우리는 DRS 감사합니다. Yuh - Nung 본 연구에 사용된 비행 주식을 제공하고 월 웨스 Grueber. 저자 토마스 F.와 케이트 밀러 제프리스 기념이 연구의 지원 트러스트 (DNC)와 조지 메이슨 대학 프로보츠 사무소 (EPRI)을 인정합니다.

Drosophila 주변의 뉴런의 마그네틱 비드 정렬에 대한 일반 댓글 (의정서의 완료에 대한 총 타이밍 : 2.5-3 시간) 깨끗하고 RNAse 무료로 환경을 유지하기위한 표준 실험실 절차 RNA 저하를 방지하기 위해 항상 준수해야합니다. Drosophila 애벌레의 표피가 해부 및 세포 분리 버퍼에 배치되면, 주변 신경은 표피에서 분리 마지막 셀 중 하나입니다. 우리는이 속성을 악용 등 근육 사전 검사의 뉴런을 분리하기 위해 지방으로 표피의 불특정 세포의 대부분을 제거하는이 프로토콜을 설계했습니다. 연습, 전체 프로토콜은 성공적으로 약 2.5 시간 이내에 완료할 수 있습니다. 실험이 시작되기 전에 항체 코팅 구슬의 준비는 완료해야합니다. 1. 바인딩 전지 자기 비즈 준비 : 이 단계는 이전 실험의 시작을 완료해야합니다. 준비 구슬이 필요 ° C까지 4 준비하고 저장할 수 있습니다. <ol><li> 신선한 PBS 500 μl에 resuspending하고 강력한 자장의 각 시간을 pelleting하여 Dynabeads M - 280 Streptavidin 코팅 구슬 PBS로 세 번 100 μl 씻으십시오. </li><li> 마지막 undiluted biotinylated 쥐 방지 마우스 CD8a 항체 (항체 농도가 100 μg / ML)을 100 μl에서 직접 구슬을 resuspend. </li><li> 침전을 방지하기 위해 가끔 약한 vortexing 얼음 1 시간 동안 혼합물을 품어. [Dynabeads M - 280 1 μl는 biotinylated 항체의 0.05-0.10 μg을 바인딩할 수 있습니다]. </li><li> 비드 - 항체 혼합물에게 같은 여분의 항체를 제거하는 단계 1.1에서 설명한 세 번 씻으십시오. 자석 구슬은 지금 항체로 코팅하여 사용 준비가 된 것입니다. 4 1X PBS 100 μl의 비드 - 항체 혼합물을 저장 ° C를 사용까지. </li></ol> 2. (10-15분) : 애벌레를 선택하고 워싱 <ol><li> 30-50 세 일치 셋째 instar의 애벌레를 선택하고 1X 인산의 1-1.2 ML과 1.6ml microfuge 튜브에서 그들을 장소 살린 (PBS)를 버퍼. (3~5분) </li><li> 각 일초에 대한 관 및 최대 설정에 소용돌이를 세 번 닫습니다. </li><li> 불타는 광택 파스퇴르 피펫을 사용하면 완전히 뜨는 폐기하십시오. 세차 (2.1)을 반복하고 뜨는 어떤 음식 입자와 파편의 가시 명확 때까지 와동 (2.2) 3-4 회 단계를 반복합니다. </li><li> 간단히 70 % 에탄올 1 ML로 세척을 반복하고 뜨는 폐기하십시오. </li><li> ddH2O 1 ML과 함께 두 번 애벌레를 세척하고 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 간단히 RNase - 어웨이 1 ML과 함께 다시 한번 세척을 반복하고 뜨는 폐기하십시오. </li><li> RNase 작별의 완전한 제거를 위해 ddH2O 1 ML에있는 애벌레 세 번 씻으십시오. </li></ol> 3. 해부 : (10-12분) <ol><li> Sylgard 코팅 35mm 페트리 접시의 중앙에 자리 10-12 애벌레. 조금씩 서로 떨어져 그들을 놓습니다. [중요 단계 : 적절한 발달 단계에되지 않는 것 같습니다 어떤 애벌레를 삭제] </li><li> 모든 애벌레에 대한 미세 해부 가위의 쌍을 사용하여 애벌레의 앞쪽에 팁을 오픈 했네요. </li><li> 애벌레 내부 아웃 반전 재미 더몬트 제 5 포셉 한 켤레를 사용합니다. 애벌레 표피 안쪽 뒷부분 끝까지 하나 forcep를 삽입합니다. 표피 (그림 1A) (쉽게 만들기 위해 Sylgard 표면에 표피를 눌러보십시오)의 뒷부분 끝을 잡고 함께 포셉의 팁을 핀치. 포셉의 두 번째 쌍을 사용하여 밖으로 내부의 애벌레 표피 밀어. [중요 단계 : 세포 분리 실험을 시도하기 전에이 방법을 몇 번 연습하십시오. 모든 부드러운 조직이 쉽게 분리를위한 솔루션에 노출되는 것을 보장하기 위해, 완전히 거꾸로 애벌레를보십시오.] </li><li> 3-4 유충을 해부하면, 1.6 ML의 microfuge 관에 신선하고 차가운 PBS (얼음 튜브를 삽입)로 즉시 전송합니다. </li><li> 필요한 모든 애벌레가 (이 프로토콜 30-40 애벌레) 수집되기 전까지는 3.4 단계 3.1 반복합니다. [중요 단계 :. 