식물에 phytochrome 응답에있는 몽고메리 실험실 작업은 국립 과학 재단 (부여 BLM없이. MCB - 0919100) 및 화학 과학 Geosciences 및 Biosciences 부문, 기초 에너지 과학 사무소, 과학의 사무실 미국학과로 지원됩니다 에너지 (BLM 부여 안돼. DE FG02 91ER20021). 우리는 촬영 기간 동안 기술 지원을 멜리사 휘태커 감사하고 비판적으로 실험 지원, 개발 및 공촛점와 지원 Arabidopsis 원형질 정렬 박사 멜린다 프레임에 대한 프로토콜을 정렬 형광 활성화 셀을 최적화와 지원 박사 루이스 킹을 위해, 스테파니 코스티건을 원고를 읽고 현미경. 우리는 그래픽 디자인 지원 및 편집 지원 캐런 버드 말린 카메론 감사합니다.

1. 식물의 성장 <ol><li> 격리된 확인 UAS - BVR X GAL4 - GFP 향상제 트랩 라인과 같이 4 설명 (요약에 대한 그림을 참조하십시오. 1) 야생 입력하거나 부모의 라인이 땅에서 sown 있으며, 즉, 한 줄에 ~ 2000 소독 종자. </li><li> 식물 22 100 μmolm -2 S -1의 하얀 조명 아래에서 흙 5 주 동안 재배 ° C와 70 % 습도. </li></ol> 2. 리프 원형질 분리 (Denecke 및 비테일 9 적응) <ol><li> protoplasts를 분리, 텍, 버퍼를 준비합니다. - (N - morpholino) ethanesulfonic 산성 (MES, 2.56 ㎜), 0.75 g의 염화칼슘 이수화물 (CaCl 2 0.2 H 2 O, 6.75 3.1 g Gamborg의 B5 소금, 0.5 g 2 : 일리터 텍스 버퍼 들어, 다음과 같은 구성 요소를 달다 음), 0.25 g의 질산 암모늄 (NH 4 NO 3, 3.12 MM)은 136.9 g의 자당 (0.4M)가. deionized, 증류수의 ~ 900 ML (ddH 2 O)에서 완전히 구성 요소를 디졸브 1과 5.7으로 산도를 가지고 M 코. 1리터와 진공 펌프에 연결된 0.2 μm의 병 - 최고의 필터 소독 필터 최종 볼륨을 가져와. </li><li> 식물의 녹색 잎이 건강 (느슨하게 비커에 포장 단풍 ~ 250 ML) 수집하고 ~ 40 ML ddH 2 O 4 배와 린스, 살균 ddH 2 O.로 두 번 rinsing 다음 얇은 스트립에 # 20 메스, 절단 잎을 사용하고 동일이 50 ML 멸균 플라스틱 튜브로 조직을 나눕니다. 10X 잎 소화 주식 솔루션 (10X 잎 소화 주식 솔루션 5 ML의 나누어지는를 추가하여 1X 잎 소화 혼합물을 준비 : W / V Macerozyme R - 10, 4% W / V 텍 버퍼에 Cellulase &quot;Onozuka&quot;R - 10, 2 % 해산 0.2 μm의 45 ML 신선한 텍스 버퍼)를 -80 ° C에서 5 ML aliquots를 필터링하고 동결로 소독 필터. 모든 잎 조직을 커버 50 ML 튜브 당 1X 잎 소화 믹스의 ~ 25 ML을 추가합니다. </li><li> 부드러운 떨고있는 로커에 실온에서 3 시간 보육 다음 물을 펌프에 연결된 진공 건조기를 사용하여 실온에서 1 시간 오픈 튜브의 소화 혼합물의 잎 조직에 침투 진공. 1X 잎 소화 믹스의 잎 조직과 덮인 튜브는 빛에 노출을 방지하기 위해이 과정에서 알루미늄 호일에 싸서 보관됩니다. </li><li> 삼시간 후, protoplasts 발표 ~ 2 분 동안 로커 속도를 향상시킬 수 있습니다. 부스러기를 제거하고 멸균 유리 비커에 여과물를 수집하기 위해 멸균 치즈 천의 두 레이어를 통해 원유 원형질의 현탁액을 필터링합니다. 멸균 페트리 접시에 멸균 100 μm의 나일론 메쉬를 통해 여과물을 필터링합니다. 을 통해 흐름을 수집하고 새로운 살균 50 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 멸균 페트리 접시를 세척하여 표면을 준수하는 어떠한 protoplasts를 수집하는 신선한 텍스 버퍼의 15-20 ML에 대해 사용합니다. </li><li> 10 100xg에서 스윙 버켓 로터를 사용하여 ° C를 15 분 (가속 6 감속 0)에 대한 통해 흐름을 원심 분리기. </li><li> ~ 25을 제거 - 잔류 및 pelleted 파편을 포함하는 부동 원형질 층 아래의 액체 30 ML을 부동 원형질 층을 교란하고 ~ 10 떠나지 않고 연동 펌프에 연결된 멸균 9 &quot;유리 파스퇴르 피펫과 함께 - 15 ML 볼륨을. </li><li> 부드럽게 protoplasts을 resuspending 동안 40 ML의 최종 볼륨에 신선한 텍스 버퍼를 추가합니다. </li><li> 가능한 많은 세포 파편을 제거하는 단계를 2.5-2.7 두 번 반복합니다. 