먼저 인간 장 오가노이드 분해를 위한 효소 세포 분해 시약과 PBS/EDTA를 준비합니다. 명시야 현미경으로 분화된 3차원 인간 장 오가노이드의 성장을 단층으로 확인합니다. 단층 배양에서 세포 배양 배지를 폐기하고 100마이크로리터의 PBS/EDTA로 교체합니다.
PBS/EDTA를 제거한 후 각 웰에 100마이크로리터의 따뜻한 효소 세포 분해 시약을 추가합니다. 접시를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 인큐베이터에 놓고 20-30분 동안 10분마다 5회 전체 부피를 피펫팅합니다. 10분마다 1-2 마이크로리터의 세포 현탁액을 유리 슬라이드에 옮겨 단일 세포의 비율을 관찰하여 해리를 평가합니다.
해리 후에는 단일 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 조건당 3개의 복제 웰을 결합합니다. 10마이크로몰 ROCK 억제제가 함유된 세포 배양 분화 배지 700마이크로리터를 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 70 미크론 팁 스트레이너를 통해 전체 부피를 여과하여 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 플로우 스루를 수집합니다.
70미크론 팁 스트레이너에서 40미크론 스트레이너를 통해 얻은 플로우 스루를 필터링합니다. 5마이크로리터의 0.4% 트리판 블루를 5마이크로리터의 세포 현탁액에 첨가하고 생존 가능한 단일 세포를 계산합니다. ROCK 억제제를 함유한 세포 배양 매체로 샘플을 희석하여 1, 마이크로리터 당 000개의 세포를 얻는다.
총 9,952개의 단일 세포를 96개의 웰 플레이트에서 성장한 분화된 장 인간 장 오가노이드에서 분리했습니다.