10~20%의 해부와 분리하는 동안 손실과 계획을 예측 따라] </li></ol> 4. 느슨하게 자기편 아닌 특정 세포의 제거 : (2-3 분) [이 단계는 지방 기관 및 CNS로 느슨하게 자기편 아닌 특정 조직의 비운을 에이즈.] <ol><li> 거꾸로 애벌레 발톱 뿌리의 엷은 피부를 포함하는 1.6 ML의 microfuge 튜브를 타고 신선한 얼음처럼 차가운 PBS의 약 700-800 μl로 뜨는 교체하십시오. </li><li> 펄스 - 와동 microfuge 튜브 최고 속도에서 5 회 (펄스 당 3 초). </li><li> 뜨는을 취소하고 약 700-800 μl 신선하고 차가운 PBS로 바꾸십시오. </li><li> 단계 4.2 4.3 세 번 반복합니다. </li><li> 레스신선하고 차가운 PBS 400 μl의 애벌레 손톱을 uspend </li></ol> 5. 단일 세포 현탁액에 조직을 Dissociating (18~20분) [중요 단계 : 이상 - 해리는 가난한 세포 수율과 낮은 세포 생존에 선도적인 세포 표면 마커의 손실이 발생할 수 있습니다. 애벌레 조직도 기계적 해리 (sonication, douncing), 효소 분해 (트립신, collagenase 등) 또는이 둘의 조합으로 dissociated 수 있습니다. 이 애벌레 조직이 분열시키다하기가 어렵습니다, 우리는 모두 기계 및 효소 분해의 조합은 최상의 결과를 굴복 것으로 나타났습니다.] <ol><li> PBS 400 μl의 중단 애벌레 표피에 1X Liberase Blendzyme 3 (28 W nsch 단위 / 유리병) 1.5 μl를 추가합니다. </li><li> 최대 설정 (이것은 솔루션에 표피에서 느슨하게 자기편 세포를 제거한다) 각 일초에 대한 소용돌이 솔루션에게 2-3 번. </li><li> 5 분 실내 온도 (22-25 ° C)에서 솔루션을 품어. [중요 단계 : 부화 시간이 크게 최종 셀 정렬의 효율성에 영향을 미칩니다. 권장 부화 시간은 조직을 느슨해진 충분한해야합니다. 15 분 초과하지 마십시오.] </li><li> 펄스 - 와동 튜브 전속력으로 펄스 당 2 초 최대 설정에서 20-30 시간. 이것은 솔루션에 근육과 다른 조직을 출시한다. 각 단계에서 스테레오 현미경 형광 아래의 솔루션의 작은 샘플을 검사합니다. (경험을 가진 사람이 직접 형광 활성화된 스테레오 현미경 microfuge 관을 관찰하여 분리 수준을 확인할 수 있어야합니다) </li><li> 신선하고 차가운 PBS로 애벌레의 발톱 뿌리의 엷은 피부에게 2-3 번 씻고 마지막 신선한 얼음처럼 차가운 PBS가 포함된 1 % BSA 500 μl 그들을 resuspend. </li><li> 2 ML의 Kontes 조직 분쇄기, 대형 통관 유봉, 사전 코트 조직 분쇄기 및 PBS 용액에 1 % BSA와 BSA의 솔루션을 폐기 린스 간단한 이후 유봉의 유리 표면에 고집 애벌레 표피를 피하려면. 그 후, 불을 광택 파스퇴르 피펫 사용하여 BSA - 코팅 조직 분쇄기 단계로 5.5에서 손톱을 전송. [중요 단계 : 세포 손상 / 용해를 방지하기 위해 몇 분 동안 얼음에 배치하여 사전 멋진 조직 분쇄기 / 유봉]. </li><li> (약 20-30 치기) 얼굴이 볼만을 피하고, 천천히 그리고 계속해서 함께 조직을 다운스. [중요 단계 :. 천천히 그리고 꾸준히 다운스, 그렇지 않으면 세포가 lyse 수 있습니다] </li><li> 세포 분리 수준을 평가하기 위해, 깨끗한 Kimwipe 조직과 조직 분쇄기의 외벽을 닦아, 그리고 스테레오 현미경 형광 하에서 그것을 검사합니다. 뉴런은 표피에서 분리해야하고, 솔루션에 볼 수 있습니다. 이것이 어려운 것으로 판명될 경우, 또는 솔루션의 작은 샘플을 피펫, 그리고 스테레오 현미경 형광 하에서 그것을 관찰합니다. 세포 분리의 좋은 표시는 애벌레 표피에서 뉴런의 부재입니다. 하나는 아직 표피에 연결된 뉴런을 관찰하거나, 불완전하게 dissociated 세포를 관찰하면 세포가 하나의 세포 현탁액을 달성 때까지 그러나, 더 다운스. </li><li> 불타는 광택 파스퇴르 피펫으로 용액, 5 번 씹다가 불을 광택 파스퇴르 피펫 10 배 표준 팁 직경의 약 25 % 줄여주 다음, 표준 팁 직경의 약 50 % 좁게. [중요 단계 : 강력 분쇄는 세포가 손상될 수 있습니다. 단계 사이의 세포를 모니터하고 그에 따라 절차를 조정]. </li><li> 30 μm의 셀 필터를 통해 솔루션을 필터와 1.6 ML의 microfuge 튜브에 세포 여과물를 수집합니다. 