원심 분리 시간은 첫 번째 반복에서 10 분 및 최종 반복 5 분 줄어 듭니다. </li><li> 새로운 15 ML 튜브로 절단, 살균 한 ML 전송 피펫과 부동 protoplasts을 대기음. 4에서 2 시간 동안을 정렬하거나 어둠 속에 저장 ° C를 정렬까지 직접 진행합니다. </li></ol> 3. 형광 - 활성 셀 정렬 (외과)에서 원형질의 정렬 <ol><li> 정렬하기 전에, 원형질 무결성 및 원형질의 수영장에서 GFP 형광의 존재를 확인하기 위해 여기에 488 - nm의 레이저를 사용하여 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)에 의해 protoplasts을 확인합니다. 최소한의 파편 외과 정렬 노즐을 막히는 것을 방지하는 것이 필요합니다. </li><li> 적응 프로토콜 10을 다음과 주위에 9 PSI의 시스템 압력과 6,000 달러와 15000 사이의 행사 가격에서 매크로 정렬 머리에 200 μm의 노즐을 사용하여 외과 통해 텍 버퍼 (BD FACSVantage SE, BD Biosciences)에 정렬 고립 protoplasts. </li><li> 야생 형이 아닌 GFP의 protoplasts은 autofluorescence 임계값을 결정하는 데 사용됩니다. </li><li> GFP 양성 protoplasts, 30분의 530 밴드를 사용하여 GFP 형광을 확인하기 위해 488 - NM 아르곤 라인에 공기 냉각 아르곤 레이저 (스펙트럼 물리 모델 177, 뉴 포트 주식 회사, 어바인, CA) 100 MW에서 운영을 사용하여 정렬 세포를 수집하는 필터를 전달합니다. </li><li> GFP 양성 protoplasts의 수집에 따라, 단계 3.1 상세으로 CLSM으로 정렬 protoplasts을 확인합니다. </li><li> Qiagen RNeasy 플랜트 미니 키트를 사용하여 정렬 protoplasts에서 총 RNA를 추출합니다. Affymetrix GeneChip Expr에서 설명한대로 cDNA가 다음 하이브 리다이 제이션 준비할 수ession 분석 기술 매뉴얼 후 AtH1 Arabidopsis Affymetrix 전체 게놈 배열에 hybridized. </li></ol> 대표 결과 우리는 외과 (그림 2)에 의해 GFP의 채널에 GFP 양성 세포의 상당수를 발견했습니다. 혈관과 피부 표현과 선, J1071은 ~ 1.4 %의 GFP 양성 protoplasts 있었 반면, GFP 향상제 - 트랩 부모, constitutively GFP - 표현 라인, J0571, 표시 ~ 17 %로 24% GFP 양성 protoplasts를 사용하여 최적화 assays에서 (표 1). 1 H에 대한 J0571 protoplasts 3 X 500 μl (원형질의 정지 ~ 1.5 ML 합계)의 정렬하면 ~ 100,000 GFP 양성 protoplasts했다. 1.5 H에 대한 J1071 protoplasts 3 X 500 μl (~ 1.5 ML 총 원형질 서스펜션)의 정렬하면 ~ 3000 GFP 양성 protoplasts했다. 분류가 (그림 3C 및 3E) 실시되기 전에 공촛점 이미지 J0571 및 J1071 모두 샘플 protoplasts 매우 높은 수율을 표시하고 정렬 분수는 밝은 GFP - 형광 protoplasts를 (그림 3G 및 표시되지 데이터)가 들어 있습니다. 이 발견은 그대로 GFP 양성 protoplasts가 외과로 정렬할 수 있습니다 확인합니다. 비 GFP의 protoplasts 또한 정렬 및 별도의 채널에 수집하실 수 있습니다. 비 GFP의 protoplasts은 holophytochrome 수준의 감소에 따라 유전자 발현의 구체적인 변화를 감지하기 위해 후속 microarray 분석을위한 이상적인 부정적인 제어 역할을합니다. 격리 protoplasts (1 ML) fluorospectrometry (그림 4)에 의해 검출을위한 충분한 수량의 산출의 RNA에서 RNA 추출. 절연 RNA는 NanoDrop 악기 (NanoDrop 1000, 써모 사이 언티픽)을 사용하여 평가하고 NanoDrop 3.7.1 RNA의 부량 소프트웨어 계량했다. 에서 RNA의 수확량은 C24 야생 형 protoplasts 또는 외과 - 정렬 GFP 양성 향상제 트랩 protoplasts가 사용하기 위해 필요한 최소 20 NG를 초과를 미리 정렬 RNA - 라벨 microarray (표 2) assays합니다. