NIH에서 지원하는 SEJ에 R01HL105635을 부여합니다. 저자는 기술적 조언 디에고 V. Bohórquez에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 기술 지원을 R. 이안 커밍 감사 및 공작 인간 백신 연구소 연구 유동 세포 계측법 공유 자원 시설 (더럼, NC)에 유동 세포 계측법을 수행하는 단계를 포함한다. 세포 계측법 건강의 국립 연구소, 알레르기 국립 연구소 감염증 (UC6-AI058607)에서 건설 부분 지원을받은 듀크의 지역 Biocontainment 연구소에서 수행 한 흐름.

동물 주제와 관련된 절차는 듀크 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 빠른 블루 1. 비강 관리 빠른 블루의 경우, 최소 2 일 마우스를 안락사 전에 염료를 관리 할 수​​ 있습니다. 염료는 최대 8 주 동안 지속됩니다. <ol><li> 천천히 시작 호흡 할 때까지 빛 흡입 마취 (2.5 %의 세보)와 마우스를 마취. </li><li> 마우스를 위해 때때로 일시 천천히 콧 구멍에 염료 용액 40 μL (0.4 mM의 패스트 블루, 1 % 디메틸 설폭 사이드, DMSO, 포스페이트 완충 식염수, PBS)을 심어 여과 팁 200 μL 피펫을 사용하여이 용액을 흡입한다 (도 1A). </li><li> 수직으로 마우스를 잡고 헤드 업, 부드럽게 염료 폐 전체에 확산하기 위해 가슴을 마사지. </li></ol> 해부 및 분석의 날 2. 준비 <ol><li> 10 ml의 준비0 표 1에 명시된 성분을 조합하여 신경절 해리 용액 (GADS). </li><li> 전용 실험실 영역에서 RNA 추출을 수행합니다. 실험, 70 % 에탄올, 10 % 표백제와의 RNase의 오염 제거 시약과 깨끗한 표면을 시작하기 전에. 이 RNA 원심 분리기 모든 튜브 랙 및 피펫을 포함한다. RNA 사용만을위한 전용 필터 팁 박스가 있는지 확인합니다. 이 샘플을 오염 바와 같이, DNA의 준비를 위해이 장비와 영역을 사용하지 마십시오. </li><li> 의 RNA 분해 효소가없는 물을 신선한 70 %, 80 % 에탄올을 혼합한다. 샘플 당 1 ml의 RNA 추출에 사용될 준비한다. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 성분 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 고급 DMEM / F12 </td><td> 9.5 ml의 </td></tr><tr><td> 글루타민 </td><td> 100 μL </td></tr><tr><td> HEPES (10 밀리미터) </td><td> 100 μL </td></tr><tr><td> N2 보충 </td><td> 100 μL </td></tr><tr><td> B27 (NO 비타민 A) </td><td> 200 μL </td></tr><tr><td> NGF (50 μg의 / ㎖) </td><td> 10 μL </td></tr></tbody></table> 신경절 해리 솔루션 (GADS) 표 1. 시약의 혼합물. 3. 해부 절차 <ol><li> 500 μL GADS, 각 실험 샘플에 대한 하나의 긍정적 정렬 제어를위한 하나, 그리고 음의 정렬 제어를위한 하나의 1.5 ml의 튜브를 입력합니다. 해부에 걸쳐 얼음에 보관 튜브. </li><li> nodose 신경절을 해부 및 분리를 용이하게하기 위해 두 부분 컷을 한 후 실험 샘플 튜브에 넣어. nodose 신경절 (16)와 DRG (17)의 해부에 대해 다음 조브 프로토콜을 참조하십시오. </li><li> 정렬 컨트롤, 해부 및 부분적 지느러미 루트 신경절 (DRG)와 같은 비 표지 신경을 잘라. 양성 대조군과 두 gangli 두 신경절을 사용하여부정적인 제어를위한. </li><li> 성공적인 정렬을위한 충분한 nodose 신경 세포를 얻으려면 하나의 실험 샘플 튜브 포함 GADS에 5 쥐에서 신경을 결합한다. </li></ol> 4. 