시작하려면 미리 데워진 효소 세포 분해 시약이 들어있는 15밀리리터 튜브를 섭씨 37도 인큐베이터에 사용할 때까지 넣습니다. 500마이크로리터의 갓 준비된 PBS/EDTA를 24웰 플레이트의 웰에 분양합니다. 명시야 현미경으로 분화된 3차원 인간 장 오가노이드 및 트랜스웰의 성장을 관찰합니다.
세포 배양 삽입물을 성장 배지에서 PBS/EDTA 용액으로 옮깁니다. 정점 쪽에서 배양 배지를 제거하고 세포층을 방해하지 않고 100마이크로리터의 PBS/EDTA로 교체합니다. PBS/EDTA를 버린 후 우물에서 인서트를 제거하고 종이 타월의 가장자리에 부드럽게 닦아낸 다음 벤치 상단에 뒤집습니다.
날카로운 메스 칼날을 사용하여 멤브레인의 내부 둘레 주위를 절단하여 인서트에서 멤브레인을 제거합니다. 겸자가 있는 멤브레인을 200마이크로리터의 예열된 효소 세포 분해 시약이 들어 있는 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 멤브레인을 섭씨 37도에서 이산화탄소 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다.
10분마다 P 200 피펫을 사용하여 전체 부피를 5회 피펫팅합니다. 10분마다 1-2 마이크로리터의 세포 현탁액을 유리 슬라이드로 옮겨 단일 세포의 비율을 정성적으로 평가하여 해리를 평가합니다. 해리 후에는 단일 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 조건당 3개의 복제 웰을 결합합니다.
10마이크로몰 ROCK 억제제가 함유된 세포 배양 분화 배지 400마이크로리터를 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 70 미크론 팁 스트레이너를 통해 전체 부피를 여과하여 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 플로우 스루를 수집합니다. 그런 다음 70미크론 스트레이너를 통해 얻은 플로우스루를 40미크론 팁 스트레이너에서 필터링합니다.
5 마이크로리터의 0.4% 트리판 블루를 5 마이크로리터의 세포 현탁액에 첨가하고 생존 가능한 단일 세포를 계산합니다. WRNE 성장 매체로 표본을 1개, 마이크로리터 당 000의 세포를 얻기 위하여 묽게 하십시오. 총 5,623개의 단일 세포를 막 세포 배양 삽입물에서 성장한 분화된 jejunal 인간 장 오가노이드에서 분리했습니다.
