이 작품은 NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다. 우리는 그의 기술 지원 다윈 잡아 주셔서 감사합니다.

동물 사용 정책 : 동물 미네소타 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학 승인 프로토콜을 사용하여, 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 안내서에 설명된 지침에 따라 치료를 받았다. 솔루션 1) 준비 <ol><li> electrophysiological 녹화를 수행하기 전에, 세포 세포와 효소 솔루션 대비해야합니다. </li><li> 세포외 솔루션 : H 2 O 1 L 앤드 중탄산 1.9 g (23 ㎜)과 가루 에임스 &#39;매체의 혼합 한 병 (8.8g) (시그마). 모든 지점에서 세포외 솔루션 95% O 5분의 2 %의 CO 2 가스 혼합물로 포화 수 있습니다. 망막 스토리지 비커 200 ML을 전송합니다. 망막가 탑재되면 중력 재관류에 대한 재관류 시스템 컨테이너에 남아있는 솔루션을 놓으십시오. </li><li> 세포내 솔루션 : 세포 솔루션은 이전에 만들어진 후 aliquoted 500-1000 μL aliquots로하고 -20 ° C.에 저장된 있었어야했는데 125 K - 글루 콘 산, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 나 2 ATP, 0.5 MM NaGTP : 세포 솔루션은 우리가 사용하는 현재 표시된 전류 클램프 레코딩 (MM)를 위해 필요한 실험에 따라 달라집니다 코 5 7.2 산도. 같은 10 μm의 Alexafluor - 594 히드라 지드 (Invitrogen)로 형광 추적기는 실험, 그리고 neurobiotin (0.3 %) 중 dendrites을 시각화에 추가할 수있는 것은 또한 촬영 다음 세포 해부학 분석을 위해 포함될 수 있습니다. 언제 녹음 준비, 세포 솔루션을 녹여. </li><li> 효소 용액 : 세포 솔루션의 ML 4.150에 83 MG의 Hyaluronidase (워싱턴 화학 물질)로 10,000 유닛 Collagenase를 (워싱턴 화학) 결합합니다. -20 ° C. 50 μL aliquots에 저장 Aliquots은 몇 주 동안 사용할 수 있습니다. 때 망막을 치료하는 준비 부풀어 오른 세포외 용액 500 μL로 나누어지는를 희석. </li><li> 인산은 솔루션 (PBS)를 버퍼 : H 2 O 800 ML에서 NaCl의 8g, KCl의 0.2 g, 나 2 HPO 4 1.4 g와 KH 2 PO 4 0.24 g을 추가합니다. NaOH로 pH를 7.4로 가져와. 1 L.로 볼륨을 조정 </li><li> 0.2 M 인산 버퍼 : H 2 O 800 ML에서 나 2 HPO 4 21.8 g과 아니 2 PO 4 6.4 g을 추가합니다. 1 L.에 볼륨을 가지고 </li><li> 4 % Paraformaldehyde 솔루션 : 열 60 50ml H 2 O ° C. , 4g의 paraformaldehyde를 추가합니다 몇 분 동안 저어. 1M NaOH의 몇 방울을 (5 방울) 추가, 솔루션은 분명 때까지 저어 유지. 비커에 50 ML 0.2 M 인산 버퍼를 추가합니다. 산도 스트립을 (~ 7.4)를 사용하여 산도를 확인합니다. 필터와 냉각. </li><li> 차단 솔루션 (10 % 염소 혈청, 0.5 % TritonX100가) : PBS의 1.8 ML에서 염소 혈청 10 μL 트리톤 X - 100 0.2 ML를 추가합니다. TritonX - 100은 조직을 permeabilise을 제공합니다. </li><li> Streptavidin 솔루션 (5 % 염소 혈청, 0.5 % TritonX100, 1:500 Streptavidin 594) : PBS의 1.9 ML에서 염소 혈청 0.1 ML 10 μL 트리톤 X - 100 Streptavidin 594 4 μL를 추가합니다. </li></ol> 마우스 망막 2) 분리 필요한 해부 도구 : 1 # 2 포셉, 2 # 5 포셉, ophthalmologic 가위 <ol><li> 이 경우, 승인된 프로토콜에 따라 마우스를 안락사는 부드럽게 눈 뒤에 직각 # 2 포셉를 삽입하고 눈알을 리프팅로 2 질식과 명백히하다의 안구 CO. </li><li> 세포외 솔루션 35mm 페트리 접시에 안구를 놓습니다. 