이 프로토콜은 이중 좌초 된 DNA 중단을 초래하는 모든 프로세스에 적용 할 수 있으며 운동학에 대한 자세한 정량적 데이터를 산출합니다. 이 방법은 단일 분자 해상도를 가지고 있지만, 단일 실험에서 최대 1000 DNA를 측정하므로 좋은 통계를 제공합니다. 이 방법의 1차 적용은 DNA 결합 및 수정에 관여하는 메커니즘을 연구하는 것입니다.
예를 들면, 우리는 모든 DNA 결합 단백질과 관련있는 DNA 표적 검색을 공부에 관심이 있습니다. 처음으로이 기술을 시도 할 때, 단일 분자 밧줄은 섬세하다는 것을 기억, 한 번 형태, 주의처리해야합니다. 기능화 표면의 적절한 비율은 필수적입니다.
흐름을 그렇게 하기위한 몇 가지 트릭이 있습니다. 데이터 수집 중에 샘플 튜브를 전환할 뿐만 아니라 시각적 데모를 사용하면 이 절차를 새로 사용할 수 있습니다. 커버 슬립을 씻으려면 염색 항아리에 놓고 에탄올로 30 분 동안 초음파 처리하십시오.
탈이온화및 증류수로 철저히 헹구고, 수산화칼륨 1개에 담그고 30분 동안 초음파 처리합니다. 세척 시퀀스를 반복하여 세척 할 때마다 덮개 전표를 물로 헹구십시오. 청소된 커버 슬립을 물로 염색하는 항아리에 보관합니다.
깨끗한 면도기를 사용하여 8센티미터 길이의 로딩 및 출구 튜브를 자르고 깨끗한 유리 슬라이드의 구멍에 삽입합니다. 튜브에 에폭시하고 그것을 확보하기 위해 5 분 동안 치료할 수 있습니다. 양면 테이프를 유리 슬라이드에 채널 패턴으로 미리 잘라내고 플라스틱 집게로 매끄럽게 하여 좋은 밀봉을 만듭니다.
테이프에서 백업을 벗기고 깨끗한 커버 슬립을 적용하여 집게로 부드럽게 합니다. 이어서, 커버의 가장자리를 에폭시로 미끄러져 유동 세포를 밀봉하고 치료하게 한다. 원고 방향에 따라 PCR을 수행하여 테더링을 위해 표지된 DNA를 준비합니다.
그런 다음 PCR 정리 키트로 PCR 제품을 정화합니다. 버퍼 A10 밀리리터를 준비하고 진공 건조기에서 1시간 이상 분해합니다. 유동 셀을 기능화하기 위해, PBS에 안티 디곡시겐과 팹 조각의 25 마이크로 리터를 유량 채널에 주입하여 PE60 튜브에 맞게 젤 로딩 팁을 사용한다.
30 분 동안 실온에서 유동 셀을 배양합니다. 인큐베이션 후, 주사기로 채널을 통해 버퍼 A의 0.5 밀리리터를 당겨 채널에 공기를 도입하지 않도록주의하십시오. 그런 다음, 반전 된 현미경에 흐름 세포를 산.
콘센트 튜브를 주사기 펌프에 연결하고 입구 튜브를 버퍼 A.수동으로 버퍼 A의 0.5 밀리리터를 당겨 시스템을 플러시하고 펌프를 프라임하는 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 그런 다음 펌프를 분당 10 마이크로리터에서 5분 이상 실행하여 시스템을 상형화할 수 있도록 합니다. 구슬의 스톡 병을 소용돌이, 및 파이펫 1.6 버퍼 A의 마이크로 리터로 구슬의 마이크로 리터, 다음 다시 소용돌이.
구슬을 자기 분리기 위에 놓고 버퍼를 피펫합니다. 버퍼 A의 50 마이크로 리터에서 다시 중단하고 그들을 소용돌이. 마지막 세척 후, 밀리리터 당 160 마이크로 그램의 최종 농도에 대한 버퍼 A의 100 마이크로 리터에서 구슬을 다시 중단합니다.
완충A에서 0.5 피코몰라 표지 DNA 기판의 480 마이크로리터를 준비하고, 파이펫 20 마이크로리터의 비드 현탁액을 희석된 DNA로 준비한다. 혼합물을 회전에 3분간 놓습니다. 3분 후, 15분 동안 분당 10마이크로리터의 유속으로 또는 충분한 비드 테더링이 관찰될 때까지 즉시 채널에 샘플을 적재한다.
입구 튜브를 완충 A의 신선한 튜브로 전환하여 모든 무료 구슬의 채널을 세척하고 분당 50 마이크로 리터에서 10 분 이상 또는 느슨한 구슬이 관찰되지 않을 때까지 흐릅니다. 또한 인라인 밸브를 사용하여 흐름을 차단하고 튜브를 전환하는 것이 좋습니다. 하나의 부드러운 동작으로 튜브를 전환하고 백플로우를 피하기 위해 새롭고 오래된 샘플 튜브의 액체 수준이 일치하는지 확인합니다.
데이터를 수집하기 전에 DNA 분열 효소의 정확한 농도를 준비하고 입구 튜브를 샘플에 삽입합니다. 유동 셀 위에 자석을 낮춥춥시다. 펌프를 설정하여 분당 150 마이크로리터에 80마이크로리터의 샘플을 주입하고 데이터 수집을 시작합니다.
데이터 수집에 1 분, 펌프를 활성화. 여기에 반응 전후에 테더드 구슬의 대표적인 이미지가 표시됩니다. 데이터 분석은 분열 반응 전반에 걸쳐 테더드된 구슬의 수를 정량화하기 위해 수행되었다.
이 기술은 밀리리터 당 0.25에서 4 단위에 이르는 단백질 농도에 대한 Nde1의 부위 특이적 DNA 절단 비율을 측정하고, 마그네슘의 2개의 상이한 농도를 측정하는 데 사용되었다. 각 조건은 실험 당 몇 100 에서 1000 테더 DNA와 함께 적어도 두 번 복제되었다. 충분히 낮은 단백질 농도에서, 속도단백질에 비례하 고 마그네슘과 무관하다.
고단백 농도의 경우, 비율은 마그네슘에 의존하지만 단백질 농도와는 무관합니다. 이 프로토콜을 시도할 때 튜브 및 흐름 채널의 기포가 실험을 실행할 수 있음을 명심하십시오. 튜브를 전환하는 동안 라인에 공기를 허용하지 말고 사용하기 전에 모든 버퍼를 분해하십시오.
테더링 방법을 사용하면 DNA에서 긴장의 효과가 반응에 미치는 영향을 탐구할 수 있습니다. 이는 데이터 수집 중에 자석 강도를 변화거나 흐름을 적용하여 달성할 수 있습니다.
