크리스 Ngai이 프로젝트들의 지원과 도움 제이슨 델 리오에 대한 특별 감사합니다. 이 작품은 RO1 SPG에 부여 GM070676에 의해 지원되었다.

파리의 변종이 구입하여 실험실에서 증폭하실 수 있습니다. 받은 Drosophila 문화 튜브의 크기에 따라 하나는 자주 일단 튜브가 최대 용량에 도달했습니다, 문화 튜브를 &#39;뒤집기&#39;해야합니다. 약 50 Drosophila 문화 튜브가 채워진까지 확대가 계속됩니다. 한 후 (컵 만들기 들아 다음 섹션에서 논의된다) 100 ML tricorn 비커로 &#39;컵 비행을&#39;있습니다. 24 시간 이내에, 아래쪽에 부착된 플라이 음식이 컵에서 종자 새로운 Drosophila 문화 유리병에 배아를 사용합니다. 실온에서 하룻밤 배아에서 전체 재배 파리에 Drosophila의 배아의 성장 시간은 약 8.5 일 수 있습니다. 씨앗을 품고 배아는 첫 번째 애벌레 단계로 12~15시간 후에 부화. 유충 약 4 일 부화 후 24 및 48 시간에, 두 번째 및 세 번째 애벌레 단계로 두 번 털갈이를 위해 성장. 애벌레 다음 pupariums로 캡슐과 T에서 신흥까지 4 일간의 변형에 제출후계자 pupal 가지 경우 1. 각 파리의 양을 증가 Drosophila 문화 유리병에 세 할 약 일간 더 성장하실 수 있습니다. 400 튜브가 채워진 경우, 50 달걀 누워 컵 (잔 당 약 1,000여 파리)에 대한 파리 충분한 양의있을 것입니다. 파리들은 새로운 환경에 적응하는데 시간이 필요합니다. 그것은 보통 종이컵에 전송 후, 컬렉션에 대한 준비를 그들을 위해 이틀 정도 걸립니다. 일일 한천 번호판을 교체하는 것은 파리가 더 오래 살 수있는 파리 컵 깨끗하게 유지됩니다. (Drosophila 관리 및 증폭에 대한 이해를 들면, DB 로버츠 &#39;Drosophila를 참조하십시오 : 실용 접근법 2). Drosophila의 배아의 대량 취득하는 좋은 소스가 상업적으로 사용할 수있는 인구 케이지 3입니다. 인구 케이지의 조립 및 유지 보수는 책에 Drosophila Melanogaster에 제 5 장 및 7에서 볼 수 : P세포 및 분자 생물학 4 ractical 용도. 그러나 인구 연습장은 비싼이며 유지 관리가 어렵다. 인구 케이지는 파리의 풍부한 양을 저장할 수 있기 때문에 이산화탄소의 사용은 파리를 전송하고 먹이가 필요합니다. 전에 언급한 바와 같이, 이산화탄소뿐만 누워 말라고의 원인, 파리의 건강을 감소시킵니다. 작은 규모에, 100 ML tricorn의 비커를 사용할 수 있습니다. 쉰 100 ML의 비커로 dechorionated 배아의 9g을 획득 수 있습니다. 위해서는 우리가 서로 다른 메쉬 크기로 이중 계층 체의 포수를 만들었 죽은 파리, 미사용 효모 붙여넣기 및 기타 불순물을 제거합니다. 죽은 파리와 같은 하나의 체 트랩 원하지 않는 자료 배아는 (350 마이크론 기공 크기)를 통과하도록 허용하는 동시에. 두번째 부분은 메쉬 통과하게된다 Drosophila의 배아 및 기타 불순물을 잡는 의미 메쉬 (120 미크론의 기공 크기)를 포함합니다. 1. 컵 준비 및 배아 컬렉션 들아 <ol><li> 뒤집기빈 플라스틱 약병을 여러 개의 튜브에서 증폭 파리가까지 파리의 양은 유리병의 높이 1 인치에 도달했습니다. 다음 100 ML 계란 컬렉션 컵 (나일론 메쉬 창문 tricon의 비커)에 그 파리를 전송합니다. 파리를 전송할 때 파리의 탈출을 방지하기 위해 하드 표면에 잔을 도청 유지. 한천 플레이트가 들어있는 효모 페이스트와 컵 커버 및 안정화 시간은 24-48 시간을 허용합니다. </li><li> 쉰 플라이 컵에서 하룻밤 한천 플레이트를 수집하고 깨끗한 페인트 브러시 및 실행 물을 사용하여 체의 포수로 접시의 내용을 씻는다. 육체는 모든 효모 페이스트는 물이 가득한 체의 배아를 씻겨 때까지. </li><li> 3 분 동안 50 %의 표백제에 그들을 immersing하여 청소 배아를 Dechorionate. </li><li> 배아 표백제 냄새 느슨한까지 광범위하게 증류수로 씻어. 그런 다음 AC 접이식 수건으로 여러 번 그것을 배치하여 배아와 메쉬를 건조시키십시오. 깨끗한 유리병에 배아를 전송하고 체중을 기록합니다. &lt;/ 리&gt; </ol> 2. 배아 균질화 및 명시 <ol><li> 얼음처럼 차가운 추출 버퍼의 1.5 X 볼륨으로 다운스 호모 지 나이저에 dechorionated 배아를 놓습니다. </li><li> 느슨한 유봉과 함께 5 스트로크를 해. 깨끗한 원심 분리기 튜브로 나누어지는 homogenate합니다. 40 분 동안 15,000g에서 원심 분리기. 4에 ° C. </li><li> 위쪽 흰색 지질 층 또는 낮은 펠렛없이 맑은 뜨는 액체를 조심스럽게를 수집합니다. </li><li> 원심 분리기 튜브를 청소하고 30 분 동안 50,000g에서 원심 분리기에 뜨는 전송합니다. 4에 ° C </li><li> 위에서 설명했던 것과 같이 수집된 결과 고속 뜨는 즉시 사용할 수 또는 개월간 냉동 및 -80 ° C에 저장된 스냅이 될 수 있습니다. </li></ol> 3. 미세 소관의 중합 및 Kinesin 바인딩 <ol><li> 실내 온도에 냉동 고속 뜨는을 녹여. , microtubules을 중합 GTP (0.3 ㎜)와 taxol (20 μm의) 추가하고 20 분 동안 실온에서 부드럽게 선동하려면회전 흔드는. </li><li> kinesin을 바인딩하려면 회전 통에 상온에서 10 분 교반 다음에 2.5 밀리미터 nonhydrolyzable ATP 아날로그 5&#39;-adenylyl imidodiphosphate (AMPPNP)를 추가합니다. </li></ol> 4. Microtubules 및 Kinesin의 차동 침강 <ol><li> 30 분 대한 2만3천그램 (sw41ti 로터, TLS-55)에서 원심 분리하여 동일한 볼륨 자당 쿠션 (추출 버퍼에 20 % 자당 및 10 μm의 제품 taxol)를 통해 침전물. 4에 ° C. </li><li> 10 μm의 제품 taxol 75 MM NaCl을 포함한 추출 버퍼에 원래 homogenate 볼륨의 10 %에 resuspension하여 펠렛 씻으십시오. </li><li> 단계 4.1에서와 같이 다른 동등한 볼륨 자당 쿠션과 침강을 반복합니다. </li><li> 20 μm의 taxol, 75 MM NaCl, 10 MM MgSO 4, 및 10 밀리미터 ATP로 5 % 추출 버퍼에 소금 세차에서 펠릿를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 4에 20 분 대한 ° C. 120,000그램 (42,000 RPM : 31,000 RPM, TLS-55 sw41ti 로터)의 침전물 뜨는을 (kinesin 수집분수). </li><li> 4 15 분 14,000그램에서 원심 여과 ° C를 수행 농축 샘플을 복구하고 30 분 이상 같은 새 필터로 여과를 반복하여 농축 샘플을 수집합니다. </li><li> 농도를 결정하는 단백질 분석을 수행합니다. 