발달 생물학의 주요 목표는 유전자의 문맥 특정 역할을 이해하는 것입니다. 그리고 이것은 기존의 녹아웃 돌연변이체 또는 구성 과발현 라인에 의해 달성하기 어려울 수 있습니다. 모듈식 그린 게이트 복제 시스템을 사용하여 모델 식물 인 Arabidopsis thaliana의 세 가지 주요 메리스템에서 유도 할 수없는 사이토 별 발현에 대한 자원을 생성했습니다.
동일한 모듈식 복제 전략을 사용하여 변환이 불가능한 다른 식물 종에 적용할 수 있습니다. 이 절차의 시각적 데모는 줄기의 머리스템에서 의 트랜스 활성화의 효과를 분석하고 짧은 정점은 매우 어려울 수있는 이미징 전에 해부를 필요로하기 때문에 가치가있다. 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 씨앗을 소독합니다.
다음으로, pH 5.8에서 반강도 무라시게와 스쿠오 그 매체를 준비하고 1% 자당과 0.9%의 한천을 추가합니다. 오토클레이브 후, DMSO에 용해된 덱스를 10~30마이크로몰러 사이의 최종 농도로 유도 플레이트에 첨가한다. 컨트롤 플레이트에 동일한 양의 DMSO를 추가합니다.
접시에 뿌리 이미징씨앗을 넣고 어둠 속에서 48시간 동안, 섭씨 4도에 계층화하십시오. 플레이트를 식물 인큐베이터에 수직으로 배치하고 5일 동안 자랍니다. 발아 후 5 일, 모종을 이미지하는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 을 사용합니다.
먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 씨앗을 준비하고 성장합니다. 발아 후 6~7일 후에 각 묘목을 별도의 냄비에 토양으로 옮기습니다. 물을 유도하여 식물을 유도하는 경우, 물에 25 마이크로 몰러 DEX 용액을 사용하여 에탄올에 용해 된 25 밀리머 DEX의 재고로부터 제조하십시오.
유도의 원하는 시간까지 2 ~ 3 일마다 물을. 담그음으로써 유도하는 경우, DEX 및 모의 처리를 위해 25 마이크로몰라 최종 농도 또는 상응하는 양의 DMSO에서 0.02%의 실웨트 L77 및 DEX를 함유한 750밀리리터의 물로 1리터 비커를 준비한다. 단일 식물을 유도 또는 모의 용액에 30초 간 담급넣습니다.
이미징의 원하는 시간까지 2~3일마다 반복합니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 씨앗을 준비하고 성장합니다. 발아 후 6~7일 후에 각 묘목을 별도의 냄비에 토양으로 옮기습니다.
줄기가 약 1센티미터 길이일 때, 물에 10~50마이크로몰러 DEX 용액을 가진 불성 SAM을 분사하십시오. 개발의 후반 단계에서 유도 및 이미징을 위해, 더 긴 줄기 또는 측면 촬영의 SAM을 유도. 유도 후 24~48시간 후, SAM을 해부하고 이미징을 진행합니다.
먼저, 모종을 소당에서 밀리리터 용액당 10 마이크로그램으로 옮기고 5분 동안 이를 반소합니다. 뿌리를 현미경 이미징 챔버에 넣고 63 배 의 물 침수 목표를 가진 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 이미지를 배치합니다. 공증요오드 형광을 시각화하려면 488 나노미터의 발산 파장을 사용하고 590~660나노미터 사이의 방출을 수집합니다.
mTurquoise2 형광의 경우 458 나노미터 흥분을 사용하고 순차적 스캐닝을 사용하여 460~615나노미터 사이의 배출을 수집합니다. 먼저 원하는 섹션의 반대편에 손가락으로 줄기를 고정합니다. 면도날을 사용하여 약 3센티미터의 세그먼트를 자르고 여러 개의 미세 컷을 수행합니다.
수돗물이 들어 있는 페트리 접시에 면도날을 헹구고 줄기 부분을 수집합니다. 섹션을 얼룩지게하거나 현미경 슬라이드에 직접 장착하십시오. 염색을 위해 반응 튜브에 프로피듐 요오드의 밀리리터 용액 당 250 마이크로그램의 1 밀리리터를 준비하십시오.