시신경 및 ophthalmologic 가위를 사용하는 연결된 extraocular 근육이나 결합 조직을 잘라. ophthalmologic 가위로 각막 버려야하고 # 5 포셉를 사용하여 렌즈를 빼낸다. # 5 포셉 한 켤레를 사용하여 공막엔 테어와 망막과 공막엔가 광학 디스크에서 만나 시신경을 도려 포셉을 사용합니다. 부드럽게 멀리 세안 컵에서 망막 껍질. 팁 : 시간을 최소화하기 위해 다음 단계로 이동하기 전에 두 망막의 각 단계를 수행합니다. </li><li> 망막에 부착된 유리를 제거하는 집게를 사용하십시오. 이것은 집게와 망막 위에 투명 유리 &quot;를 잡아&quot;에 의해 수행할 수 있습니다. 유리체는 성공적으로 제거한 경우, 포셉에 대한 명확하고 젤라틴 물질로 표시되어야합니다. 팁 : 유리체의 절반 아래의 제거에 망막을 칼자국 것은 가능한 조직의 양을 극대화하고 쉽게 챔버에 장착하게됩니다. </li><li> 그들이 소화 준비되기 전까지는 최소한의 주변 조명과 어두운 환경에서 상온에서 산소를 세포 솔루션 망막 보관하십시오. 망막은 ~ 6 시​​간 동안 이러한 방식으로 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3) 효소 혼합과 망막의 처리 및 기록 챔버에 장착 <ol><li> 35mm 페트리 접시에 500 μL 세포 솔루션, 장소 솔루션 collagenase / hyaluronidase의 나누어지는을 희석하여 망막을 전송하기만하면됩니다. </li><li> 망막은 -이 포함되어 유지부드러운 교반과 함께 15 분에 대해 95 % O2 / 5 % CO 2 환경에서 주입 페트리 접시, 커버와 어둠 속에서. 이 단계는 남아있는 유리를 소화에 에이즈와 신경절 세포 레이어에 쉽게 액세스할 수 있습니다. 팁 : 더 적은 유리 또는 불리한 영향을 관찰하는 경우 어린 동물에서 망막에 대해, 시간이 ~ 5 분 정도 단축하실 수 있습니다. </li><li> 효소 함유 매체에서 망막을 제거하고 세포 솔루션에 광범위하게 세척 </li><li> 아래로 향하게 photoreceptor 레이어와 챔버 6 녹음에 망막을 전송합니다. 피펫 또는 조직 중 하나와 함께 남아있는 액체를 멀리 윅 특히 신경절 세포 계층과 접촉을 피하 망막만을 가장자리를 만지지 않도록주의하는 조직을 버리고 망막의 측면을 롤. 조직 앵커 즉시 세포 솔루션으로 챔버를 채우기 위해 망막 이상의 나일론 메쉬와 플래티넘 반지를 놓습니다. </li><li> , 현미경 단계에 기록 챔버 마운트 중력 재관류와 진공 흡입을위한 튜브를 연결하고 접지 와이어를 연결합니다. </li></ol> 4) EGFP 표현 신경절 세포의 현지화 가벼운 자극 <ol><li> 1 ML / 분 또는 더 빠른 속도로 세포 솔루션으로 중력에 의해 망막을 Perfuse. 팁 : 재관류 속도가 너무 느린 경우, 조직은 충분히 산소와 시냅스 신호가 중단될 수 있습니다되지 않습니다. </li><li> 세포내 솔루션으로 녹음 피펫을 기입하여 피펫 홀더에 삽입. 팁 : 3 5MΩ의 범위에서 resistances와 Pipettes이 최상의 결과를 제공합니다. </li><li> 레코딩 피펫을 집중하기 위해 낮은 배율 (10X 목표, NA 0.3)에서 적외선 차등 간섭 대비 (DIC) 광학에서 망막을 시각화. 적외선은 가시 광선이 망막에 노출을 최소화하고 가벼운 적응을 최소화하는 데 사용됩니다. 높은 배율 (40X 목표, NA 0.8)로 이동하고 단지 조직 위의보기에 전극을 가지고. </li><li> 높은 배율 (40X 목적)에서 epifluorescence (EGFP에 대한 480 nm의)와 망막을 조명하고 테이프 (그림 1A)를 사용하여 컴퓨터 모니터에 형광 신경절 세포와 마크를 선택합니다. </li><li> DIC와 적외선 조명에서 대상 신경절 세포 (그림 1A) 근처에 기록 전극을 위치. 