이 기술의 주요 장점은 봉투, 스트로마 또는 틸라코이드 막의 국소화에 따라 다른 역할을 하는 유사한 활동의 단백질을 구별할 수 있다는 것입니다. 일반적으로,이 방법에 새로운 개인투쟁 합니다., 그들은 너무 오래 된 식물을 사용 하기 때문에, 너무 오래 잎을 혼합, 또는 그대로의 펠 릿을 다시 중단 하는 경우 충분히 조심 하지 않습니다., 하지만 깨지기 쉬운, 엽록체. 이 방법의 시각적 데모는 percoll 또는 자당 그라데이션 단계에서 분수의 적재 또는 복구가 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.
그라데이션의 혼합 위험 때문에 다양한 엽록소 서브 분획을 교차 오염시합니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실에서 박사 과정 학생인 이멘 부흐낙(Imen Bouchnak)과 실내 엔지니어인 루카스 모예트(Lucas Moyet)가 시연할 것입니다. 우선, 12시간 광주기로 5주 동안 아라비도시스 식물을 재배하고 밤에는 섭씨 23도, 밤에는 18도의 가벼운 강도로 초당 평방 미터당 150 마이크로몰러를 사용하게 됩니다.
다음 날, 5 리터 비커를 미리 무게와 얼음에 배치합니다. 애기독증 잎을 수확하여 토양을 따기 피하십시오. 비커의 무게를 재측정하고 조직 무게를 기록합니다.
수확한 잎을 차가운 방으로 옮깁니다. 잎을 두 리터의 연삭 버퍼가 들어 있는 블렌더에 넣고 매번 2초 동안 고속3번 블렌딩하여 균질화합니다. 모슬린 의 네 층과 나일론 블루 텍스의 한 층을 여조기에 넣고 이를 필터링합니다.
혼합된 잎을 모슬린과 블루 텍스 내부로 부드럽게 짜서 모든 액체를 추출합니다. 블렌더 컵에 남은 조직을 회수하고 신선한 연삭 버퍼를 사용하여 균질화 과정을 반복합니다. 4~5개의 새 모슬린 레이어를 사용하여 이전에 설명한 대로 새 비커에서 이 새로운 동형모네이트를 필터링합니다.
6 개의 500 밀리리터 병에 원유 세포 추출물을 동등하게 분배합니다. 병을 얼음 위에 놓습니다. 2070 G에서 차가운 병을 원심 분리하고 섭씨 4도에서 2 분 동안.
그 후, 부드럽게 상체를 폐기. 물 펌프를 사용하여 남은 수퍼네티를 흡인하고 농축 된 원유 클로로플라스트를 포함하는 펠릿을 얼음에 보관하십시오. 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 각 병에 3 밀리리터의 세탁 매체를 추가하여 엽록소가 부서지지 않도록 미세파이펫 팁을 사용하지 않도록 하십시오.
그런 다음 페인트 브러시 또는 곡선 플라스틱 주걱을 사용하여 펠릿을 부드럽게 다시 중단합니다. 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 단일 튜브에서 다시 중단된 엽록소를 수집합니다. 균질엽산염 서스펜션을 얻기 위해 튜브를 부드럽게 반전시다.
시작하려면 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 준비된 6개의 퍼콜링 그라데이션 위에 엽록체 서스펜션 6밀리리터를 천천히 로드합니다. 스윙 버킷 로터를 사용하여 13, 300 G 및 섭씨 4도에서 10분 동안 그라데이션을 원심분리합니다. 물 펌프를 사용하여 부서진 엽록체와 그대로 미토콘드리아가 포함된 상위를 흡인합니다.
그런 다음, 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 하부에 존재하는 손상되지 않은 엽록체를 회수하고, 튜브 의 바닥에서 발견되는 핵및 세포 파편을 그대로 엽록체와 함께 흡인시키지 않도록 주의하십시오. 그대로 엽록소 액수 서스펜션을 세척 매체로 3~4배 희석합니다. SDS 페이지와 서양 얼룩에 의해 추가 분석을 위해 약 10 밀리리터의 손상되지 않은 엽록소 분획을 보관하십시오.
2070 G의 원심 분리기와 섭씨 4도2분. 그 후, 부드럽게 상체를 폐기. 물 펌프를 사용하여 남은 수퍼네티를 흡인하고 농축 된 원유 엽록물이 들어있는 펠릿을 얼음위에 보관하십시오.
정제된 그대로 엽록체를 lyse하려면 프로테아제 억제제가 포함된 저혈압 배지에서 펠릿을 다시 중단합니다. 다시 매달린 엽록체를 10 밀리리터 팔콘 튜브로 옮기습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 자당 그라데이션을 준비합니다.