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 향상제 트랩 린 </td><td> GFP 양성 protoplasts의 비율 (%) </td><td> 정렬 GFP의 protoplasts 수 </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 17.18 % ~ 24.06 % </td><td> 26,400 ~ 36,000 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> ~ 1.43 % </td><td> 1,000 ~ 1,300 </td></tr></tbody></table> 정렬 및 형광 활성 세포 분류기 (FACSVantage, BD)를 통해 원형질 서스펜션 500 μL를 실행하여 수집한 GFP 양성 protoplasts의 수를 전에 두 향상제 트랩 라인에서 GFP 양성 protoplasts 표 1. 비율. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 플랜트 라인 </td><td> RNA 수율 (NG) </td></tr><tr><td> C24 WT </td><td> 12486.5 </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> 71.5 </td></tr></tbody></table> 표 2. protoplasts에서 RNA 격리에서 항복. RNA는 두 향상제 트랩 라인에서 미리 정렬 C24 야생 입력하거나 정렬 GFP 양성 protoplasts에서 분리 계량되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 빌리베르딘 환원 효소 (BVR) 유전자 변형 Arabidopsis thaliana 공장에서 표현의 GAL4 향상제 - 트랩 기반 유도. (A). GAL4 - 응답 GFP 마커 유전자를 포함하는 GAL4 기반 향상제 트랩 라인의 라이브러리에서 선택한 개인은에서 대상 유전자의 표현을 유도하는 GAL4 - 응답 대상 유전자를 포함하는 라인 GAL4 함유 표시 전지와 교차 수 있습니다 GFP 형광에 의해. 박사 짐 Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html)에서 수치를 기반으로. 상위 라인에 phytochrome 발색단, phytochromobilin (PΦB)와 holophytochrome의 (B) 제작. (C) 왼쪽, 빌리베르딘 환원 효소 (BVR) BR 및 PΦR하는 활동에 의해 빌리베르딘 IXα (BV IXα)와 PΦB 감소, 각각. BVR 활동 PΦB의 고갈에 결과 및 광활성이있는 생산의 감소로 연결이 holophytochrome. 맞아요, BVR에 의해 촉매 반응이 나타납니다. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 형광 활성 세포 정렬 (외과) 수집 도트 플롯. 원형질 세포의 비교 C24 야생 유형 (A), J0571 (B) 및 J1071 (C)에 대한 정렬. 488 - nm의 아르곤 레이저에 의해 흥분하고 autofluorescence 임계값을 결정하는 데 사용 이외의 GFP 형광 C24 야생 타입 protoplasts의 (A) 취득 도트 플롯. (B)와 (C) 수집 도트 플롯은 488 - NM 레이저에 의해 여기에 대응 긍정적인 GFP 아르 protoplasts의 비율을 보여줍니다. B와 C 구분 형광 활성화된 세포 분류기 기준으로 정렬 (FACSVantage, BD)와 수집된 GFP 양성 목표에 R3 정렬 게이츠. 레드 채널 V를 나타냅니다protoplasts과 녹색 채널에서 엽록소의 autofluorescence에 대한 alues​​는 GFP 형광 값을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 셀 정렬에 사용되는 식물 protoplasts의 공촛점 현미경. 공촛점 레이저 형광 활성화된 세포 분류기 (외과)를 통해 (G) 정렬하기 전에 (A, C, E) 후 protoplasts의 이미지를 스캔. B, D, F와 H는 DIC 이미지입니다. C24 야생 유형 (A, B), J1071 (C, D)와 J0571 (E, F, G, H)의 Protoplasts가 표시됩니다. 와 488 - nm의 레이저로 여기에서 얻은 Autofluorescence (LP 650 NM) - 이미지 C, E와 G는 GFP 형광 (575 nm의 BP 505 NM)의 이미지를 통합하고 있습니다. H를 통해 A는 63x 오일 이하 4 스캔의 평균입니다. 바 = 10 μm의. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. fluorospectrometry로 protoplasts으로부터 격리 RNA의 양을 정함. RNA는 (A) C24 야생 유형 (B) J0571, 그리고 (C) J1071에서 추출한. 사전 정렬 야생 형 protoplasts에 대한 RNA를 나타냅니다. B와 C는 형광 활성화된 셀 정렬 (외과)를 기준으로 정렬 GFP 양성 protoplasts에서 RNA를 나타냅니다. RNA의 부량 소프트웨어 NanoDrop 3.7.1 (NanoDrop 1000, 써모 사이 언티픽).