감각 신경절 해리 <ol><li> 관에 신경을 떠나, 500 μL의 GADS를 피펫. 신경절 후, 튜브의 바닥에 정착 PBS를 피펫을 위해 1 ml의 PBS를 추가하여 한 번에 신경을 씻어 기다립니다. </li><li> 1 ml의 GADS과 소화 효소의 22 μL (콜라게나 제 I / II 및 단백질 분해 효소 믹스, 2.5 ㎎ / ㎖에서 H 2 O)에 각 튜브를 추가합니다. </li><li> 양성 대조군 튜브에 20 μl의 빠른 블루 (5.26 mm)를 추가합니다. </li><li> 이미 37 ℃에서 설정된 수욕 또는 가열 블록에 튜브를 넣고. 참고 : 신경 소화의 시간은 소화 효소의 나이에 따라 달라집니다. 6개월 45 분 동안 소화 - (2) 내에 소화 효소를 용해 1 개월 내에 30 분 동안 소화. 효소가 6 개월 이상 된 경우, 신경 f를 소화또는 60 분. </li><li> 15 분마다 흔들어 튜브 짧게 신경을 보장하기 위해 그들을 가볍게는 솔루션이 적용됩니다. </li><li> 신경 소화되는 동안 입자 용액 (폴리 비닐 피 롤리 돈 코팅 된 콜로이드 실리카 입자)를 사용하여 농도 구배를 준비한다. <ol><li> GADS에서 12 % 입자 용액, 샘플 당 500 μl를 섞는다. </li><li> GADS에서 28 % 입자 용액, 샘플 당 500 μl를 섞는다. </li><li> 천천히 조심스럽게 각 샘플에 대한 신선한 1.5 ML 튜브에 400 ㎕의 28 % 농도의 용액의 상단에 400 μl의 12 % 밀도 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 두 층이 혼합하는 것을 허용하지 않습니다. 두 가지 층은 튜브에 표시한다 다른 것보다 어두운 하나. </li></ol></li><li> 신경이 소화되는 동안, (정렬 샘플 당 하나의 빠른 긍정적 인 블루와 하나의 빠른 블루 부정적인 튜브를) 정렬 새로운 1.5 ml의 수집 튜브 라벨. INTERFER하지 않도록 정렬 기능 요구에 따라,이 튜브는 착탈 뚜껑 있어야셀 소터와 전자. </li><li> 적절한 소화 시간 후, 소화 효소와 GADS를 제거하고 1 ml의 PBS로 두 번 신경을 씻는다. 각 튜브에 신선한 GADS 200 μl를 추가합니다. </li><li> 떨어져 세포를 파괴하기 위해 위아래로 여러 번 100 μl의 볼륨 설정 200 μL 피펫, 피펫의 신경을 사용합니다. 조직에는 손상 조각이 볼 수없는 때까지 반복합니다. 용액에 거품을 만들지 마십시오. </li><li> 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 해리 세포를 전달합니다. </li><li> 남아있는 나머지 길 잃은 셀을 선택하고 셀 스트레이너를 통해 추가 솔루션을 전달하는 원래 분리 튜브에 또 다른 100 μL의 GADS를 추가합니다. 새로운 피펫 팁을 사용하여 여과기를 통과 메시에 집착 한 나머지 세포 함유 액체를 수집합니다. GADS 현탁 세포의 최종 부피는 300 μL이다. </li><li> 조심스럽게 이전에 만든 밀도 기울기의 상단에 세포의 300 μl를 층. 거품을 피하고 C의 혼합밀도 레이어 ELL 학생. </li><li> RT에서 2,900 XG에서 10 분 동안 원심 분리기. </li><li> 세포를 원심 분리에있는 동안 다음, 용해 완충액 (실험 샘플 당 1 ml)에 섞어 10 ㎕의 2- 머 캅토 에탄올 (RNA 추출 키트) 1 ㎖의 완충액 RLT있다. <ol><li> 빠른 블루 긍정적 인 포집 관에 300 μL 용해 버퍼와 빠른 블루 음의 포집 관 (단계 4.7에서 표시 관) 600 μl를 추가합니다. 이 볼륨을 수집 할 예정 셀의 수에 의존한다. 7000 세포 600 μl를 추가 들어 &lt;2,000 세포, 300 μl를 추가&gt;가. 이것은 상당히 용해 완충 용액을 희석하지 않는 정렬 피복 유체를 보장한다. </li></ol></li><li> 원심 분리가 완료된 후, 조심스럽게 제거하고 700 ㎕의 상단 층을 버린다. 