연동 펌프를 사용하여 미리 형성된 자당 그라데이션 의 상단에 용액 엽록체 3 밀리리터를 천천히 로드합니다. 저혈압 중간 버퍼를 사용하여 튜브 쌍의 균형을 맞추고, 1시간 동안 70, 000 G 및 섭씨 4도에서 그라데이션을 매우 원심분리합니다. 단백질 농도의 결정에 사용되는 용해성 기질 단백질의 알리쿼트복용.
다음으로, 물 펌프를 사용하여 그라데이션의 나머지 상층을 노란색 대역까지 흡인시합니다. 파이펫을 사용하여 봉투인 노란색 밴드를 검색합니다. 봉투를 하나의 튜브로 당깁니다.
그런 다음 그라데이션의 나머지 단계를 틸라코이드 펠릿까지 제거합니다. 프로테아제 억제제로 멤브레인 세척 완충제에서 틸라코이드 펠릿을 다시 중단합니다. 틸라코이드 서스펜션을 희석하고 세척 매체로 3~4배 봉투를 희석하여 최종 부피를 10밀리리터로 조정합니다.
1시간 동안 110, 000G 및 섭씨 4도에서 멤브레인 세척 완충제와 초원심분리기의 튜브 쌍을 균형 있게 조정합니다. 그 후 워터 펌프를 사용하여 수퍼나티를 조심스럽게 흡인시합니다. 봉투 펠릿에 약 100 마이크로리터의 멤브레인 세척 버퍼를 넣습니다.
그런 다음, 틸라코이드 튜브에서 상체를 흡인. 멤브레인 세척 버퍼의 세 밀리리터에서 틸라코이드 펠릿을 다시 중단합니다. 추가 실험에 사용하기 위해 3개의 정제된 하위 구획을 액체 질소에 보관합니다.
멤브레인 분획이 회수, 세척 및 농축된 후, SDS-Page는 단백질을 정량화하고 4개의 분획의 조성물을 분석하는 데 사용됩니다. 스트로마에서 가장 풍부한 단백질은 RBCL이며, 대표적인 결과는 예상되는 결과를 나타내며, 이 단백질의 큰 서브유닛 중 거의 틸라코이드 및 봉투 막 분획이 포함되어 있지 않다는 것을 나타낸다. 가벼운 수확 복합 단백질은 봉투 막을 거의 오염시켜야 하는 풍부한 틸라코이드 성분입니다.
마지막으로, 인산삼염 트랜스로케이터는 전체 엽록체 추출물과 비교할 때 봉투 분획에 강한 농축으로 인해 정제된 봉투 분획에서만 볼 수 있다. 3개의 하위 구획의 교차 오염, 기질로부터의 수용성 케톨산 재유도, 클로로푸스 봉투 구리 ATPase 및 틸라코이드 멤브레인에서의 가벼운 수확 복합 단백질은 면역 블로팅 및 질량 분광법 분석을 모두 사용하여 정량화될 수 있다. 스트로마는 일반적으로 봉투 또는 틸라코이드 분획에 의해 오염되지 않지만, 정제 된 봉투 분수는 3 % 틸라코이드 단백질과 스트로마에서 단백질의 최대 10 %를 함유하고 있습니다.
틸라코이드는 스트로마의 단백질에 의해 오염되지 않지만 봉투 막 단백질의 최대 3%를 함유하고 있습니다. 엽록소는 탄소, 황 및 질소의 동화뿐만 아니라 필수 대사 산물의 합성과 같은 많은 중요한 기능을 수행합니다. 엽록소 생리학을 제어하는 새로운 규제 메커니즘을 해독하기 위해서는 엽록소 세포 단백질의 절립 지역화를 정의하는 것이 초표적 연구에 매우 중요합니다.
엽록체에는 여러 하위 구획이 포함되어 있습니다. 이 방법은 특정 엽록과 단백질이 세포기관 내에 있는 곳과 같은 엽록체 필드의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 정제 된 분수로 프로테아 저항을 송금하기 위해 4도에서 엽록소 절연 단계를 모두 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라, lascare proteomic 접근과 같은 다른 방법은 플라스티드 하위 구획값의 프로테오메의 조성 및 역학과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다. 개발 후, 이 기술은 식물 생리학 분야의 연구원들이 플라스티드 하위 구획 내에서 확인된 후보 단백질의 표적 분석을 사용하여 엽록세포 생체 발생 및 기능의 여러 측면을 탐구하는 길을 열었습니다. 프로테아제 억제제와 같은 특정 화합물에 대한 부피 블렌더, 액체 질소를 사용하려면 특별한 주의가 필요하다는 것을 잊지 마십시오.
이 절차를 수행하는 동안 장갑, 실험실 코트 및 안전 안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야합니다.