그 결과 솔루션은 단일 세포 현탁액으로 이루어져 지금은 자기 세포 분류를위한 준비해야합니다. </li></ol> 6. 마그네틱 비드 셀 정렬 (45-75분, 항체 배양 시간에 따라 다름) <ol><li> 세포 현탁액 500 μl (5.10 단계)에 항체 코팅 자기 구슬 15 μl를 추가합니다. 이후 셀 isolations에 필요한 때까지 나머지 항체 복합 자석 구슬을 저장할 수 있습니다. </li><li> 가끔 손으로 믹싱과 얼음 30-60분에 대한 항체 코팅 자석 구슬로 세포를 품어. [중요 단계 : 부화 높은 온도 또는 긴 시간에서가 아닌 특정 항체 바인딩이 발생할 수 있습니다.] </li><li> 이분의 강력한 자장에 microfuge 튜브를 놓습니다. 언바운드 비즈와 함께 모든 긍정적으로 선택한 세포는 튜브의 측면으로 구분됩니다. </li><li> 천천히 세포 펠렛을 방해하지 않도록하고, 표면에 뜨는를 피펫. </li><li> 남아있는 불특정 세포를 제거하는 신선하고 차가운 PBS에 세포에게 3-4 회 씻으십시오. </li><li> 신선하고 차가운 PBS의 30 μl의 세포를 Resuspend. </li><li> 대략 순결과 세포의 항복하려면 셀 susp의 피펫 5 μlhemocytometer의 광택 표면에 ension 및 스테레오 - 현미경 형광의 모든 보이는 형광 세포를 계산합니다. 또한 비 형광 세포와 불순물의 흔적 금액을 확인합니다. 일반적으로 샘플은 높은 형광 세포에 대한 풍부합니다. </li></ol> 7. 마그네틱 비드 정렬 세포로부터 RNA 분리 : (60-75분) <ol><li> , 펠렛에게 자기 분야에서 세포를 계산 후, 표면에 뜨는를 버리고 PicoPure ™ RNA 격리 키트 (분자 장치)에서 추출 버퍼 20 μl를 추가합니다. 휴대폰 번호에 따라 하나 추출 버퍼의 높은 볼륨을 추가해야 할 수도 있습니다. </li><li> 소용돌이 최대 속도에서 튜브 추출 버퍼와 세포 펠렛의 혼합을 사​​용합니다. </li><li> 30 분 42 ° C에서 튜브를 품어. </li><li> 이전 RNA의 열 정화 (단계 7.5 참조) 자기 구슬의 제거를 보장하기 위해 튜브를 간단히 펠렛 2 분 자성 비즈 2,000 (X) g에 centrifuged입니다. 튜브는 다음 펠렛을 유지하는 강한 자장에 배치하고, 뜨는은 새로운 microfuge 튜브로 전송됩니다. </li><li> 추출 및 열 PicoPure RNA 추출 키트 제조 업체의 지침에 따라 RNA 정화. DNAse 치료는 선택 사항이며, 분석 요구에 따라 RNA 정화 동안 열을 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 사용을위한 준비까지 -80에서 용출 버퍼와 저장 ° C의 작은 볼륨 (11-30 μl)에서 바운드 총 RNA를 elute. 원하는 경우 1 μl 나누어지는는 Bioanalyzer 2100 (애질런트 테크놀로지 주식 회사)에서 총 RNA의 품질을 평가하기 위해 사용할 수 있습니다. </li></ol> 대표 결과 : 마그네틱 비드 정렬은 Drosophila 다 신경을 (그림 1) 분리하기 위해 사용되었다. 이러한 절연 다의 뉴런 (그림 2A)에서 정화 RNA는 애질런트 2100 Bioanalyzer (애질런트 테크놀로지 주식 회사)에서 분석하면 날카로운 5.8S, 18S 및 28S ribosomal RNA의 봉우리의 존재로 표시로서 우수한 품질의 것을 알았습니다 ( 그림 2B). 30-40 셋째 instar의 애벌레부터 우리는을 사용하여 평균 PPK - GAL4 드라이버를 사용하여 300-500 클래스 IV DA의 뉴런과 뉴런의 1500년에서 2000년까지 DA (클래스 I, II, III 및 IV)에 분리 수 있었다 냄비를 DA 뉴런 특정 GAL4 21-7 드라이버. 우리 고립된 세포의 연결을 특정 농축을 평가하기 위해 두 가지의 연결을 유전자 특정 마커를 (elav 및 futsch)을 사용하여 정량 반대 전사 PCR (qRT - PCR)을 수행. 이러한 분석은 우리의 프로토콜 (그림 3)를 사용을 통해 흐름에 비해 검찰의 뉴런에 매우 구체적인 농축을 나타내는 마커 유전자 모두의 중요한 배 농축을 공개했다. 마지막으로, 팬 - DA의 뉴런과 클래스 IV DA의 뉴런 모두에서 분리된 RNA는 애질런트 Drosophila melanogaster 전체 - 게놈 oligo의 microarrays (4 X 44K) (그림 4)에 transcriptional 표현 프로 파일링을 수행하는 데 사용되었다. 