)로부터 이전의 결과와 일치하며, 2D 및 초 - 해상도 데이터의 분석 능력을 확장한다. 제시된 기술은...

실험의 목적은 이미지이며 면역 시냅스 (IS)을 형성하는 동안 흐름의 방향 및 크기를 설정하기 위해 회절 한계를 넘어, T 세포를 거주 filamentous- (F-) 액틴의 분자 유동을 특성화. 이 기술은 안티 CD3- 및 항 CD28 항체로 코팅 된 커버 활성화에 인공 시냅스 형성는 Jurkat T 세포를 이미징, 전반사 형광 (TIRF) 모드에서 구조화 된 조명 현미경 (SIM)을 사용하여 수행 될 것이다. T 세포와 표적 사이의 IS 형태; T 세포 수용체 (TCR) 활성화에 따라 1,2- 항원 제시 세포 (APC). 이 적응성 면역계는 감염에 대한 면역 반응을 생성할지 여부를 결정하는 첫 번째 단계이기 때문에, 자극에 대한 부정확 한 응답의 결과는 질환을 유발할 수있다. APC T 세포 상호 작용의 중요성은 잘 기록되어있다, 그러나, 성숙한의 역할 (들)의 초기 TCR SI 이후gnal 국제화는 아직 완전히 이해되어야한다. 골격은 단계를 해명 할 시간적 TCR 활성화 (세포막에서 분자의 운동과 3,4- 골격 액틴에 의존 신호 분자의 제어), 세포 골격이 공간적으로 재 배열 방식을 이해 연결된 두 프로세스를 원조하고 생각된다로서 시냅스 형성 동안 분자 구조 조정의. F - 굴지의 역행 흐름이 면역 시냅스의 중심을 향해 TCR 클러스터를 가축 위해 생각하고,이 전위는 신호 정지 및 재활용에 매우 중요 할 것으로 생각된다; T 세포 활성화 (5)의 미세한 균형을 은닉. 표준 형광 현미경이 세포 - 세포 상호 작용을 비롯한 다양한 생물학적 이벤트에 대한 통찰력을 제공하고 유연한 도구이지만, 그것은 정확하게 diffr보다 가까운 상주 여러 형광체를 해결하는 시스템의 능력에 의해 제한된다서로의 활동 제한 (≈200 ㎚). 세포 내에서 많은 분자 이벤트 분자의 밀도가 인구를 포함하고 정지 또는 특정 자극에 하나 동적 재 배열을 나타내는 바와 같이, 기존의 광학 현미경은 전체 그림을 제공하지 않습니다. 초 해상도 영상의 사용은 연구자들이 다양한 기술을 이용하여 회절 한계를 회피 할 수있다. 손바닥과 폭풍 6,7가 약 20 nm의 정밀도로 분자의 위치를 해결할 수있는 능력을 가지고 단일 분자 현지화 현미경 (SMLM)와 같은, 그러나, 이러한 기술은 많은 프레임을 통해 이미지를 구축, 긴 획득 시간에 의존 . 일반적으로이 고정되는 샘플을 요구 또는 구조가 낮은 이동성을 전시하기 때문에 하나의 형광체는 여러 개의 점으로 잘못 해석되지 않습니다. 유도 방출 고갈 (STED)는 촬상 매우 선택적 촛점 여진 8, 필요한 주사를 통해 초 해상도를 허용하면서접근 방식은 뷰의 전체 세포 분야에 걸쳐 속도가 느려질 수 있습니다. STED는 또한 공핍 빔의 전력의 증가로 더 높은 해상도에 대한 상당한 광독성을 보여준다. 구조화 된 조명 현미경 (SIM 9) 표준 형광 현미경의 해상도를 배가시킬 이러한 방법에 대한 대안을 제공하며, 현재의 기술보다 SMLM 생균 이미징에 더 잘 호환된다. 그것은보기의 전체 세포 분야에 대한 폭 넓은 필드 시스템에서 낮은 레이저 파워를 사용합니다; 수집 속도를 증가 및 표준 형광 라벨와 호환 제공한다. SIM의 와이드 필드 자연 또한 &lt;100 nm 인 축 방향 치수의 침투 깊이가 매우 선택적 음원 정보 전반사 형광 (TIRF)의 이용을 허용한다. 화상 상관 분광법 (ICS)의 형광 강도의 변동을 상관하는 방법이다. ICS의 진화; 시공간 메신저나이 상관 분광법 (STICS 10)는 시간과 공간의 세포 내 형광 신호의 상관 관계. 상관 함수를 통해 후행 프레임의 화소를 주변 화소로 강도를 상관시킴으로써, 정보 흐름의 속도 및 방향성에 대하여 얻어진다. 정적 오브젝트 STICS 분석을 방해하지 않도록하기 위해, 부동 오브젝트 필터는 픽셀 세기들의 이동 평균을 뺌으로써 작동되는, 구현된다. 여기에 제시된 기술은 생균 11 분자 흐름을 계량하는 수퍼 - 해상도 현미경 데이터에 적용되는 화상 상관 분광법 제 데모 것으로 여겨진다. 이 방법은 STICS 분석 12 통해 F 액틴 흐름의 회절 제한된 촬상에 향상시키고 광의 회절 한계를 넘어 공간 해상도에서 획득 된 데이터로부터, 생균의 이차원 분자 유동을 결정하고자하는 연구자 맞게 것이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="799">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Consumables:</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat E6.1 cells</td>
			<td>APCC</td>
			<td>ATTC TIB-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21875-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Strepromycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>&#160;Life Technologies</td>
			<td>14025-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">#1.5 8-well Labtek coverslips</td>
			<td>NUNC, Labtek</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LifeAct GFP construct</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>60101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OptiMem</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>51985-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD3</td>
			<td>Cambridge Bioscience</td>
			<td>317315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD28</td>
			<td>BD Bioscience / Insight Biotechnology</td>
			<td>555725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lens oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gene Pulsar Xcell System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-2660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cuvette (0.4cm)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge (5810R)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5805 000.327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge (Heraeus)</td>
			<td>Biofuge pico</td>
			<td>75003235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stage-top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INUH-TIZSH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon N-SIM microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon Analyse software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator (190D)</td>
			<td>LEEC</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cortical actin flow in t cells quantified by spatio-temporal image correlation spectroscopy of structured illumination microscopy data