<ol>
	<li>Franklin, K. A., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochrome+functions+in+Arabidopsis+development.">Phytochrome functions in Arabidopsis development.</a> J. Exp. Bot. 61, 11-24 (2010).</li><li>Montgomery, B. 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microarrays를 통해 유전자 발현 프로 파일링 (1) Arabidopsis 모종의 유전자의 30 % 이상이 가벼운 규제 11아르 것을 지적하고 있으며 (2) phytochrome 신호 폭포 12, 13에 관련된 빛 신호 전달 단백질을 인코딩 유전자의 거대한 그룹을 확인했습니다 . 이러한 실험은 빛이 유전자 발현에 신속하고 장기적인 변화를 유도하는 것이 좋습니다. phytochromes 각 수영장 발달과 적응 반응의 하위 집합만를 ?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Anti-BVR antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QED Bioscience Inc.</td>
<td>56257-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellulase &#x201C;Onozuka&#x201D; R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company</td>
<td>MSPC 0930</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gamborg&#x2019;s B5 basal salt mixture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macerozyme R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company</td>
<td>PTC 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MES, low moisture content</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M3671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Murashige and Skoog salts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caisson Laboratories</td>
<td>74904</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phytablend</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caisson Laboratories</td>
<td>28302</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy Plant Minikit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>16419</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