이 계층은 다른 세포 정렬을 방해 세포 파편의 대부분을 포함하고 있습니다. </li><li> 용액을 피펫 함유 나머지 셀에 700 μL의 신선한 GADS 추가테 위아래로 여러 번 혼합한다. </li><li> 세포 펠렛 2,900 XG에 15 분 동안 원심 분리기. </li><li> 세포를 원심 분리기에있는 동안, 1 ML의 GADS 5 μL의 DNase의 (10 ㎎ / ㎖)을 추가하여 GADS를 (샘플 당 500 μl를) 정렬 섞는다. </li><li> 원심 분리가 완료되면 조심스럽게 세포 펠렛을 떠나, 제거하고 상층 액을 버린다. </li><li> 다시 일시 정지 (200)에서 세포 펠렛 - 최대 피펫 팅하여 200 ㎕를 여러 번으로 설정 1,000 μL 피펫과 아래로 300 ㎕를 정렬 GADS를. 얼음에 샘플을 넣습니다. 셀은 정렬 할 준비가 된 것입니다. </li></ol> 5. 형광 활성 셀 (FAC) 정렬 참고 :이 섹션은 운영 FACS 분류기의 지식이나 숙련 된 인력의 도움을 필요로한다. <ol><li> 세포 생존 능력을 테스트하기 위해 각각의 샘플 1 ㎕의 요오드화 프로피 듐 (PI) 스톡 용액 (50 μg의 / ㎖)을 추가한다. 이 튜브, PI 하나 하나없이로 음성 대조군을 분할합니다. PI는 죽은 세포에서 DNA를 결합한다. 만약처음 몇 종류 후, PI의 사용이 필요하지 않은 레이블을 할 죽은 세포가 없습니다. </li><li> 전송 세포는 얼음에 예., BD FACS AriaII이, 디바 8 소프트웨어를 실행, 악기 유동 세포 계측법합니다. </li><li> 셀 크기는이 모집단에서 가변하기 때문에, 정렬에 많은 노즐 (100 μm의)을 사용한다. 응력 세포 경험의 양을 감소시키고 세포 생존력은 낮은 압력 (20 PSI)을 사용하여 증가한다. </li><li> 분석 플롯, 필요한 경우 앞으로 산란, 사이드 분산 형 (SSC), 패스트 블루, 그리고 PI를 설정하는 FACS 분류기 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 세포를 다시 일시 중단하려면, 부드럽게 분류기에로드하기 전에 샘플 잠시 소용돌이. </li><li> 게이트 임계 값 (그림 2A)를 설정, 음성 대조군, 더 빠른 블루 또는 PI로 시작합니다. 이 세포 집단의 자기 형광의 양을 결정할 것이다. 옵션 : 죽은 세포의 인구가 있는지 여부를 확인하는 PI와 음성 시료를 실행합니다. </li><li> (INC 양성 대조군 샘플을 정렬보상 매개 변수를 설정하기 위해) 빠른 블루와 ubated. </li><li> 문 및 매개 변수가 설정되면, 실험 샘플을 정렬 시작합니다. RNA 샘플을 용해 완충액을 포함하는 제조 수집 튜브로 정렬된다. </li><li> 셀 정렬이 완료 될 때까지 얼음에 정렬 된 샘플을 유지합니다. </li><li> 세포는 정렬 후 즉시 RNA 추출 단계를 시작한다. </li></ol> 6. RNA 추출 <ol><li> 1 분 동안 용해 버퍼에 소용돌이 분류 세포를 균질화한다. </li><li> 몇 번을 피펫 팅 아래로 70 % 에탄올과 혼합의 1 볼륨을 추가합니다. </li><li> 스핀 컬럼에 시료 700 ㎕의 최대 전송합니다. 8,000 × g으로 15 초 동안 원심 분리기. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. <ol><li> 시료의 총 부피가 스핀 컬럼을 통과 할 때까지 반복한다. </li></ol></li><li> 제조자 protoco에있어서, 상기 DNase를 처리 단계를 포함하는, 350 ㎕의 완충액 RW1을 추가하고 RNA 정제 과정을 계속셀 리터. </li><li> RNA 추출 된 후에, 제조자의 명세에 따른 전기 영동 미세 유체 시스템을 사용하여 RNA의 품질을 테스트한다. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