청정 지역은 즉시 폴리에틸렌 튜브와 피펫 홀더에 연결된 12cc 플라스틱 주사기를 통해 기록 전극에 부드러운 긍정적인 압력을 적용하여 세포를 덮고. 앰프에 어떤 전압 오프셋을 제로. 플레이스 전극 선택한 신경절 세포에 보조개가 세포 표면에 나타날 때까지. </li><li> 전압 클램프 모드에서 앰프로 테스트 펄스를 적용하고 피펫을 통해 현재의 통과를 모니터링합니다. 전극과 세포 사이에 도장을 만드는 부정적인 압력을 적용합니다. 세포 현재는 세포의 막이과 피펫 사이 GΩ 전기 인감을 나타내는 것입니다 개최 때까지 봉인하고 기다리는 시작하면 부정적인 압력을 릴리스합니다. 용량성 과도가 나타나지 그리고 압력의 모든 응용 프로그램을 릴리스하기 전까지 부정적인 압력을 부드럽게 펄스를 적용합니다. 도움말 : 액세스 (시리즈) 저항 (&gt; 30MΩ) 높으면, 이것은 종종 부정적인 압력을 추가, 아주 부드러운, 펄스에 의해 ameliorated 수 있습니다. </li><li> 일단 안정적인 도장은 부정적인 압력의 펄스를 적용 도달했습니다. 전체 셀 모드가 얻은 후에, 세포는 어두운 5 분 적응할 수 있습니다. 기록, 전체 필드, 흰색 가벼운 자극 (그림 1B)로 현재 클램프 모드, 응답 인치 </li><li> 기록에 따라, Alexafluor - 594은 dendrites으로 확산됩니다. 추적기는 594 nm의에서 epifluorescence에 따라 시각하고 신경절 세포가 여부에 -, epifluorescence 및 DIC 적외선 광학 5 사이의 전환에 의해 오프, 또는 이중 층상. 결정하기 위해 사용할 수 </li><li> neurobiotin가 피펫과 망막은 immunohistochemistry에 대한 처리 될 수 있습니다에 포함되어있다면, 피펫은 부드럽게 막의 최소한의 중단을 제공하기 위해 철회해야합니다. </li></ol> 기록 신경절 세포의 해부학 5) 분석 neurobiotin로 작성하면 다음과 같은 기록 신경절 세포의 형태학의 자세한 분석을 위해 수 있습니다. 팁 : 기록 신경절 세포와 세부 형태 사이의 구체적인 상관 관계가 필요한 경우, 그것이 준비 당 하나의 RGC를 기록하고 작성하는 것이 가장 수 있습니다. <ol><li> neurobiotin은 세포내 솔루션에 포함되어 있었다면 다음 paraformaldehyde 용액에 망막을 배치하고 4 박 수정 ° C. </li><li> , PBS에서 최소한 6 변경 사항을 최소한 2 시간 린스. 차단 솔루션을 포함하는 접시에 망막을 전송합니다. 쉐이크에 2 시간 실내 온도를 솔루션을 차단에 둡니다. </li><li> Streptavidin 솔루션으로 차단 솔루션을 교체합니다. 4 이일 ° 뿌리에서 C를 품어. PBS에서 망막 6 rinses, 20 분 각각 린스. </li><li> 유리 슬라이드에 Vectashield와 망막를 탑재합니다.망막은 신경절 세포와 배치해야합니다. 공촛점 현미경 (그림 1C)을 수행합니다. </li></ol> 대표 결과 망막 건강하고 절개가 성공했다면, 개별 신경절 세포는 높은 배율 (그림 1A)에서 DIC 아래에 표시해야합니다. 건강에 해로운 망막은 큰 과립 핵을하고 폐기해야합니다. 주어진 신경절 세포의 시냅스 반응이 그대로있다면, 세포는 본질적으로 - 감광성의 신경절 세포 (그림 1B), 지속적인 탈분극의 경우, 가벼운 증상에 반응 또는 행동 잠재력과 오프셋과해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/2367/2367fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 현지화, 녹음, 그리고 찬란 표시 망막 신경절 세포의 얼룩이. (A) GFP 긍정적인 RGC는 40X 배율 (왼쪽 패널)와 DIC 조명 (오른쪽 패널)에서 epifluorescent 조명 아래에서 시각. 찬란 분류 RGC에서 전체 셀 전류 클램프 모드에서 기록된 M2 본질적으로 감광성의 망막 신경절 세포의 (B) 시냅틱 라이트 반응. (C) 전체 셀 녹음 대상 epifluorescence 아래에서 확인되었다 M1 본질적으로 감광성의 망막 신경절 세포는 neurobiotin 가득 다음 immunohistochemistry에 대한 처리.