간단히, 알려진 단백질의 농도를 변화시키는 것은 (소 혈청 알부민, BSA) 브래드 포드 시약의 알려진 볼륨과 혼합하고 파장 595nm에서 광학 밀도를 측정했습니다. 그렇다면 광학 밀도 대 농도 표준 곡선은 표준 BSA 샘플 있으므로 유사한 조건 하에서 측정이 샘플의 광학 밀도를 사용하여 kinesin 분획을 정제의 미지의 농도를 계산하기 위해 설립되었습니다. 젤 전기 영동은 물론 서양의 모래 바닥도 정화 kinesin의 알려진 금액을 사용하여 수행되었다. </li><li> 액체 질소에서 원하는 농도와 스냅 동결 작은 볼륨으로 나누어지는의 kinesin 분율은 -80에 저장합니다 ° C. </li></ol> 전체 길이 기능성 Kinesin은 Drosophila의 배아에서 정화되었다. 그림 1은 정화하는 동안 다른 분수를 보여주는 실버 스테인드 젤 모습. 레인 1은 명확 후 고속 뜨는 (단계 2.5)의 예제이고, 차선 2 명확 후 펠렛의 표본이며, 레인 3 자당 쿠션있는 최초의 침강 (단계 4.1) 이후 차선 4 뜨는의 샘플입니다 펠렛의 예제는 첫 번째 침강 후 차선 5 번째 침강 (단계 4.3) 이후에 뜨는의 예제입니다, 차선 6 번째 침강 후 펠렛의 표본이며, 레인 7의 펠렛의 견본입니다 최종 침전 (4.5 단계), 차선 8 정화 kinesin 샘플이며, 레인 9 필터링된 kinesin 샘플이며, 레인 10 마커입니다. 115 주위 KD에서 레인 8 9 농축 밴드 Figur과 일치 kinesin 무거운 체인 1입니다E 1, 1988 5 게시된 Saxton 용지의 레인 8. 그림 2는 정화 kinesin 분율의 C 서양 얼룩을 나타내는가 kinesin 중쇄 항체를 사용하여 감지. 항체 AKINO1 - 크게 다른 kinesin의 가족 6 교차 반응하지 않습니다. 참고이기는하지만 분수는 kinesin-1에 대한 풍부한하는 동안 잠재적으로 다른 kinesins 및 기타 모터 단백질을 포함 가능성이 오염 있는데, 기능성 kinesin의 좋은 원천이 프로토콜은 결과를. 우리는 여과하여 작은 오염 물질의 종류를 제거했습니다. 멀리 혼자의 크기로 할 수없는 다른 모터를 제거로 정화는 kinesin 7을 공부하고 다른 사람에 의해 수행하고 있었는지와 유사한, 우리는 적극적으로 모터의 대부분 Kinesin-1입니다 있다고 생각하지만,보다 정교한 정화가 허용됩니다 같은 잠재적인 모터 오염 물질의 제거는 콜 외 8 Saxton 외 의해 수행되었다 9. </p&gt; kinesin의 processivity가로 &quot;모터 단백질에 대한 운동성 분석&quot;10 자격 Scholey하여 책에 자세히 설명되어 체외 단일 분자 미세 소관 결합 분석에 의해 평가되었다. 간단히, 단일 활성 모터 폴리스티렌 구슬은 포화의 존재 (1 ㎜) ATP에 미세 소관과 접촉 반입되었다. 모터 미세 소관에 붙어 있으며 레이저 트랩의 중심 꿈쩍도 시작했다. 트랩 센터 (100 nm의)에서 구슬의 사전 정의된 변위에서 레이저 빔을 전원이 자동으로 모터가 부하없이 MT를 따라 걸을 수 있도록 해제되었다. 영화는 MT를 따라 도보로 하나의 kinesin과 구슬 500 nm의 직경을 보여줍니다. 비디오 화면의 길이는 20 μm의에 해당합니다. 그림 3은 여기에 제시된 프로토콜에 따라 정화, 하나의 장편 Drosophila kinesin 분자에 대한 런타임 길이의 측정 분포를 나타냅니다. exponenti알이 배포에 맞게하는 것은 하나의 kinesin 1.55의 평균 runlength ± 0.1 μm의 및 1.28 ± 필터링 및 필터없는 샘플을위한 0.12 μm의 각각을 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1은 정화 분수의 실버 스테인드 겔 :. 샘플 각 분획으로부터는 10 % 젤에서 실행되었다. 단백질 10 μg은 각 차선에로드되었습니다. 레인 1은 명확 후 고속 뜨는 (단계 2.5)의 예제이고, 차선 2 명확 후 펠렛의 표본이며, 레인 3 자당 쿠션있는 최초의 침강 (단계 4.1) 이후 차선 4 뜨는의 샘플입니다 펠렛의 예제는 첫 번째 침강 후 차선 5 번째 침강 (단계 4.3) 이후에 뜨는의 예제입니다, 차선 6 번째 침강 후 펠렛의 표본이며, 레인 7의 펠렛의 견본입니다 최종 침전 (4.5 단계), 차선 8 정화 kinesin이다샘플 레인 9 100 KD 컷 - 오프 Amicon 울트라 0.5 ML 원심 필터 (Millipore, 미국)를 사용하여 필터링 kinesin이다. 파란 화살표가 누구 금액 감소와 빨간색 화살표가이 프로토콜에 사용되는 원심 여과 단계로 인해 kinesin의 농도를 표시했습니다 단백질을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig2.jpg" alt="그림 2" /> . 그림 2 정화 KHC 분율는 안티 kinesin 항체에 대해 blotted : 정화 kinesin 샘플 AKINO1가 - 1 시간 정도합니다 (TBST에 1:1,000) 상온에서 부화 다음 겔 전기 영동에 노출 및 기본 항체에 대해 (nitrocellulose 막에서) blotted되었습니다 상온에서 시간 동안의 돈키 - 안티 - 토끼 항체 (TBST에서 1:10,000). ECL (chemiluminescent) 키트는 위의 그림 kinesin 신호를 감지하는 데 사용되었다. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. </strong단일 Drosophila 전체 길이 kinesin의&gt; Runlength과 속도 ()와 (B) 필터링 kinesin 샘플의 Runlength과 속도. (C)와 (D) 필터없는 kinesin 샘플의 Runlength과 속도. 그림 4. Kinesin의 운동성의 비디오. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3501/3501movie4.avi" target="_blank">비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

