이것은 형광실버 프로브를 사용하여 기존의 은 염색을 형광 실버 스테인딩으로 변환하는 새로운 젤 염색 방법입니다. 이 방법은 알데히드없이 간단하고 간단한 프로토콜을 사용하는 동안 기존의 실버 질산염 염색 및 SYPRO 루비 염색에 비해 향상된 성능을 보여 주었다. 절차를 시연하는 것은 알렉스 웡, 내 실험실에서 연구 조수가 될 것입니다.
이 절차를 시작하려면 증류수, LDS 버퍼 및 시료 감소제를 포함하는 용액으로 단백질 샘플을 희석시킵니다. MES 버퍼로 채워진 미니 젤 탱크를 설정하여 4-12 %의 비스 트리스 단백질 젤로 SDS-PAGE를 수행합니다. 준비된 단백질 샘플로 우물을 적재한 다음 30분 동안 200볼트의 일정한 전압으로 젤을 실행합니다.
전기 포근 후, 궤도 셰이커에 에탄올과 아세트산을 포함하는 100 밀리리터 용액에 젤을 잠급하고 50 rpm에서 흔들면서 실온에서 각각 30 분 동안 두 번 배양합니다. 다음으로, 깨끗한 용기에 초순수물로 젤을 3번 씻고 10분간 세척합니다. 먼저, 0.01 그램의 은 질산염을 초순수 10밀리리터에 녹여 0.1%의 농도로 스톡 용액을 100밀리리터의 초순수용수에 첨가하여 은질산염 작업 용액을 만듭니다.
연기 후드에 밀봉 유리 챔버에서 실버 질산염 작업 용액의 100 밀리리터에 젤을 잠급. 알루미늄 호일을 사용하여 함침 중에 빛으로부터 젤을 보호하고 궤도 셰이커에서 50 rpm에서 흔들면서 1 시간 동안 배양하십시오. 그 후, 깨끗한 용기에 초순수물로 젤을 두 번 씻고, 각 세척은 약 100밀리리터의 물을 사용하고 60초 간 지속됩니다.
초순수수를 사용하여 은색 함침 단계 후 젤을 청소하여 배경 염색을 최소화하는 것이 중요합니다. 먼저 TPE-4TA 염료 3밀리그램에 50밀리리터의 초순수를 넣습니다. 용액을 3분 동안 초음파처리하고 각 초음파 처리 세션 사이에 1-어금니 나트륨 수산화용액 5마이크로리터를 추가하여 염료를 최대 3배까지 용해시합니다.
그런 다음 365나노미터 UV 램프 아래에서 용액의 형광을 확인하여 염료가 완전히 용해되었는지 확인합니다. 약한 또는 비면제 솔루션만이 완전한 용해를 나타냅니다. 불소 개발 솔루션을 준비하려면 TPE-4TA 스톡 솔루션 10밀리리터를 90밀리리터의 초순수에 추가합니다.
pH 미터를 사용하여 솔루션의 pH를 확인합니다. pH가 범위를 벗어난 경우 희석된 수산화 나트륨 용액 또는 아세트산을 사용하여 7에서 9 사이의 pH에 용액을 조정합니다. 다음으로 젤을 불소 발전 용액의 100 밀리리터로 깨끗하고 밀봉 가능한 용기에 전달하고 젤이 완전히 침지되도록 합니다.
용기를 밀봉하고 빛으로부터 보호하기 위해 덮습니다. 50 rpm과 실온에서 궤도 셰이커에서 하룻밤 동안 컨테이너를 흔들어 보십시오. 젤을 깨끗한 용기에 옮기고 100 밀리리터에 30분간 스테인틴을 전달합니다.
그런 다음 젤을 초순수 수분으로 5분간 헹구는 것입니다. 젤은 벤치탑 트랜실루미나이터에 시각화되거나 365나노미터 채널 또는 302나노미터 채널의 젤 문서화 기계상에서 이미지화될 수 있다. 이 연구에서는, 새로운 형광 실버 염색 방법은 폴리 아크릴아미드 젤에 단백질을 얼룩지게 하는 데 사용됩니다.
형광 실버 얼룩에 의해 염색 된 단백질 밴드는 365 나노 미터 UV 램프 아래에 강렬한 녹색을 나타낸다. 모든 14 단백질 밴드는 명확하게 볼 수 있으며 SYPRO 루비 염료에 의해 염색 된 붉은 색 밴드와 잘 상관 관계가 있습니다. 이 형광 실버 염색 방법은 고해상도를 갖는 것으로 보입니다.
일부 단백질 밴드의 경우 형광 실버 얼룩의 감도는 형광 SYPRO 루비 얼룩보다 약간 더 좋습니다. 특히 이러한 얼룩의 성능은 10~40킬로달톤 사이의 단백질 대역에 대해 개선되며, 이는 새로운 방법이 저분자량의 단백질 검출에 특히 유용하다는 것을 나타낸다. 알 수 있듯이, 데이터는 또한 형광 실버 얼룩이 단백질 정량화의 상대적으로 넓은 범위를 통해 모든 14 단백질에 대한 좋은 균일 한 선형성을 제공한다는 것을 시사한다.
실버 질산염 얼룩이 높은 수준의 배경 신호와 왜곡된 피크를 주었지만, 형광 은 얼룩은 14가지 단백질 전체에 걸쳐 SYPRO 루비 얼룩에 필적하는 좋은 대비와 균일한 강도 분포로 밴드를 감지했습니다. 세척 단계는 은 함침 이나 불소 발달을 방해에서 잔류 고정 솔루션을 제한으로 중요 하다. 실버 질산염을 사용하는 경우 피부 접촉을 피하십시오.
유출을 즉시 청소하십시오. 보호복과 장갑을 착용하고 화학 폐기물로 폐기하십시오.
