미세 유체 장치를 사용하여 siRNA로드 지질 나노 입자의 생산

지질 나노 입자 크기는 생체 분포, 항 종양 효과 및 유전자 침묵 성능에 영향을 미칩니다. 따라서, LNP 크기 제어 방법은 RNA 전달 시스템을 포함하는 나노 의약품을 생산하는 효과적인 기술이다. iLiNP 장치라는 이 원래의 미세 유체 장치는 10나노미터 간격으로 20~100나노미터에 이르는 LNP 크기를 제어할 수 있었습니다.

iLiNP 장치는 siRNA 로드 LP뿐만 아니라 모든 mRNA 로드 LNPS 및 리보뉴클레오프로틴 로드 LP를 생성할 수 있습니다. 시작하려면, 지질 에탄올 용액을 가지고 50 내지 10 내지 38.5 내지 1.5의 어금니 비율로 DOTAP, DSPC, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2k 용액을 혼합하여 siRNA로드 LNP를 생성한다. 총 지질 농도를 8 밀리몰러로 조정합니다.

그런 다음 pH 4에서 154 밀리머 식염수 및 25 밀리머 아세테이트 버퍼의 수성 솔루션을 가져 와서 0.2 마이크로 미터 멤브레인 필터 또는 주사기 필터를 통해 필터링하십시오. siGL4 70 마이크로그램을 25 밀리머 아세테이트 버퍼1밀리리터로 용해하여 siRNA 버퍼 솔루션을 준비합니다. 각각 지질 및 수성 솔루션으로 1 밀리리터 유리 주사기를 채웁니다.

유리 주사기를 주사기 커넥터를 사용하여 피크 모세혈관에 연결한 다음 지질 및 수성 용액의 유량을 설정하고 주사기 펌프를 사용하여 iLiNP 장치에 지질 및 수성 용액을 별도로 도입합니다. iLiNP 장치의 콘센트에서 마이크로 튜브에서 LNP 서스펜션을 수집합니다. 4도에서 12~14킬로달톤의 투석막을 이용한 LNP 서스펜션은 POPC LP 및 siRNA 로드 LNPs에 대한 식염수 또는 DPBS에 대하여 하룻밤 사이에 섭씨이다.

마이크로튜브에서 투석된 LNP 서스펜션을 수집한 다음, LNP 현탁액의 20~30마이크로리터를 마이크로 쿼츠 세포로 배관한다. 마지막으로 동적 광 산란을 통해 LNP 크기, LNP 크기 분포 및 폴리 분산지수를 측정합니다. 총 유량 및 유량 비율과 같은 다양한 유량 조건에서 생산되는 POPC LNP 크기 분포가 여기에 나와 있습니다.

20~100나노미터에 이르는 정확한 LNP 크기는 iLiNP 장치를 사용하여 제어할 수 있다. 소형 LP는 높은 총 유량 조건에서 형성됩니다. 또한, FRR 5에서 형성되는 LNP 크기는 총 유량에 관계없이 FRR 3의 크기보다 작다.

siRNA 로드 LP의 크기 분포는 여기에 도시된다. siRNAs는 양이온 지질 DOTAP와 음전하 siRNAs 사이 정전기 상호 작용에 의해 LP로 캡슐화됩니다. iLiNP 장치는 좁은 분포를 가진 90 나노미터 siRNA 하중 양이온 LP를 생산했습니다.

siRNA 캡슐화 효율은 양이온 지질과 음전하 시RNA 사이의 정전기 상호 작용으로 인해 95%였다. 19나노미터 siRNA 하중 LNPs의 세포 독성 및 유전자 침묵 활성을 평가하였다. siRNA로드 LNPs는 10 에서 100 나노 몰러 siRNA의 복용량에서 세포 독성을 보였다.

루시파라제의 발현 수준은 siRNA 농도에 따라 감소하였다. siRNA로드 LNP는 100 나노 몰라 siRNA의 복용량에서 80% 루시파라발현을 억제하였다. 유량 조건의 최적화는 원하는 크기의 LP를 얻기 위한 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다.

iLiNP 장치를 포함하는 미세 유체 기반 LNP 생산 방법은 복잡한 절차를 필요로하지 않으며 표준 LNP 생산 방법으로 사용될 것으로 예상된다.