<ol>
	<li>Ashburner, M., Thompson, J. N., Ashburner, M., Wright, T. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+culture+of+Drosophila+2A.">The laboratory culture of Drosophila 2A.</a> The genetics and biology of Drosophila. , 1-81 (1978).</li><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , (1998).</li><li>Kunert, N., Brehm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+Drosophila+Embryosand+Chromatographic+Purification+of+Native+Protein+Complexes.">Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).</li><li>Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+Uses+in+Cell+and+Molecular+Biology.">Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+kinesin:+Characterization+of+microtubule+motility+and+ATPase.">Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).</li><li>Shubeita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets.">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1098 (2008).</li><li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+Velocity+Measured+for+Single+Kinesin+Molecules.">Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules.</a> Cell. 77, 773 (1994).</li><li>Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"Slow"+Homotetrameric+Kinesin-related+Motor+Protein+Purified+from+Drosophila+embryos.">A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos.</a> J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Microtuble+Motor+Proteins.">Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins.</a> Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).</li><li>Scholey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+Assay+for+Motor+Proteins.">Motility Assay for Motor Proteins.</a> Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).</li><li>Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+kinesin+from+bovine+brain+and+assay+of+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).</li><li>Aizawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+Family+in+Murine+Nerwous+System.">Kinesin Family in Murine Nerwous System.</a> The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).</li><li>Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoplasmic+dynein+tail+mutation+impairs+motor+processivity.">A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity.</a> Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).</li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