이러한 분석은 이전에 uncharacterized 분자 잠재적 DA 신경 세포 개발에 중요한 기능 역할을 putative 신호 전달 경로의 광범위한 스펙트럼 이외에 다 신경 세포 dendrite의 morphogenesis 수많은 이전에 연루 규제를 발견. DA 뉴런의 개발, 특히 dendrite morphogenesis을 중재에 이러한 이전 uncharacterized 분자의 잠재적인 역할 (들)을 평가하기위한 연구가 현재 진행되고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure1tmb.jpg" border="0" /> 그림 1 :. DA 뉴런 특정 GAL4 베어링 Drosophila 검찰의 뉴런의 자성 비드 분류의 도식 (A) 연령 일치 셋째 instar의 애벌레, UAS - mCD8 - GFP 기자 transgene은 반전 애벌레 표피 안에 아웃을 폭로하여 해부 아르 분리 버퍼 PNS는 얼음처럼 차가운 PBS에 저장됩니다. (B) 효소 분리가 애벌레 표피를 포함하는 솔루션에 Liberase Blendzyme 3 추가하여 수행됩니다. (C) 애벌레 조직은 vortexing, 가루약의 조합에 의해 더 dissociated하고 douncing 같은 지방 단체, 창자 및 CNS. (D, E) 세포 다음 30 μm의 세포 필터를 사용하여 필터링됩니다 아닌 구체적으로 표시된 조직을 제거합니다. 이 솔루션은 상피 조직, 근육 및 신경을 포함한 다양한 세포 유형의 단일 세포 현탁액이 포함되어 있습니다. (F) 안티 마우스 CD8a - 항체 코팅 Dynabeads M - 280이 세포 현탁액에 추가하고, 30~60분 위해 얼음 incubated 수 있습니다. ( g) 자기 구슬이 GFP 융합 단백질. (H, I) 마그네틱 비드 코팅 세포는 강한 자장에 솔루션을 배치로 구분됩니다 태그를 마우스 CD8을 표현하는 검찰의 뉴런에 바인딩합니다. 뜨는은 무시되고 전지 (J) H의 결과, 잔여 불특정 세포를 제거하는 세 번 씻어 아르ighly 뭐냐 뉴런의 인구를 정​​화. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure2tmb.jpg" border="0" /> 그림 2 : 세포 분리 및 마그네틱 비드별로 정렬 절연 긍정적으로 선정, GFP 형광 클래스 IV DA의 뉴런의 (A) 대표 이미지. 뉴런의 결과로 인구가 매우 거의 또는 전혀 오염 세포 불순물이 클래스 IV DA의 뉴런에 풍부하게하는 결정되었습니다. (B) 총 RNA의 애질런트 2100 Bioanalyzer (애질런트 테크놀로지 주식 회사) electropherogram 자석 비드 정렬 검찰의 뉴런으로부터 격리 같은 5.8S, 18S, 28S 및 rRNAs의 존재로 표시 뛰어난 총 RNA의 품질을 보여주는. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure2.jpg">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure3.jpg" border="0" /> 그림 3 : 격리 다 뉴런 (GAL421 - 7, UAS - mCD8 - GFP)과 분수를 통해 흐름이 세중의에서 수행된에의 연결 마커 유전자 발현의 qRT - PCR 분석. 두의 연결을 특정 마커 유전자 (elav 및 futsch)의 표현 수준은 qRT - PCR에 의해 평가되었다. 이러한 분석에서 얻은 값은 내생 컨트롤 (rp49)에 정규화되었으며, 분수를 통해 흐름 관찰들에게 상대적인 수준은 ΔΔCτ 방법 6을 사용 계산되었습니다. 분획을 통해 흐름에 비해 elav과 futsch 모두 상당히 고립 DA 뉴런의 인구 풍부하게했다. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure4tmb.jpg" border="0" /> 그림 4 : microarray 이미지 파일 레이블 대표 클래스 - IV DA 뉴런 특정 Cy3. 마그네틱 비드 정렬하여 정화 클래스 IV DA의 뉴런으로부터 격리 Cy3 - labeld 총 RNA와 hybridized 애질런트 Drosophila melanogaster 전체 - 게놈 oligo microarray (4 X 44K)입니다 여기에 표시됩니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure4.jpg">여기를 클릭</a> 그림 4의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