investigating tissue- and organ-specific phytochrome responses using facs-assisted cell-type specific expression profiling in arabidopsis thaliana

라이트 mediates 식물의 수명주기 전반에 걸쳐 발달 및 적응 과정의 배열입니다. 식물 활용 흡광 photoreceptors은 감각과 불빛에 적응이라는 분자를. 멀리 빨간 / 빨간색 빛을 흡수 phytochrome photoreceptors 것은 광범위하게 연구되고있다. Phytochromes 그들이 연구되고이있는 모든 높은 식물 시스템에서 확실하고 중복 기능을 가진 단백질의 가족으로 존재<sup&gt; 1</sup&gt;. 종자 발아에서 꽃과 노화를 통해 다양한 Phytochrome - 중재 조명 응답은, 종종 특정 식물 조직이나 장기화된 아르<sup&gt; 2</sup&gt;. mutational 분석을 통해 개인 및 이중화 기능 phytochrome의 발견과 해설에도 불구하고, photoperception의 독특한 사이트와 phytochromes의 지역화된 수영장의 분자 메커니즘에 대한 최종 보고서 공간적 특정 phytochrome 응답이 제한됩니다 중재 것을. 우리는 phytochrome photoperception 특정 사이트 조직 및 photomorphogenesis의 오르간 특정 측면, 그리고 지역화된 phytochrome 수영장은 휴대 전화 신​​호의 하류 대상 유전자의 서로 다른 하위 집합을 종사 조절한다는 가설에 따라 실험을 설계했습니다. 우리는 선택 기관 또는 유전자 변형 식물 조직 내에서 특정 방식으로 기능 phytochromes을 줄이기 위해 생화 학적 접근 방식을 개발했습니다. 우리의 연구는 transcriptional 활성제 GAL4하여 업스트림 활성화 순서 (UAS) 요소의 통제하에 유전자의 표현의 transactivati​​on로 이어지는 bipartite 향상제 - 트랩 방식을 기반으로<sup&gt; 3</sup&gt;. 빌리베르딘 환원 효소 (<em&gt; BVR</em&gt; UAS의 통제하에) 유전자가 자동​​으로 UAS - BVR 부모의 GAL4 transactivati​​on의 부재로 유지됩니다<sup&gt; 4</sup&gt;. UAS - BVR 형질 전환 라인 및 특정 표현의 GAL4 - GFP 향상제 트랩 라인 결과 사이의 유전 십자가<em&gt; BVR</em로 표시된 셀에&gt; 유전자<em&gt; GFP</em&gt; 표현<sup&gt; 4</sup&gt;. phytochrome 발색단 결핍증에 Arabidopsis 공장 결과에 BVR 적립<em&gt; planta에</em<sup&gt; 5-7</sup&gt;. 우리가의 전시 GAL4 종속 활성화를 생산한다는 따라서, 유전자 변형 식물<em&gt; BVR</em&gt; phytochrome의 생화학 불활 성화의 결과 유전자뿐만 아니라 GAL4 종속<em&gt; GFP</em&gt; 표현. 의 Photobiological 및 분자 유전 분석<em&gt; BVR</em&gt; 유전자 변형 라인 조직 및 photoperception의 해당 사이트와 관련이있다 오르간 특정 phytochrome - 매개 반응에 대한 통찰력을 매우 저조한<sup&gt; 4, 7, 8, 9, 10</sup&gt;. GFP 양성의 형광 활성 세포 정렬 (외과), 확장기 - 트랩 - 유도<em&gt; BVR</emmicroarray 분석을 통해 세포 유형 특정 유전자 발현 프로 파일링과 함께&gt; - 표현 공장 protoplasts는 공간 특정 phytochrome 반응을 중재에 참여 putative 하류 대상 유전자를 식별하는 데 사용되고 있습니다. 이 연구는 빛을 인식의 사이트에 우리의 이해를 확대하고, 여러 조직이나 장기가 가벼운 규제 식물의 성장 및 개발에 협력하고, 복잡한 phytochrome - 중재의 분자 해부 휴대 전화의 신호 폭포를 증진하는 통해 메커니즘.

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Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

공간적 특정 phytochrome 반응의 분자 기초는 조직과 기관이 특정 phytochrome 결함을 전시 유전자 변형 식물을 사용하여 조사 중입니다. 특정 세포의 분리는 microarray 분석에 의해 다음 정렬 것은 공간적 특정 phytochrome 응답에 관련된 유전자를 확인하기 위해 활용되고있는 형광 활성화된 세포로 유도 phytochrome 발색단 고갈을 전시.

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Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

15.7K 조회수.  Michigan State University (MSU). 공간적 특정 phytochrome 반응의 분자 기초는 조직과 기관이 특정 phytochrome 결함을 전시 유전자 변형 식물을 사용하여 조사 중입니다. 특정 세포의 분리는 microarray 분석에 의해 다음 정렬 것은 공간적 특정 phytochrome 응답에 관련된 유전자를 확인하기 위해 활용되고있는 형광 활성화된 세포로 유도 phytochrome 발색단 고갈을 전시.

비디오: Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

의 꽃 - 물놀이 변환 Arabidopsis thaliana 검사 pTSO2 : β - glucuronidase 리포터 유전자 발현

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

연구

생물학

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling. These proteins display a diverse array of cellular functions including nuclear import/export of RNA and protein, transcriptional regulation, and apoptosis. Interestingly, major cellular reorganizations including cell division, differentiation and transformation, often involve such activities3,4,8,10. The detailed study of these proteins and their respective regulatory mechanisms can be challenging as the stimulation for these localization changes can be elusive, and the movements themselves can be quite dynamic and difficult to track. Studies involving cellular oncogenesis, for example, continue to benefit from understanding pathways and protein activities that differ between normal primary cells and transformed cells6,7,11,12. As many proteins show altered localization during transformation or as a result of transformation, methods to efficiently characterize these proteins and the pathways in which they participate stand to improve the understanding of oncogenesis and open new areas for drug targeting.
Here we present a method for the analysis of protein trafficking and shuttling activity between primary and transformed mammalian cells. This method combines the generation of heterokaryon fusions with fluorescence microscopy to provide a flexible protocol that can be used to detect steady-state or dynamic protein localizations. As shown in Figure 1, two separate cell types are transiently transfected with plasmid constructs bearing a fluoroprotein gene attached to the gene of interest. After expression, the cells are fused using polyethylene glycol, and protein localizations may then be imaged using a variety of methods. The protocol presented here is a fundamental approach to which specialized techniques may be added.