페트리 접시에서 수돗물을 파이펫으로 제거하고 프로피듐 요오드 용액으로 교체하고 5 분 동안 얼룩을 대체하십시오. 그런 다음, 프로피듐 요오드 용액을 제거하고 물로 헹구는 다. 미세 한 집게 또는 미세 한 페인트 브러시를 사용 하 여, 현미경 슬라이드에 스테인드 섹션을 전송.
25배 의 침수 렌즈가 있는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 샘플을 이미지화합니다. 561 나노미터 레이저 광을 사용하여 프로피듐 요오드 형광을 자극하고 570 ~ 620 나노미터에서 배출을 수집합니다. 405 나노미터 레이저 광을 사용하여 드라이버 라인 구조에 의해 인코딩된 mTurquoise2 플루오로포레 이펙터를 자극하고 425~475나노미터의 배출을 수집합니다.
먼저 집게를 사용하여 촬영 팁 아래 줄기를 2센티미터 줄입니다. 한 손에 줄기를 잡고 꽃 싹과 큰 원시를 제거하기 위해 미세 한 집게를 사용합니다. 젊은 원시를 제거하려면 3 %의 아가로즈가 들어있는 페트리 접시에서 SAM을 똑바로 세워 놓습니다.
다음으로 쌍안경과 집게를 사용하여 SAM에 가까운 어린 원시인을 제거하십시오. 해부된 SAM을 프로피듐 요오드의 밀리리터 용액당 250 마이크로그램을 포함하는 튜브로 옮기다. 샘플이 염색 절차 중에 완전히 침수되었는지 확인하면서 5~10분 동안 샘플을 염색하게 합니다.
스테인드 SAM을 아가로즈 3%가 함유한 작은 페트리 접시에 넣습니다. 이중 증류수로 SAM을 덮습니다. 25배 침수 렌즈가 장착된 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 해부된 SAM을 이미지화하십시오.
561 나노미터 레이저 광을 사용하여 프로피듐 요오드 형광을 자극하고 570 ~ 620 나노미터에서 배출을 수집합니다. 405 나노미터 레이저 광을 사용하여 mTurquoise2 형광을 자극하고 425 ~ 475 나노미터에서 배출을 수집합니다. 0.5 마이크로미터의 스텝 크기로 Z 방향으로 50 마이크로미터에 걸쳐 이미지 스택을 기록합니다.
DEX를 통한 유도는 세포형 특이적 mTurquoise2 발현을 뿌리 내분신내막내막과 캄비움, 및 촬영 에 있는 줄기세포로 이끈다. 트랜스활성화를 위한 테스트 사례로서, V16 활성화 도메인에 융합된 이차 세포벽 마스터 전사 인자 VND7을 인코딩하는 이펙터 라인이 생성된다. DEX 또는 DMSO의 15 마이크로리터를 가진 5일간의 단일 처리 후에, 줄기 단면도는 시작 칼집에 있는 자궁 화합의 시각화를 위해 준비됩니다.
유도된 견본에 있는 개시 칼집 세포는 propidium 요오드 채널에 대한 강한 신호를 보여주고 몇몇 세포는 자일렘 세포에 있는 세포벽의 전형적인 망상 두껍게 하는 것을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 다른 조직에서 유전자 발현을 유도하는 방법과 이미징을 위해 샘플을 준비하는 방법에 대한 명확한 이해가 있어야 합니다. 이 절차에 따라, 확립 된 드라이버 라인은 자신의 연구 관심사에 따라 다른 사용자가 생성 한 다양한 이펙터 구성과 함께 사용할 수 있습니다.
이 바로 가기는 식물 연구원이 세포 모형 특정 발현 또는 시간 예약된 방식으로 관심있는 유전자의 녹다운의 효력을 급속하게 평가하는 것을 도울 것입니다. 이 세포 형 특정 유도 시스템은 코르티코 스테로이드 덱사메타손의 사용을 필요로한다. 직접 접촉은 피해야하므로 치료 중에 장갑과 얼굴 마스크를 착용하는 것이 중요합니다.
