시작하려면 EV 트랩 접근 방식을 사용하여 인간의 소변에서 얻은 건조된 세포외 소포체 샘플을 채취합니다. 표시된 성분으로 새로운 용해 완충액을 준비합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 용해 완충액을 추가하여 건조된 EV 샘플을 용해시킵니다.
샘플을 섭씨 95도에서 10분 동안 가열하고 1, 100RPM으로 흔듭니다. 샘플을 실온으로 냉각한 후 400마이크로리터의 50밀리몰 TEAB를 추가하여 5배로 희석합니다. 제조업체의 지침에 따라 BCA 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
트립신과 라이신 C 혼합물을 샘플에 넣고 섭씨 37도에서 밤새 배양하고 1, 100RPM으로 흔듭니다. 그런 다음 50 마이크로 리터의 10 % 트리 플루오로 아세트산 또는 TFA를 첨가하여 샘플을 산성화합니다. 또한 샘플에 600 마이크로 리터의 에틸 아세테이트를 첨가하고 혼합물을 2 분 동안 소용돌이 치게합니다.
20, 000 G에 3 분 동안 표본을 분리하고 공용영역을 교란 없이 주의깊게 위 층을 제거한다. 진공 원심분리기 농축기를 사용하여 수성상을 건조합니다. 이제 건조된 샘플을 200마이크로리터의 0.1%TFA에 재현탁시켜 펩타이드를 산성화합니다.
샘플을 탈염하려면 CA18 탈염 팁을 사용하여 200마이크로리터의 0.1%TFA와 80%아세토니트릴로 컨디셔닝한 다음 200마이크로리터의 0.1%TFA로 두 번 세척합니다. 산성화된 펩타이드 샘플을 팁에 넣고 0.1%TFA 200마이크로리터로 3회 세척합니다. 0.1% TFA와 80% 아세토니트릴의 200마이크로리터로 펩타이드를 용리합니다.
시연된 바와 같이 용리액을 추출한 후, 인산펩타이드 농축을 위해 200마이크로리터의 로딩 완충액에 건조된 인산단백질체학 샘플을 재현탁시킵니다. 샘플에 50마이크로리터의 비드를 넣고 실온에서 20분 동안 세게 흔듭니다. 비드와 함께 샘플을 프릿 팁에 넣고 100 G.Wash에서 1 분 동안 팁을 200 마이크로 리터의 로딩 버퍼로 연속적으로 세척하고 버퍼 1과 2를 세척합니다.
비드가 있는 팁을 새 튜브에 넣어 제거된 인산펩타이드를 수집합니다. 팁에 50마이크로리터의 용출 완충액을 추가하고 20G에서 2분 동안 원심분리한 다음 진공 원심분리기 농축기를 사용하여 제거된 인산펩타이드를 건조시킵니다.
