이 방법은 센티미터의 특정 영역에 단백질을 국소화와 같은 중심 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 여러 방향으로 그들을 얻기 위해 센티미터를 집중하는 수단을 제공합니다. 이 방법은 클라미도모나스 중심 생물학에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 고립 된 인간과 파라메슘 중심과 같은 다른 시스템에 적용 될 수있다.

절차를 시연하는 것은 박사 과정 학생 니콜라이 클레나, 또 다른 박사 과정 학생 Maeva Le Guennec, 그리고 실험실 다비드 감바로토의 포스트 독이 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 미디어 와 C.Reinhardtii 세포를 준비합니다. 준비된 세포를 50밀리리터 원물 튜브로 옮기고 원심분리기를 600배 g에서 10분 동안 이송합니다.

1x PBS의 50 밀리리터로 한 번 펠릿을 씻고 10 분 동안 600 배 g에서 다시 세포를 회전시십시오. 파이펫을 사용하여 실온 탈색 버퍼의 100 밀리리터에서 펠릿을 다시 놓습니다. 비커를 자기 교반기 위에 놓고 0.5 개의 어금니 아세트산을 4.5 ~ 4.7의 최종 pH에 천천히 추가하십시오.

이 혼합물을 실온에서 2 분 동안 배양하십시오. 이 후 천천히 7.0에 pH를 복원하기 위해 하나의 정상 칼륨 수산화칼륨의 방울을 추가 한 후, 50 밀리리터 튜브로 세포를 전송하고, 원심 분리는 10 분 동안 600 배 g에서 그들을 원심분리, 어떤 분리 된 플래그엘라를 제거합니다. 상체를 버리고 씻을 준비가 될 때까지 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오.

준비되면 세척당 섭씨 4도에서 1x PBS 50 밀리리터를 사용하여 펠릿을 두 번 씻으십시오. 세척된 펠릿을 600g, 섭씨 4도에서 10분간 회전합니다. 1x PBS의 30 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.

그런 다음, 천천히 혼합하지 않고 25 % 자당의 20 밀리리터 쿠션에 서스펜션을 로드합니다. 남은 기포라를 제거하고 자당에 세포를 퍼뜨리기 위해 15분 동안 600배 g와 섭씨 4도에서 회전하십시오. 흡혈구를 사용하여, 신중하게 최하위 20 밀리리터를 유지 하는 슈퍼 내탈자를 흡인.

감기 1x PBS 20 밀리리터를 추가하여 남은 자당을 씻으셔도 됩니다. 원심분리기는 600배, 섭씨 4도에서 10분간. 10 밀리리터의 10밀리리터에서 섭씨 4도에서 펠릿을 다시 중단하고 용액에 덩어리가 없는지 확인합니다.

재중단 된 펠릿을 새로운 250 밀리리터 병에 옮기고, 세포를 포함하는 병에 5, 000 단위의 DNase로 보충된 용해 버퍼를 추가합니다. 1시간 동안 섭씨 4도에서 배양하고, 병을 조심스럽게 반전시켜 15분마다 섞어 주세요. 용액 세포를 50 밀리리터 원물 튜브및 원심분리기로 600g, 섭씨 4도에서 10분 동안 옮긴다.

파이펫을 사용하여 상체를 수집하고 60 % 자크로 쿠션의 두 밀리리터가 들어있는 얼음에 30 밀리리터 라운드 하단 튜브에 로드합니다. 원심 분리기는 섭씨 4도에서 30분 동안 10, 000배 g로 이쪽. 그 후, 자당 쿠션 위에 최대 1 밀리리터까지 슈퍼너티드를 흡인시합니다.

남은 상류체의 1밀리리터와 자당 쿠션의 두 밀리리터 사이의 노란색 인터페이스를 유의하십시오. 절단 P1000 팁을 사용하여, 부드럽게 자당과 나머지 상수와 혼합. 모든 자당 쿠션을 풀고 얼음 위에 보관하십시오.

다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 얇은 벽38.5 밀리리터 폴리프로필렌 튜브에서 40%에서 70%의 자당 그라데이션을 준비한다. 풀이 된 인터페이스를 그라데이션에 천천히 로드합니다. 튜브의 밸런스를 10 밀리머 K-PIPES 버퍼, 원심분리기는 68, 320배, 섭씨 4도에서 75분간 균형을 이릅니다.

그 후 0.8mm 바늘을 사용하여 튜브 바닥에 구멍을 뚫고 다른 자당 층을 방해하지 않도록하십시오. 이 구멍을 사용하여 섭씨 4도에서 12 500 마이크로리터 분획을 수집합니다. 절단 P200 팁을 사용하여, 면역 형광 중에 사용할 각 분획에서 추가 10 마이크로 리터 알리쿼트를 준비합니다.