murine 두뇌는 물론 12 사용되고 있지만 소의 머리, 전신 kinesin을 정화하기 위해 가장 널리 사용되는 출발 물질 11. kinesin 원본으로 소 두뇌를 사용하는 큰 단점은 신선한 시작하는 자료를 사용할 수있다 : slaughterhouses은 일반적으로 액세스할 수 있으며, 두뇌 활성 kinesin를 얻기 위해 매우 신선해야합니다. 또한, 젊은 암소만을 두뇌가 효과적입니다. 마지막으로, 암소의 유전자 조작은 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 또는 재료의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 한천 (과립) </td><td> 어부 </td><td> 1423-500 </td><td></td></tr><tr><td> 덱스 트로 오스 (D-포도당) 무수 </td><td> 어부 </td><td> D16-3 </td><td></td></tr><tr><td> 배양 접시 </td><td> Becton </td><td> 35 1007 </td><td> 60x15mm 스타일 (폴리에스터) 20/bag </td></tr><tr><td> Drosophila 문화 튜브 </td><td> UCI </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tricorn의 비이커 </td><td> 이코노 연구소 주식 회사 </td><td> B700-100 </td><td> 볼륨 : 100ml, 크기 : 58x72mm </td></tr><tr><td> 누룩 </td><td> 레드 스타 </td><td> 2751 </td><td></td></tr><tr><td> 나일론 메쉬 </td><td> Genesse 과학 </td><td> 57-102 </td><td> 120micron의 기공 크기 </td></tr><tr><td> 나일론 메쉬 </td><td> 소형 부품 </td><td> 06-350/35 </td><td></td></tr><tr><td> 파이프 </td><td> 시그마 </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> 파이프 </td><td> 시그마 </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> 어부 </td><td> 56-81-5 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 시그마 </td><td> 67-42-5 </td><td></td></tr><tr><td> MgS0 4 (무수) </td><td> 어부 </td><td> 7487-88-9 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 시그마 </td><td> 329-98-6 </td><td></td></tr><tr><td> 류펩틴 </td><td> 시그마 </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=103476-89-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">103476-89-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> Aprotonin </td><td> 시그마 </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=9087-70-1&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">9087-70-1</a> </td><td></td></tr><tr><td> 길들이다 </td><td> 시그마 </td><td> 178403-8 </td><td></td></tr><tr><td> STI </td><td> Calbiochem </td><td> 65,635 </td><td></td></tr><tr><td> GTP </td><td> 시그마 </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=36051-31-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">36051-31-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> Taxol </td><td> 시그마 </td><td> 33069-62-4 </td><td></td></tr><tr><td> ATP 아날로그 5&#39;-adenylyl imidodiphosphate </td><td> 시그마 </td><td> 3605-31-7 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7647-14-5 </td><td></td></tr><tr><td> ATP </td><td> 시그마 </td><td> 74804-12-9 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon 울트라 원심 필터 : 0.5 ML, 100kD가 잘려, 8 팩 </td><td> Millipore </td><td> UFC510008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and purification of kinesin from drosophila embryos