이 프로토콜은 미주 신경의 신경절에 nodose기도 - 근에 분포하는 신경 세포를 대상으로하는 방법을 설명한다. 일단 라벨링 신경절 부드럽게 최적 세포 수 및 생존력을 유지하기 위해 분해된다. 이들 뉴런은 FAC가 용해 버퍼에 직접 정렬 및 RNA를 추출 후이다. 이 프로토콜의 의미는, 분리 대상 및 특정 감각 세포 집단의 품질을 보존하는 능력이다. 유전자 발현은 신경이 작은 집단에서 설명되고, 기관...

체성 감각 신경은 열, 기계, 화학, 모두 내생과 환경 대리인에 의한 유해 자극을 형질 도입. 이러한 구 심성 신경의 세포 기관은 등 지느러미 루트, 삼차, 또는 nodose 신경절로, 감각 신경에 있습니다. 각각의 감각 신경절은 신체의 특정 지역을 innervates 및 해당 지역 내에서 별도의 기관과 조직을 신경을 분포시키다 세포가 포함되어 있습니다. 예를 들어, 후근 신경절 (DRG)가 척추에있는 및 삼차 신경은 두개골에있는 동안기도 1 위 얼굴, 눈, 수막 또는 신경을 분포시키다 뉴런을 포함, 몸과 팔다리에 걸쳐 프로세스를 확장, 2. 미주 신경의 nodose 신경 낮은기도와 폐에 3 두개골 아래 목에 위치하고 있으며, 위장관, 심장에 걸쳐 신경 섬유를 확장 세포 기관을 포함하고있다. 인간의 nodose 신경절 그러나, 마우스에이 융합 혼자 서또한 폐 (4)를 innervates 경정맥 신경절과 함께. 이 융합 된 신경절 자주 / 경정맥 nodose 복잡한, 미주 신경절이라고, 또는 단순히 nodose 신경절 5있다. 여기서,는 nodose 신경절로 지칭된다. nodose의 구 심성 섬유는 뇌간의 고독한 기관 (NTS)의 핵에 내장 정보를 전달합니다. 이 독특한 신경절에 감각 입력은 소화관 운동성 6, 심장 박동 7, 8, 9 호흡 및 자극 활성화 호흡 응답 10, 11와 같은 기능의 다양한 배열을 제어합니다. 기능과 신경 지배 기관의 다양성, 대상과 개인의 연결 경로를 연구하기 위해 nodose 신경절의 기관 고유의 소집단을 분리하는 것이 중요합니다. 그러나 nodose의 작은 크기와이 사소한 작업이 아니다 포함 뉴런의 수가 제한을 부여. 신경절 nodose 각 마우스는 약 5,000 뉴런 (12) 포함위성 세포를지지하는 광범위한 집단에 추가한다. 5 % 정신 자극기도 - 5,000 nodose 신경 만 3. 따라서 인해 호흡기 자극 또는 병리에기도 - 근에 분포하는 신경 세포 내의 기능적인 형태 또는 분자 변화는, 조밀하게 포장 nodose 신경절에서 손실됩니다. 이 문제를 해결하기 위해 방법을 식별하고기도에 분포 뉴런을 격리하기 위해 개발되었다. 기도는 이후의 근에 분포 nodose 뉴런을 식별하는 추적 형광 염료에 노출시켰다. 빠른 블루 신경 세포에 의해 포착하고이 최대 팔주 (13)에 대해 유지됩니다 자신의 세포 기관에 신속하게 이동했다 - 15. 일단 부드러운, 아직 효율적 해리 프로토콜은 형광 활성화 셀 (FAC) 정렬 염료 라벨 및 세포 생존을 유지하는 데 사용되었다 확인했다. 정렬 세포는 유전자 발현 또는 F를 결정하기 위해 고품질의 리보 핵산 (RNA)을 추출하는 데 사용됩니다또는 다른 다운 스트림 분자 분석. 이 프로토콜은 관심의 조직을 신경을 분포시키다 감각 뉴런을 분리하기위한 유용하고 강력한 기술을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Fast Blue</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>17740-2</td><td>stock 2 mg/ml in water</td></tr><tr><td>NeuroTrace 530/615 red Nissle stain</td><td>Life Technologies</td><td>N21482</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>glutamine (Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 (no vitamin A)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor (NGF)</td><td>Sigma</td><td>N6009</td><td>stock 50 &amp;micro;g/ml in PBS/10% FBS</td></tr><tr><td>digestion enzyme, Liberase DH Research Grade</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td>stock 2.5 mg/ml in water</td></tr><tr><td>particle solution (Percoll)</td><td>Sigma</td><td>P1644-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Heating block</td><td>LabNet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>RNase free water</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2484-100</td><td></td></tr><tr><td>RNase decontamination reagent, RNase AWAY</td><td>invitrogen</td><td>10328-011</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>VWR</td><td>EM-6010</td><td></td></tr><tr><td>RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>DNase kit, RNase-Free DNase Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Sigma</td><td>P4170-10MG</td><td>stock 10 &amp;micro;g/ml in PBS</td></tr><tr><td>Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200)</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a method to target and isolate airway-innervating sensory neurons in mice