필라멘트는 액틴과 운동성, 면역 세포, 면역 시냅스로 알려진 키 세포 - 세포 상호 작용의 형성을 포함한 세포 과정의 대부분에서 중요한 역할을한다. F 액틴 또한 서브 멤브레인 소포 역학 및 단백질 클러스터링 포함한 세포의 막에 분자량 분포를 조절하는 역할을하는 것으로 추측된다. 표준 광학 현미경 기술은 일반화 된 회절 제한 관찰 할 수 있도록하지만, 클러스터링 및 분자 류를 포함한 많은 세포 및 분자 이벤트는 지금까지 표준 광학 현미경의 분해능 아래 길이 규모의 인구 집단에서 발생합니다. 초 해상도 영상 법 구조화 조명 현미경 전반사 형광을 결합하여, T 세포의 면역 시냅스에서 F 액틴의 이차원 분자 흐름을 기록 하였다. 정량화 resul을 생성 시공간 이미지 상관 분광법 (STICS)을 적용 하였다,속도 히스토그램 및 흐름의 방향성과 크기를 나타내는 벡터지도의 형태로 TS. 이 프로토콜의 세부 서브 회절 레벨에서 유동 경로를 생성하는 초 - 해상도 이미징 STICS 기법의 조합을 설명한다. 이 기술은 시냅스 형성시 T 세포의 외주에 걸쳐 액틴 대칭 역행과 구심력 흐름을 확인하는데 사용 하였다.

현미경 설정 성공적으로 모두를 달성 한 후 단계를 연구하는 T 세포의 시냅스에서 F - 굴지의 흐름 달성 구조화 조명 (SIM) 영상을 (비디오 1) 시공간 이미지 상관 분광학 (그림 4 11)에 의해이 분자의 흐름을 정량화. 이미지를 촬영하기 전에 샘플 조명은 구 RAW 이미지에 걸쳐 균일 한 샘플에서 관찰되는 모아?...

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Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

cortical-actin-flow-t-cells-quantified-spatio-temporal-image

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.6K 조회수.  King's College London. To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy. 

비디오: Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

연구

면역학 및 감염병학

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; 높은</sup&gt; 면역 결핍 마우스에게 T 세포

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T 세포는 수지상 세포에서 Transinfection에 의해 박테리아를 캡처

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

유동 세포 계측법의 사용은 T 세포의 염색질의 상태를 평가하기 위해

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis allow the spatial localization and visualization of gangliosides involved in CD4+ T cell activation, that complement expression profiling experiments such as flow cytometry, western blotting or real-time PCR. The quantification of ganglioside expression through flow cytometry and their cellular localization through microscopy can be obtained by the use of anti-ganglioside antibodies with high affinity and specificity. Nonetheless, an adequate handling of cells in suspension involves the treatment of culture plates to promote the necessary adherence required for fluorescence or confocal microscopy acquisition. In this work, we describe a protocol for determining GD3 and GD2 ganglioside expression and colocalization with the TCR during na&#239;ve CD4+ T cell activation. Also, real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells are described for the determination of the GD3 and GM2/GD2 synthase genes, demonstrating that gene analysis experiments can be performed with a low number of cells and without the need of additional low input RNA kits.

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

We describe a standard antibody staining protocol for use in microscopy to determine the membrane expression and localization of gangliosides in resting and activated human na&#239;ve CD4+ T cells. Also described are real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells that do not require additional low input RNA kits.

CD4의 준비<sup&gt; +</sup&gt; 현미경으로 GD3 및 GD2 강글 리오 시드 멤브레인 식의 분석을위한 T 세포

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

형광 상관 분광학에 의해 측정 된 차 림프구의 플라즈마 막 분자 확산

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

인간의 자궁 경부 감마 델타 T 세포의 분리 및 유세포 분석

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

마비 및 비주얼 시스템 부상 Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4에 대 한 T 세포 관련 하 여 쥐에서의 유도

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...