그런 다음 액체 질소의 분획을 스냅 고정합니다. 먼저 멸균 12mm 커버슬립을 농축기의 오목한 하단 에 놓고 PDL 코팅 측면을 아래로 유지하십시오. 어댑터를 맨 위에 직접 놓고 커버슬립을 캡합니다.

그런 다음 라운드 하단 튜브를 반전시키고 농축기, 커버 슬립 및 어댑터 위에 놓습니다. 핀셋을 사용하여 튜브 바닥에 도달 할 때까지 부드럽게 앙상블을 밀어 튜브를 반전시면 됩니다. 농축기 의 상단에 도달 할 때까지 K-PIPES 버퍼의 10 밀리머를 추가합니다.

농축기의 중앙 실린더에 거품이 없는지 확인합니다. 10 밀리머 K-PIPES 버퍼100 마이크로리터를 농축 된 원골 분수의 알리쿼트 중 하나에 부드럽게 추가하고 P200 파이펫을 사용하여 완전히 혼합하십시오. 다음으로, 농축기의 중공 중심에서 K-PIPES 버퍼 100마이크로리터를 제거하고, 버퍼 분획 혼합물의 100마이크로리터를 추가하여 내용이 농축기의 중공 중앙에 남아 있는지 확인합니다.

섭씨 4도까지 미리 냉각되는 원심분리기에서 10, 000배 g에서 10분간 회전합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 농축기를 제거합니다. 어댑터의 구멍에 수제 후크 장치를 삽입하고 커버슬립을 복구하기 위해 부드럽게 들어 올립니다.

튜브 의 상단에 도달하면 장갑을 낀 손가락을 사용하여 어댑터 가장자리를 트랩하고 핀셋을 사용하여 커버슬립을 제거하며 커버슬립의 어느 쪽에 센트리올이 포함되어 있는지 염두에 두십시오. 그런 다음 농축 된 중심의 고정 및 면역 형광 염색을 수행합니다. 시작하려면, 5 분 동안 영하 20도에서 100 % 메탄올로 채워진 준비 된 크리스탈 폴리스티렌 전송 실험실 상자에 센트리올로 커버립을 배양하십시오.

핀셋을 사용하여 커버립을 1x PBS 50 밀리리터로 채워진 투명한 실험실 상자로 옮습니다. 실온에서 5분 동안 PBS에서 슬라이드를 세척하십시오. 그런 다음, 1차 항체의 파이펫 60 마이크로리터가 가습 챔버에서 실험실 밀봉 랩의 조각에 혼합된다.

조심스럽게 커버립을 항체 믹스 위에 놓고, 센트리올은 드롭을 직접 마주한다. 커버립을 45분 동안 배양합니다. 그 후 커버립을 제거하고 PBS가 포함된 상자에 5분간 세척합니다.

PBS 1%BSA 및 0.05%Tween-20의 이차 항체를 45분 동안 세척된 커버립을 배양합니다. 커버립을 제거하고 PBS가 들어있는 상자에 5 분 동안 씻으실 수 있습니다. 일반 페이딩 안티 마운트 배지를 사용하여 커버슬립을 슬라이드에 장착합니다.

그런 다음, 1.4의 N.A.를 가진 63X 오일 목표에서 공초점 현미경에 고립 된 중심을 이미지하면서 deconvolution을 적용합니다. 각각 센트리올 신호 위와 아래에 Z 스택의 위쪽 및 하단 위치를 설정하고 총 중심 신호를 포함하는 큰 이미지 스택을 획득한다. 스택을 투영하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단일 파티클 평균을 수행합니다.

대표적인 면역형광은 6개의 분수가 격리된 센티미터를 위해 농축되고, 마지막 2개의 분수는 그렇지 않은 반면, 정제가 성공적임을 나타낸다. 집중력없이 시야당 약 30 센트만 볼 수 있으며 183은 농축기와 함께 볼 수 있습니다. 이는 농축기 단계가 성공적이며 정의된 영역에서 센트리올을 6배 더 농축하여 쉽게 감지하고 이미지화할 수 있음을 보여줍니다.

슈퍼 해상도 현미경 검사는 다음 모노 글루타밀레이션 튜룰린에 대한 염색 된 중심을 이미지하는 데 사용되며, 소프트웨어는 선택한 각 방향에 대한 거의 완벽한 평균을 생성하는 데 사용됩니다. 5회 반복 후, 평균 의 두 클래스는 모노글루타큘레이션 중심의 생성되었다: 63 개의 개체에서 상단 보기와 98 입자에서 측면 보기. 측면 뷰 클래스 평균의 길이는 직경 250 나노미터로 260 나노미터이며, 센티미터의 코어 내에서 국소화되는 측정된 단박골 투룰린 신호와 비교할 수 있습니다.

이 절차를 수행하는 동안, 얼음에 고립 된 중심을 유지하고 격리 후 그들을 스냅 동결 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 냉동 전자 현미경 및 질량 분광법과 같은 다른 방법은 센트리올 또는 센트리올 단백질 조성물의 네이티브 아키텍처와 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다.