<ol>
	<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+in+the+mammalian+retina.">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li><li>Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+light+responses+in+melanopsin-expressing+ganglion+cells+during+mouse+development.">Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development.</a> J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).</li><li>Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion.">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62, 327-334 (2009).</li><li>Siegert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+address+book+for+retinal+cell+types.">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells.">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29, 476-482 (2009).</li><li>Newman, E. A., Bartosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eyecup+preparation+for+the+rat+and+mouse.">An eyecup preparation for the rat and mouse.</a> J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).</li><li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines.">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li><li>Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+retinal+dopaminergic+neurons+underlying+their+multiple+roles+in+vision.">Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision.</a> J Neurosci. 27, 692-699 (2007).</li><li>Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flattened+retina-eyecup+preparation+suitable+for+electrophysiological+studies+of+neurons+visualized+with+trans-scleral+infrared+illumination.">A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination.</a> J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).</li><li>Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+circuitry+mediating+light-evoked+signals+in+dark-adapted+mouse+retina.">Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina.</a> Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).</li></ol>

이 기술은 격리된 망막 망막 신경절로부터 세포 레코딩에 적용됩니다. 비록 위에서 사용된 마우스 라인에서 본질적으로 감광성의, melanopsin - 표현 RGCs 것은 EGFP 2, 5 표시되며,이 프로토콜은 다른 찬란 표시 RGC 라인 즉시 양도하거나뿐만 아니라 무작위로 선택된 RGCs에서 레코드에 일반 수 있습니다. 각 RGC 및 각 입력 뉴런의 돌기 아버가 전적으로 그대로 유지되기 때문에이 기술은 특히 중요...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ames&#x2019; Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A1420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS005273</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS002592</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S5761</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AlexaFluor 594 Hydrazyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobiotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>SP1120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>BF120-69-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ophthalmologic Scissor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin 594</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S32356</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>005-000-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>19210</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells

빛이 망막 1 매를과 원추형 photoreceptors을 자극하면 척추 비전의 첫 번째 단계는 이루어집니다. 이 정보는 다음 ON과 OFF 경로로 알려져 있습니다 무엇으로 차별되어 있는데. 빛의 강도 증가 (BCS에서) 또는 감소 (BCS 오프)에 대한 응답으로 depolarize 바이폴라 세포에 photoreceptors 신호 조명 정보 (BCS). 빛의 정보를이 분리들은 오프 BCS 직접 흥분성의 입력을받을 내부 plexiform 층 (IPL), 중 끄기 sublamina에 stratifying dendrites이있는 망막 신경절 세포 (RGCs)의 수준에서 유지 또는 stratifying입니다 그들은 BCS에 직접 흥분성의 입력을받을 IPL의에 sublamina. 조명 (온과 경로 끄기)의 증가 또는 감소에 대한 정보는 이러한 분리는 병렬로 보존하고 뇌에 신호입니다. RGCs은 망막의 출력 세포이며, 따라서 빛의 정보가 두뇌에 시각 핵으로 신호를 얼마나 이해하기 위해 연구하는 중요한 세포입니다. 최근 년간 마우스 유전학의 진보는 특정 RGC 인구가 electrophysiological 녹음 대상 RGC subtypes 2 3 4 특정의 식별이 가능하도록하기 위해서 형광 단백질로 분류 아르 형광 기자 마우스 라인의 다양한 결과있다. 여기, 우리는 그대로 고립되어 망막 준비에 찬란 표시 신경절 세포에서 빛을 응답을 기록하는 방법을 제시. 이 고립된 망막 준비 돌기 아버가 온전하고 전체 RGC 돌기의 아버 전체의 입력이 보존됩니다 RGCs에서 레코딩을 허용합니다. 이 방법은 신경절 세포 subtypes 다양한 걸쳐 적용되며 단일 세포 생리학 기법의 다양한 의무가 있습니다.

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An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

이 문서는 해부하다와 마우스에서 분리된 망막 준비에서 기록하는 방법에 대한 설명을 제공합니다. 특히, 우리는 찬란 표시 신경절 세포 인구의 빛을 반응을 기록하고 이후 식별하고 그 형태를 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

an-isolated-retinal-preparation-to-record-light-response-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K 조회수.  University of Minnesota. 이 문서는 해부하다와 마우스에서 분리된 망막 준비에서 기록하는 방법에 대한 설명을 제공합니다. 특히, 우리는 찬란 표시 신경절 세포 인구의 빛을 반응을 기록하고 이후 식별하고 그 형태를 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

연구

신경과학

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

망막 신경절 세포의 생존을 공부 시신경의 호감 상해 Murine 모델

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

양서류 망막 슬라이스 준비 광수와 2 차 신경 세포에서 동시에 전체 세포 녹음

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

마우스 망막 신경절 세포의 시냅스와 인공 컨덕턴스와 동적 클램프 구현

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

형광 염료와 성인 Zebrafish의 망막 신경절 세포의 퇴행성 라벨링

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

광학 일관성 단층 촬영: 마우스 망막 신경 절 세포에서 Vivo에서 화상 진 찰

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

면역 조직 화학을 위한 마우스 망막 극저온 단면도 단면도의 준비

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

망막 신경절 세포 연구를 위한 마우스 망막 분리 및 메탄올 치료

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

저자 스포트라이트: 망막 신경절 세포 연구를 위한 메탄올 기반 전체 장착 준비  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

망막 신경절 세포 조사를 위한 메탄올 기반 전체 마운트 준비

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...