모터 단백질은 microtubules 따라 cargos를 이동하고, 구체적인 하위 세포 위치로 그들을 수송. 변경된 전송이 미세 소관 기반 모터 수송 및 그 규정을 이해하고, neurodegenerative 질병의 다양한 기초하도록 권장되기 때문에 가능성이 궁극적으로 향상된 치료 접근법으로 이어질 것입니다. Kinesin-1은 ATP의 가수 분해에 의해 구동 microtubules (MTS)를 따라 anterograde (플러스 엔드) 방향으로 이동 진핵세포 모터 단백질이다. 여기에서 우리는 따라서 단일 분자 biophysical 연구와 Drosophila 유전자의 조합을 허용, Drosophila의 배아에서 활성 전체 길이 kinesin를 분리하기위한 세부적인 정화 프로토콜을보고합니다. 잔 당 약 1000 여성과 함께 약 50 누워있는 컵 것부터 시작해서, 우리는 밤새 컬렉션을 수행. 이것은 포장 배아들 중 약 10 ML을 제공했습니다. 배아는 (배아의 약 9g을하였으며) dechorionated 표백했다, 그리고 균질. AFter 장애는 homogenate는 고속 원심 분리에 의해 다음 저속 회전을 사용하여 명확히했다. 명확히 뜨는는 MTS를 중합하기 위해 GTP와 taxol로 치료되었다. Kinesin는 ATP 아날로그, 상온에서 5&#39;-adenylyl imidodiphosphate을 추가하여 polymerized MTS에 고정화되었다. kinesin 구속력 후 microtubules은 자당 쿠션을 통해 고속 원심 분리를 통해 sedimented되었다. 미세 소관 펠렛 그런 다음 다시 중지되고,이 과정이 반복되었다. 마지막으로 ATP는 MTS에서 kinesin을 출시하도록 추가되었습니다. 고속 원심 분리 후 뜨는에서 kinesin두고, MTS를 불러 냈어요. 이 kinesin이 더 정화를 위해 필터 100 KD 인하를 이용하여 원심 여과를 받게되었다 aliquoted, 액체 질소에 냉동 및 -80 ° C.에 저장된 스냅 모래 바닥 SDS 겔 전기 영동과 서양은 정화 샘플을 사용하여 수행되었다. 최종 원심 여과 단계 전후 정화 샘플 모터 활동체외 단일 분자 미세 소관 분석에 사용하여 평가되었다. 이전 문헌에 보고된대로 원심 여과 전후 kinesin의 분수는 processivity을 보여주었다. 또한 실험 kinesin 및 기타 운송 관련 단백질 간의 상호 작용을 평가할 진행되고 있습니다.