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	<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+methods.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li></ol>

여기에 제시 프로토콜은 자기 비드 셀 정렬 전략을 사용하여 Drosophila 셋째 instar 애벌레의 표피의 내부 표면에 단단히 고수 주변 뉴런의 분리 및 정제에 최적입니다. 우리가 구체적으로 애벌레 또는 개발의 pupal 단계에있는 표피에 맞게 다른 세포 유형의 고립이 프로토콜의 Drosophila 뭐냐 뉴런, 응용 프로그램을 분리하기 위해이 프로토콜을 사용하는 동안 (예 : 상피 조직, 근육, 기타 말초 신경)에 ?...

장비 <ul><li> 또는 ™ -2 DynaMag (10) 네오디뮴 자석 블록 (K &amp; J 자기학, 주식, 고양이. # B444B), (Invitrogen, 고양이를. # 123 - 21D)를 사용할 수 있습니다. </li><li> 대형 통관 유봉과 함께 Kontes 유리 조직 그라인더, 2 ML 작업 능력 (Cat. # 885300-0002) </li><li> 세포 필터 예 맥 사전 분리 필터 (Miltenyi Biotec, 고양이. # 130-041-407) </li><li> 35mm 배양 - 요리 Sylgard (다우 코닝 주식 회사, 고양이. # 3097358-1004)로 코팅 </li><li> 해부 도구 : 더몬트 제 5 포셉 두 쌍 (파인 과학 도구, 고양이 # 11251-20). </li><li> Vannas 봄 마이크로 해부 가위 (파인 과학 도구, 고양이. # 15000-08) </li><li> 일회용 팁을 Pipettes (P - 1000, P - 100, P - 10) </li><li> 셀 및 견적 순도를 계산하는 표준 hemocytometer </li><li> 표준 직경 화재 광택 팁을 파스퇴르 pipettes은 표준 직경 ~ 50 % 범위를 압축 및 분쇄를위한 표준 직경 ~ 25 % 줄여주 </li><li> 테이블 상단 마이크로 원심 분리기 (1-16,000 (X) G) </li><li> 와동 </li><li> 형광등 스테레오 현미경 (Leica MZ16FA이 프로토콜에 사용되었습니다) </li></ul>

isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting

<em&gt; Drosophila</em&gt; 주변 신경계 (PNS)는 기능과 분자 수준에서의 연결을 개발 및 dendrite의 morphogenesis의 복잡한 프로세스를 조사위한 강력한 모델입니다. 이러한 분석에 도움이하기 위해, 우리는 PNS의 신경의 하위 클래스의 고립을위한 전략 돌기 arborization (DA) 널리 dendrite morphogenesis을 공부에 사용되었습니다 뉴런이라는 개발<sup&gt; 1,2</sup&gt;. 이들 뉴런은 힘든 chitinous 애벌레 표피 아래에 위치를 도달하기 어려운 매우 순수 인구로 분리하기 어려운 그들의 매우 낮은 발생하는 부분 때문에 그들입니다. 우리의 새로 개발된 방법은 이러한 문제를 극복하고, 항체 - 코팅 자기 구슬을 사용하여 신속하고 특정 세포 강화에 따라 달라집니다. 우리 자기 비드 정렬 연구, 우리는 마우스 CD8 태그 GFP 융합 단백질을 (표현 나이에 일치하는 세번째 instar의 애벌레를 사용한<em&gt; UAS - mCD8 - GFP</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; 클래스 IV의 돌기의 arborization 하나의 제어하에 (DA) 신경 세포 특정<em&gt; 소매치기 (PPK) GAL4</em&gt; 드라이버<sup&gt; 4</sup&gt; 또는 팬 - DA 뉴런 특정 GAL4의 통제<sup&gt; 21-7</sup&gt; 드라이버<sup&gt; 5</sup&gt;. 이 프로토콜은 몇 가지 매개 변수를 변화하여 애벌레 표피의 내부 벽에 연결된 PNS 세포를 분리에 최적화된되어 있지만, 같은 프로토콜의 애벌레 또는 pupal 단계에서 표피에 부착된 여러 세포 유형을 분리하는 데 사용될 수 개발 (예 : 상피 조직, 근육, oenocytes 등), 또는 GAL4 특정 드라이버 표현 패턴에 따라 애벌레 기관에서 다른 세포 유형. 이 방법에 의해 분리된 RNA는 높은 품질이며 쉽게 이러한 microarray 유전자 발현 프로 파일링 연구로 하류 게놈 분석을 위해 사용될 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 격리에 대한 연구를 수행하는 강력한 새로운 도구를 제공합니다<em&gt; Drosophila</em따라서 dendrite morphogenesis를 기본 분자 메커니즘에 새로운 통찰력을 제공&gt; 돌기 arborization (DA) 뉴런.