체성 감각 신경은 열, 기계, 화학, 모두 내생과 환경 대리인에 의한 유해 자극을 형질 도입. 이러한 구 심성 신경 세포의 세포 기관은 감각 신경절 내에 위치하고 있습니다. 감각 신경은 신체의 특정 기관 또는 부분에 분포. 예를 들어, 후근 신경절 (DRG)가 척추에있는 신체 사지에 걸쳐 프로세스를 연장한다. 삼차 신경은 두개골에있는 얼굴을 신경을 분포시키다, 상부기도한다. nodose 신경절의 미주 구 심성은 창자, 심장, 폐를 통해 확장 할 수 있습니다. 호흡,기도 자극, 기침 반사 신경 다음 nodose 뉴런과 같은 기능의 다양한 배열을 제어 할 수 있습니다. 따라서, 이해하고 기능을 조작하기 위해서는기도 특정 신경 하위 집단을 확인하고 분리하는 것이 매우 중요하다. 마우스에서,기도는기도 별 nodose 신경 세포의 역행 추적을위한 형광 추적 염료, 빠른 블루,에 노출에스. nodose 신경이 분해되고 형광 활성화 셀 (FAC) 정렬은 염료 양성 세포를 수집하는 데 사용됩니다. 다음으로, 고품질의 리보 핵산 (RNA)가 차세대 시퀀싱 염색 양성 세포로부터 추출된다. 특정 신경 세포의 유전자 발현이 결정되는이 방법의기도를 사용.

이 방법을 사용하여,기도 - 근에 분포하는 신경 세포는 비강 빠른 블루 (그림 1A)를 주입하여 표시되어 있습니다. 이일 후, 빠른 블루 라벨 세포는 nodose 신경절 (그림 1C)에 나타납니다. nodose 신경절의 총 신경 인구의 5 % -이 세포들은 3을 차지합니다. 이러한 목적을 위해 사용 된 다른 역행 염료 DII (1,1&#39;- 디 옥타 데실 3,3,3 &#39;, 3&#39;- tetramethylindocarb...

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A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

Method는 목표와 마우스의 격리기도 - 근에 분포하는 감각 뉴런하기

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.1K 조회수.  Yale University. Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

