이 방법은 생체 내 장기간 마우스 양자 피질 영역전반에 걸쳐 신경 활성의 기록 및 정량화를 가능하게 한다. 2개의 광자 기술은 연장된 기간 동안 크고 분산된 신경 인구에서 동시에 활동을 검출하는 이점이 있습니다. 이 기술의 의미는 살아있는 두뇌의 다른 지구에 있는 정의된 신경 인구에 있는 활동 패턴의 조사를 향해 확장했습니다.
시술을 시작하기 12 시간 전에 광학 창문을 섭씨 50도에서 70 %의 에탄올로 데우습니다. 광학 창은 둥근 5mm 직경 상단 커버 유리와 3mm 직경 의 커버 유리를 포함하는 하단 부분으로 구성됩니다. 온난화 인큐베이션이 끝나면 마취 된 20 ~ 25 그램 1 1/2 ~ 2 개월 된 Thy1 GCaMP6s 마우스에 발가락 핀치에 대한 반응부족을 확인하고 동물의 눈에 연고를 적용하십시오.
멸균 커튼으로 덮인 가열 패드에 마우스를 놓고 마우스가 머리를 안정시키기 위해 헤드 홀딩 어댑터를 사용합니다. 두피의 대부분을 2가장자리 면도기로 면도하고 순차적인 멸균 알코올 준비 패드와 포비도요오드 용액 스크럽으로 노출된 피부를 청소하십시오. 그런 다음 한 쌍의 가위를 사용하여 두개골 의 오른쪽에있는 두피에 직사각형 2 mm를 3 밀리미터 잘라냅니다.
면 봉면을 사용하여 피부를 옆으로 밀어 직경이 3밀리미터 이상인 노출 영역을 만들고 무딘 미세 수술 블레이드를 사용하여 두개골에 부착된 결합 조직을 부드럽게 제거합니다. 치과 훈련을 통해 S1 영역 주변에 직경 3mm원을 부드럽게 표시합니다. 두개골의 왼쪽에 유사한 원을 만든 후, 치아 노아크라이레이트 초접착제의 얇은 층을 뼈의 양쪽에 적용하여 치과 시멘트 응용 프로그램을 위한 베이스를 제공합니다.
해부 현미경에서 고속 마이크로 드릴을 사용하여 S1 영역 주변의 두개골 오른쪽에 있는 원형 홈을 얇게 하여 매끄러운 가장자리를 만들어 필요에 따라 진공으로 뼈 잔해를 흡입합니다. 약 2/3 의 뼈 깊이가 달성 된 후, 원형 뼈 플랩이 완전히 주변 두개골에서 풀려날 때까지 뼈의 나머지 1/3을 천천히 조심스럽게 얇게 합니다. 5/45 개의 집게 쌍을 사용하여 뼈의 원형 조각을 천천히 조심스럽게 제거하여 두라를 노출시키고 피알 혈관을 손상시키지 않도록주의하십시오.
같은 방식으로 두개골의 왼쪽에서 뼈 플랩을 제거 한 후, 멸균 식염수로 두개골의 오른쪽에 대한 광학 창을 헹구고 스테레오 현미경으로 결함을 확인합니다. 두개골에 놓여있는 창의 상단 부분과 두개골 개구부 내의 하단 부분으로 두개골 위에 광학 창을 설치하여 대뇌 척수액이있는 두라에 놓여 있습니다. 시아노아크라일레이트 슈퍼 접착제를 사용하여 광학 창 가장자리의 상단 부분을 두개골에 밀봉합니다.
접착제가 건조되면, 유리의 가장자리에 검은 치과 시멘트를 적용, 노출 된 두개골의 오른쪽의 나머지, 빛을 차단하기 위해 상처 여백. 그런 다음 왼쪽 광학 창을 설치하고 동물이 전체 재조정될 때까지 모니터링하여 복구할 수 있도록 합니다. 시술 후 7~10일 후, 마취된 동물을 2광현미경아래 가열패드에 헤드 홀딩 어댑터에 배치하여, 두개골의 광학 창과 오른쪽은 현미경의 광학 축에 수직으로 지향되는 것을 주의한다.
4배 배율에서 밝은 필드 조명을 사용하여 두개골 창의 초기 참조 맵 이미지를 획득합니다. 관심 의 동일한 영역의 여러 이미지를 수집 한 후, 왼쪽 반구의 S1 영역 내에서 칼슘 역학을 이미지와 두개골의 양쪽에 관심의 각 영역에서 형광의 변화를 계산합니다. 이러한 대표적인 이미지에서, EGFP 발현 마우스 내의 원점 및 혈관은 광학 창 설치 후 하루 에 S1 영역의 2층에서 서로 다른 깊이에서 시각화되었다.
Z 프로젝션 이미지는 광학 창 이식 후 1일과 7일에 캡처되어 실험 기간 동안 수지상 가지및 척추의 매우 안정적인 수와 위치를 보여줍니다. Thy1 GCaMP6s 의 세포내 칼슘 과도 측정을 통해 피아 아래 500 마이크로미터 보다 깊은 곳에 위치한 5층 피라미드 뉴런의 자발적인 칼슘 활성 및 집단의 정량화를 허용하고 시간이 지남에 따라 자발적반응의 평균 수를 계산할 수 있다. 두개골 창 준비와 생체 내 2광자 칼슘 이미징 기술 모두에서 훈련된 연구원은 하루에 1~2마리의 동물로 두개골 양쪽에 100~200개의 뉴런의 기록을 얻을 수 있어야 합니다.
두개골의 각 측면에 열린 광학 창을 통해, 방법은 생체 내에서 길고 안정적인 칼슘 이미징을 위한 대칭 포유류 뇌 영역에 걸쳐 신경 활동의 기록을 가능하게 합니다. 이 방법은 또한 주변 장치 또는 중추 신경계에 일방적인 상해 후에 피질 활동 및 가소성을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 비디오를 시청 한 후, 당신은 Thy1 GCaMP6s 트랜스 제닉 마우스에서 두 광자 현미경을 사용하여 칼슘 역학을 측정하기위한 양자 두개골 창을 설치하는 방법에 대한 좋은 이해를 가져야한다.
