VHL-MZ1 상호 작용에 대한 SPR을 수행하려면 먼저 제조업체의 지침에 따라 스트렙타비딘 칩을 활성화하십시오. 가장 높은 농도를 만들기 위해 MZ1에 DMSO가 없는 완충액을 추가하여 2%DMSO 농도를 보장합니다. 이제 50 마이크로리터의 최고 농도 용액을 100 마이크로리터의 러닝 버퍼가 들어 있는 웰에 피펫팅합니다. 두 번째로 높은 농도를 설정하기 위해 잘 섞습니다.
그런 다음 용액 50 마이크로 리터를 다음 100 마이크로 리터의 러닝 버퍼로 옮기고 잘 혼합하여 세 번째로 높은 농도를 준비하는 식입니다. 폴리프로필렌 마이크로플레이트와 호환되는 접착식 투명 플라스틱 호일을 사용하여 플레이트를 덮습니다. 다중 주기 설정을 사용하여 SPR을 시작합니다.
모드를 고성능으로, 접촉 시간을 120초로, 해리 시간을 300초로, 유량을 분당 50마이크로리터로 설정합니다. 기기 제조업체에서 제공하는 평가 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 실행합니다. VHL-MZ1-BRD4 삼원 복합체에 대해 SPR을 수행하려면 먼저 스트렙타비딘을 활성화하십시오.
VHL 용액을 주입하여 약 100개의 공명 단위에 고정시킵니다. BRD4만 사용하는 음성 대조군의 경우 200마이크로리터 부피의 러닝 버퍼에 가장 높은 농도인 25마이크로몰을 준비합니다. 다음 4개의 웰에 각각 2마이크로몰 BRD1604를 추가합니다.
우물 A40에서 A5로 4 마이크로 리터를 옮깁니다. 그런 다음 웰을 피펫팅하여 완전히 혼합합니다. 마찬가지로 우물 A4에서 A3로 40마이크로리터를 옮기고 A1에 도달할 때까지 이 과정을 계속합니다. MZ1 및 BRD4를 사용한 삼원 복합체 형성을 위해 25.5마이크로몰 BRD4 용액 196마이크로리터를 피펫팅합니다. 여기에 100% DMSO 용액으로 제조된 20마이크로몰 MZ1 4마이크로리터를 추가합니다.
피펫 160 마이크로 리터의 BRD4 러닝 버퍼의 2 마이크로 몰에서 왼쪽의 다음 4 개의 웰로 피펫. 다음으로 40 마이크로 리터를 웰 B5에서 B4로 옮기고 피펫을 옮겨 완전히 혼합합니다. 각 웰에서 B1까지 용액을 계속 옮깁니다. 이제 접촉 시간 100초, 해리 시간 720초, 분당 50마이크로리터의 유속으로 SPR을 단일 사이클 설정으로 실행합니다.
VHL-MZ1 바이너리 복합체 및 VHL-MZ1-BRD4 삼원 복합체의 특성 분석을 수행하였다. 긍정적인 협력성이 관찰되었습니다. 대뇌, PROTAC 및 PPM1D 시스템의 특성 분석은 SPR에 의해 수행되었습니다.
PPM1D 실험은 니켈 NTA 칩을 사용하며 각 화합물 주입 후 칩 표면이 재생됩니다. 대뇌에만 결합하는 BRD-2512와 PPM1D에만 결합하는 BRD-4761은 무시할 수 있는 결합 반응을 보입니다. BRD-5110은 PPM1D 사이의 삼원 복합체의 형성을 유도하고 높은 화합물 농도에서 후크 효과를 보여줍니다.