비디오: A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

에어웨이 저항 측정 및 마우스에 Bronchoalveolar 세척 유체 샘플링에 대한 가역, 비침습 방법

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

연구

생물학

Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and either cut or crush it to induce peripheral nerve injury. Advantages of this surgery are its simplicity, high reproducibility, and the lack of effect on vital functions or mobility from the subsequent facial paralysis, thus resulting in a relatively mild surgical outcome compared to other nerve injury models. A major advantage of using a cranial nerve injury model is that the motoneurons reside in a relatively homogenous population in the facial motor nucleus in the pons, simplifying the study of the motoneuron cell bodies. Because of the symmetrical nature of facial nerve innervation and the lack of crosstalk between the facial motor nuclei, the operation can be performed unilaterally with the unaxotomized side serving as a paired internal control. A variety of analyses can be performed postoperatively to assess the physiologic response, details of which are beyond the scope of this article. For example, recovery of muscle function can serve as a behavioral marker for reinnervation, or the motoneurons can be quantified to measure cell survival. Additionally, the motoneurons can be accurately captured using laser microdissection for molecular analysis. Because the facial nerve axotomy is minimally invasive and well tolerated, it can be utilized on a wide variety of genetically modified mice. Also, this surgery model can be used to analyze the effectiveness of peripheral nerve injury treatments. Facial nerve injury provides a means for investigating not only motoneurons, but also the responses of the central and peripheral glial microenvironment, immune system, and target musculature. The facial nerve injury model is a widely accepted peripheral nerve injury model that serves as a powerful tool for studying nerve injury and regeneration.

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

마우스의 얼굴 신경 Axotomy : 부상으로 운동 신경 응답을 연구하는 모델

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and ...

의학

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

청각 통로의 Optogenetic 자극에 대한 쥐의 등쪽 달팽이 핵의 직접 시각화

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

신경과학

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of available mating partners or threats. In mice, this task is executed primarily by the olfactory system and its underlying subsystems, including the main and accessory olfactory systems. Both have peripheral organs populated by sensory neurons expressing G-protein coupled receptors able to bind chemical cues that reach the nasal cavity. Even though the molecular characteristics of these receptors is well understood, little is known about their cognate specific ligands. The method described here combines in situ hybridization detection of olfactory or vomeronasal receptors with immunodetection of phosphorylated ribosomal protein S6 (pS6) - a marker of neuronal activation. This protocol was devised to identify neurons activated after a single event of exposure to purified or complex chemical stimuli detected by the olfactory organs. Importantly, this technique allows the investigation of neurons triggered in biologically relevant contexts. Ideally, this method should be used to probe the molecular biology of the olfactory system and to study olfactory behaviors.

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

This protocol combines in situ hybridization with immunofluorescence to identify olfactory and vomeronasal receptor genes expressed in olfactory sensory neurons after activation by chemical stimuli in the mouse.

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of ...

마우스 교감신경 신경 세포 표적화: 요추 교감신경 절제술 접근법

Surgical Lumbar Sympathectomy in Mice

Peripheral nerve injuries are common, and full functional recovery after injury is achieved in only 10% of patients. The sympathetic nervous system plays many critical roles in maintaining bodily homeostasis, but it has rarely been studied in the context of peripheral nerve injury. The extent of postganglionic sympathetic neuronal functions in distal targets in the periphery is currently unclear. To better explore the role of sympathetic innervation of peripheral targets, a surgical &#34;knock-out&#34; model provides an alternative approach. Although this can be achieved chemically, chemical destruction of postganglionic sympathetic neurons can be nonspecific and dose-dependent. The use of a surgical lumbar sympathectomy in mice, once thought to be &#34;virtually not practicable&#34; in small animals, allows for specific targeting of postganglionic sympathetic neurons that innervate the hind limbs. This manuscript describes how to surgically remove the L2-L5 lumbar sympathetic ganglia from a mouse as a survival surgery, which reliably decreases the hind paw sweat response and the number of sympathetic axons in the sciatic nerve.

저자 스포트라이트: 교감신경 뉴런의 가소성 탐구

This manuscript presents a protocol for surgically removing the postganglionic lumbar sympathetic neurons from a mouse. This procedure will facilitate a multitude of studies aimed at investigating the role of sympathetic innervation in distal tissue targets.

생쥐의 외과적 요추 교감신경 절제술

Peripheral nerve injuries are common, and full functional recovery after injury is achieved in only 10% of patients. The sympathetic nervous system plays ...

Method는 목표와 마우스의 격리기도 - 근에 분포하는 감각 뉴런하기

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에어웨이 저항 측정 및 마우스에 Bronchoalveolar 세척 유체 샘플링에 대한 가역, 비침습 방법

마우스의 얼굴 신경 Axotomy : 부상으로 운동 신경 응답을 연구하는 모델

청각 통로의 Optogenetic 자극에 대한 쥐의 등쪽 달팽이 핵의 직접 시각화

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

생쥐의 외과적 요추 교감신경 절제술

생쥐의 외과적 요추 교감신경 절제술

생쥐의 외과적 요추 교감신경 절제술