A flexible and efficient method for the characterization of cell type-specific protein localization and nucleocytoplasmic shuttling is described. This heterokaryon approach uses fluorescently-labeled fusion proteins to image protein localizations after cell fusion. The protocol is amenable to steady-state localizations or more dynamic determinations based on live cell imaging.

셀 유형 - 구체적인 현지화의 분석을 위해 Heterokaryon 기법

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine, form bilayer membranes which act as both boundaries and interfaces for chemical exchange between cells and their surroundings. Unlike animals, plant cells have a special organelle for photosynthesis, the chloroplast. The intricate membrane system of the chloroplast contains unique glycerolipids, namely glycolipids lacking phosphorus: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG)4. The roles of these lipids are beyond simply structural. These glycolipids and other glycerolipids were found in the crystal structures of photosystem I and II indicating the involvement of glycerolipids in photosynthesis8,11. During phosphate starvation, DGDG is transferred to extraplastidic membranes to compensate the loss of phospholipids9,12.
Much of our knowledge of the biosynthesis and function of these lipids has been derived from a combination of genetic and biochemical studies with Arabidopsis thaliana14. During these studies, a simple procedure for the analysis of polar lipids has been essential for the screening and analysis of lipid mutants and will be outlined in detail. A leaf lipid extract is first separated by thin layer chromatography (TLC) and glycerolipids are stained reversibly with iodine vapor. The individual lipids are scraped from the TLC plate and converted to fatty acyl methylesters (FAMEs), which are analyzed by gas-liquid chromatography coupled with flame ionization detection (FID-GLC) (Figure 1). This method has been proven to be a reliable tool for mutant screening. For example, the tgd1,2,3,4 endoplasmic reticulum-to-plastid lipid trafficking mutants were discovered based on the accumulation of an abnormal galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) and a decrease in the relative amount of 18:3 (carbons : double bonds) fatty acyl groups in membrane lipids 3,13,18,20. This method is also applicable for determining enzymatic activities of proteins using lipids as substrate6.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Composition of polar lipid extracts and the fatty acid composition of individual glycerolipids are determined in a simple and robust lipid profiling experiment. For this purpose, glycerolipids are isolated by thin layer chromatography and subjected to transmethylation of their acyl groups. Fatty acyl methylesters are quantified by gas-liquid chromatography.

씬 크로마 토그래피 (TLC)에 의해 Arabidopsis thaliana 폴라 Glycerolipid의 프로파일은 기체 - 액체 크로마 토그래피 (GLC)와 결합

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

의 세포 구체적인 분석<em&gt; Arabidopsis</em&gt; 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여 잎

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

의 조직 화학 염색<em&gt; 애기 장대</em&gt; 차 전지 벽 요소

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

에서 결정 셀룰로오스 축적의 높은 해상도 정량<em&gt; 애기 장대</em&gt; 뿌리 조직 특이 세포 벽 수정을 모니터링하는

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

다른 빛 자질에 애기 thaliana 성장 행동의 분석

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

마우스 간에서 세포 유형 별 유전자 발현 프로파일링

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana

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의 꽃 - 물놀이 변환 Arabidopsis thaliana 검사 pTSO2 : β - glucuronidase 리포터 유전자 발현

셀 유형 - 구체적인 현지화의 분석을 위해 Heterokaryon 기법

씬 크로마 토그래피 (TLC)에 의해 Arabidopsis thaliana 폴라 Glycerolipid의 프로파일은 기체 - 액체 크로마 토그래피 (GLC)와 결합

의 세포 구체적인 분석

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리

의 조직 화학 염색

에서 결정 셀룰로오스 축적의 높은 해상도 정량

다른 빛 자질에 애기 thaliana 성장 행동의 분석

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

마우스 간에서 세포 유형 별 유전자 발현 프로파일링