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Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

이 동영상 기사에서 우리는의 분리 및 정제를위한 방법을 제시<em&gt; Drosophila</em빠른 자석 구슬 도움 셀 정렬 전략을 사용하기&gt; 주변 뉴런. 분리된 세포에서 얻은 RNA는 쉽게 microarray 분석을 포함하여 하류 어플 리케이션에 사용할 수 있습니다.

의 분리 및 정제 Drosophila</em마그네틱 비드별로 정렬> 주변 뉴런

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

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Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

13.3K 조회수.  George Mason University. 이 동영상 기사에서 우리는의 분리 및 정제를위한 방법을 제시 Drosophila 주변 뉴런. 분리된 세포에서 얻은 RNA는 쉽게 microarray 분석을 포함하여 하류 어플 리케이션에 사용할 수 있습니다.

비디오: Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

연구

생물학

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

의 분리 Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA 정제에 의한 염색질 절연 (처프)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their prominent presence is often associated with poor prognosis1,2. CAFs are an activated subpopulation of stromal fibroblasts, many of which express the myofibroblast marker &alpha;-SMA3. CAFs originate from local tissue fibroblasts as well as from bone marrow-derived cells recruited into the developing tumor and adopt a CAF phenotype under the influence of the tumor microenvironment4. CAFs were shown to facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes tumor cell proliferation, angiogenesis, and invasion5-8. We demonstrated that CAFs enhance tumor growth by mediating tumor-promoting inflammation, starting at the earliest pre-neoplastic stages9. Despite increasing evidence of the key role CAFs play in facilitating tumor growth, studying CAFs has been an on-going challenge due to the lack of CAF-specific markers and the vast heterogeneity of these cells, with many subtypes co-existing in the tumor microenvironment10. Moreover, studying fibroblasts in vitro is hindered by the fact that their gene expression profile is often altered in tissue culture11,12 . To address this problem and to allow unbiased gene expression profiling of fibroblasts from fresh mouse and human tissues, we developed a method based on previous protocols for Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)13,14. Our approach relies on utilizing PDGFR&alpha; as a surface marker to isolate fibroblasts from fresh mouse and human tissue. PDGFR&alpha; is abundantly expressed by both normal fibroblasts and CAFs9,15 . This method allows isolation of pure populations of normal fibroblasts and CAFs, including, but not restricted to &alpha;-SMA+ activated myofibroblasts. Isolated fibroblasts can then be used for characterization and comparison of the evolution of gene expression that occurs in CAFs during tumorigenesis. Indeed, we and others reported expression profiling of fibroblasts isolated by cell sorting16. This protocol was successfully performed to isolate and profile highly enriched populations of fibroblasts from skin, mammary, pancreas and lung tissues. Moreover, our method also allows culturing of sorted cells, in order to perform functional experiments and to avoid contamination by tumor cells, which is often a big obstacle when trying to culture CAFs.

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Cancer Associated Fibroblasts (CAFs) facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes proliferation, angiogenesis, and inflammation. Here we describe a method to isolate pure populations of normal fibroblasts and CAFs from fresh mouse and human tissues by cell sorting, using PDGFR&#x03B1; as a surface marker.

형광 활성 세포 정렬 (FACS)에 의해 신선한 조직으로부터 정상 및 암 관련 섬유 아세포의 분리

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

성적 증명서와 Metabolites에서의 정화<em&gt; Drosophila</em&gt; 헤드

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

단백질 - 단백질 상호 작용을 확인<em&gt; 초파리</em탠덤 선호도 정화로&gt; 성인 머리 (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

조직 해리 차동 여과 이식 미토콘드리아의 신속한 분리 및 정제

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

말초 혈액에서 마이크로 소포의 분리 및 특성

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

의 분리 및 정제 Drosophila 주변 뉴런

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