안락사된 쥐의 적출된 안구를 고정한 후 유리 슬라이드에 옮겨 해부현미경으로 관찰한다. 집게를 사용하여 안구 움직임을 방지하기 위해 각막의 가장자리를 조입니다. 해부 가위로 각막 공막 윤부를 통해 약 1mm 깊이로 각막 주위를 자른 다음 수정체와 유리체를 제거합니다.
시신경을 중앙에 두고 4개의 사분면을 따라 방사상으로 망막을 절단하여 망막 반경의 약 2/3에 도달합니다. 톱니 집게를 사용하여 공막 가장자리 중 하나를 클램프하십시오. 톱니가 없는 집게로 공막 가장자리를 잡고 톱니가 있는 집게에서 공막 바닥으로 이동합니다.
망막을 조심스럽게 껍질을 벗기십시오. 피펫을 사용하여 200 마이크로리터의 PBS로 망막을 적십니다. 흡수성 종이를 사용하여 과도한 PBS를 제거하고 필요한 경우 작은 강모 브러시로 망막을 평평하게 합니다.
차가운 메탄올이 완전히 덮일 때까지 망막의 내부 표면에 천천히 한 방울씩 추가합니다. 망막이 하얗게 변하고 끈기가 증가하면 망막을 부드럽게 평평하게 만들고 작은 강모 브러시로 잔류 색소 막 및 유리체와 같은 불순물을 제거합니다. 망막을 뒤집은 후, 이전에 입증 된대로 메탄올로 처리하고, 24 웰 플레이트의 웰로 옮기고, 메탄올에 담그고 즉각적인 면역 염색을 위해 섭씨 20도에서 1-2 시간 동안 보관한다.
그런 다음 플레이트에서 메탄올을 제거한 후 PBS로 망막을 헹굽니다. 메탄올 처리 전후의 망막의 레티놀 신경절 세포를 공초점 현미경을 사용하여 시각화하였으며, 이는 12개월의 메탄올 보존이 RGC 면역염색에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다.