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Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

이것은에서 활성 전체 길이 Kinesin를 분리하는 프로토콜입니다<em&gt; Drosophila</em&gt; 단일 분자 biophysical 연구를위한 배아. 우리는 배아를 수집 배아 lysate를 확인한 다음 microtubules (MTS)를 중합하는 방법을 보여줍니다. Kinesin는 MTS에 immobilizing Kinesin-MT 컴플렉스를 회전 후 ATP 첨가를 통해 MTS에서 kinesin를 공개함으로써 정화된다.

Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

12.1K 조회수.  University of California, Irvine. 이것은에서 활성 전체 길이 Kinesin를 분리하는 프로토콜입니다 Drosophila 단일 분자 biophysical 연구를위한 배아. 우리는 배아를 수집 배아 lysate를 확인한 다음 microtubules (MTS)를 중합하는 방법을 보여줍니다. Kinesin는 MTS에 immobilizing Kinesin-MT 컴플렉스를 회전 후 ATP 첨가를 통해 MTS에서 kinesin를 공개함으로써 정화된다.

비디오: Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Midgastrula 스테이지 Drosophila의 태아에서 문화의 연결 준비

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

연구

생물학

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

의 분리 및 정제 Drosophila</em마그네틱 비드별로 정렬> 주변 뉴런

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

Drosophila의 배아들 중에서 - 생체내의 원심 분리

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

의 입식 이미징 Drosophila 태아

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

에서 기본 셀 문화 Drosophila Gastrula의 태아

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

의 분리 Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

성적 증명서와 Metabolites에서의 정화<em&gt; Drosophila</em&gt; 헤드

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...