이 방법은 화학 생물학 및 약물 발견의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 화합물은 표적 단백질에 결합합니까? 이 기술의 주요 장점은 부착 된 세포의 분리 요구 사항이 없다는 것입니다.
그리고 공간 국소화는 이미징에 의해 결정될 수 있다. 우리는 세포주에서 이 방법을 적용했습니다, 1 차적인 배양 및 동배와 같은 그밖 세포 시스템에 이 방법을 적용하는 것은 또한 가능합니다. 세포를 파종하기 전에, 조직 배양 후드에 검은 색 384 웰 이미징 분석 플레이트를 배치하고, 각 플레이트의 양쪽 끝에 세 개의 3.5 밀리미터 직경 구멍을 만들기 위해 표준 드릴을 사용하기 전에 알루미늄 호일로 플레이트를 덮어.
플레이트가 준비되면 무균 기술을 사용하여 PBS의 5~10밀리리터로 A-431 세포 배양을 세척합니다. 그리고 세포가 분리 될 때까지 섭씨 37도에서 트립신의 2 밀리리터로 세포를 배양합니다. 세고 후, 배양 배지에서 밀리리터당 4번째 세포로 세포를 5배 10배, 각 분석판의 각 웰에 40마이크로리터의 종자하였다.
시드 후 각 플레이트를 좌우로 부드럽게 흔들어 우물 바닥을 가로질러 세포의 균질한 분포를 보장합니다. 플레이트 엣지 효과를 최소화하기 위해, 세포가 라미나르 유동 후드 뒤쪽의 실온에서 20분 동안 분석 플레이트의 바닥에 정착한 후 37°C와 이산화탄소 5%에서 2~3일 동안 사용자 지정 가습 챔버에 플레이트를 배치하도록 한다. 실험 당일, 플레이트 와셔를 사용하여 각 우물에서 배지를 흡인시합니다.
그리고 적절한 실험적 우물에 적절한 실험 농도에 관심 있는 화합물의 30 마이크로리터를 첨가한다. 통기성 플레이트 씰로 화합물 처리 분석 플레이트를 밀봉하십시오. 그리고 30 분 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 반환합니다.
열 과제에 세포를 노출하려면 먼저 수조를 적절한 실험 온도로 설정하고, 우물 내온도를 모니터링하기 위한 온도대 온도계와 함께 분석 플레이트와 동일한 양의 매체를 포함하는 밀봉되지 않은 더미 플레이트를 욕조에 배치합니다. 적절한 실험 온도에 도달하면 각 분석 판에서 통기성 씰을 제거하고 단단한 접착제 알루미늄 호일로 플레이트를 다시 밀봉하여 수조에서 후속 가열 중에 우물에 물이 누출되지 않도록하십시오. 플레이트 프레임 내에서 드릴링된 구멍을 액세스할 수 있도록 유지합니다.
분석 플레이트와 새로운 더미 플레이트를 수조에 넣고 플레이트의 바닥이 수면쪽으로 기울어져 플레이트 아래에서 남은 공기를 강제로 밀어 내고 새로운 더미 플레이트의 온도를 모니터링합니다. 접시의 균일 한 가열은 분석 성능에 매우 중요합니다. 밑에 기포가 갇혀 있지 않습니다 있도록 수조에 접시를 배치주의하십시오.
3분 후, 분석 전에 5분 동안 실온 수의 두 번째 수조에서 플레이트를 즉시 식힙니다. 세포를 이미지화하기 위해 먼저 16%의 파라포름알데히드 10마이크로리터를 실온에서 20분 배양하기 위해 분석 판에 직접 추가합니다. 고정 기간이 끝나면 플레이트 세탁기에 PBS 300 마이크로리터로 셀을 세척하고 실온에서 10분 동안 0.1%NP40의 마이크로리터 20을 추가합니다.
인큐베이션의 끝에서, 입증 된 대로 세포를 씻어. 그리고 실온에서 1시간 동안 1%소 세럼 알부민 또는 BSA의 15 마이크로리터로 세포를 차단한다. 다음으로, 플레이트 와셔를 사용하여 차단 혈청을 흡인시키고, 1차 항체의 마이크로리터를 실온에서 1시간 배양에 적합한 우물에 첨가한다.
인큐베이션이 끝나면 PBS 300 마이크로리터로 각각 잘 세척하고, 빛으로부터 보호되는 실온에서 1시간 동안 적절한 이차 항체의 10 마이크로리터로 세포를 라벨로 부착한다. 세포의 핵 염색의 경우 실온에서 10 분 동안 각 우물에 적절한 핵 염료 10 마이크로 리터를 추가하십시오. 그리고 입증 된 바와 같이 PBS에서 세포를 씻어.
실온에서 30분 동안 셀 마스크 10마이크로리터로 셀에 라벨을 부착합니다. 다음에 PBS와 마지막 세척. 그런 다음 60 마이크로리터의 신선한 PBS를 각 우물에 분배하고 이미징이 될 때까지 알루미늄 호일로 플레이트를 밀봉합니다.
세포를 이미지화하기 위해 자동 레이저 자동 초점을 사용하여 10배 의 목표에 따라 적절한 형광 채널을 사용하여 고함량 이미저에 4개의 이미지를 캡처하고 획득 하는 동안 비닝을 적용합니다. 그런 다음 이미지를 메타데이터와 함께 16비트 그레이스케일 도트-티프 파일로 저장합니다. 항체 인식은 리간드 결합에 의해 유도될 수 있는 표적 단백질의 형성 변화에 의해 중단되어서는 안 된다.
예를 들어, BIRB796은 긴 오프 레이트를 가지며, 표적 교합의 정량화는 항원 검색 단계를 적용하여서만 가능하다. 양성 및 음극성 대조군 화합물로 처리된 세포를 위한 대표적인 열 응집 곡선 실험은 다양한 온도에서 화합물을 가진 세포의 처리 후 전형적인 단백질 안정화 범위를 보여줍니다. 여기서 전형적인 이더스말 투여량 반응 지문 실험은 실험 화합물의 상이한 투여량에 반응하여 단백질 안정화의 대표적인 범위를 입증하는 것으로 나타났다.
표적 단백질의 새로운 바인더를 식별하기 위한 화합물 스크리닝을 위한 이더말 열 과제의 적용은 표적 단백질 안정화를 확인하기 위해 안타의 더체말 투여 응답 지문 전에 한 번에 한 농도로 많은 수의 화합물을 분석할 수 있게 한다. 이 절차를 시도하는 동안, 열 도전의 길이 및 온도와 같은 정확한 실험 조건이 화합물의 관찰 된 효능에 영향을 미친다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 파라포름알데히드로 일하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.
그리고 이 절차를 수행하는 동안 제도적 안전 지침을 따르는 것과 같은 예방 조치는 항상 취해야 합니다.
