시작하려면 해부 현미경, 끝이 가는 두 개의 집게, 가위, 1밀리리터 주사기 바늘 및 여과지를 작업 플랫폼에서 조립합니다. 다음으로, 팔꿈치 가위를 사용하여 마취된 쥐의 눈에 핵을 제거합니다. 0.1 몰 인산염 완충액에 4% 파라포름알데히드와 0.2% 피크르산이 함유된 유리 접시에 눈을 넣습니다.
해부 현미경에서 1밀리리터 주사기를 사용하여 각막 림부에 구멍을 뚫고 가위로 앞쪽 부분을 잘라냅니다. 겸자를 사용하여 내부 망막 표면에서 수정체를 제거합니다. 이제 두 개의 집게를 사용하여 망막이 안구에서 완전히 분리될 때까지 공막을 조심스럽게 벗겨냅니다.
그런 다음 망막을 네 조각으로 자릅니다. 하룻밤 고정과 4% 파라포름알데히드 용액 후, 망막 조직을 0.01몰 PBS에서 각각 10분 동안 6회 세척합니다. 망막 조직을 1% 수소화붕소나트륨에 0.01몰 PBS로 30분 동안 배양합니다.
다시 말하지만, 0.01 molar PBS로 망막 절편을 최소 6회 세척합니다. 그런 다음 여과지로 유리체를 제거합니다. 그리고 양날 면도날을 사용하여 망막을 100에서 300마이크로미터 사이의 작은 부분으로 자릅니다.
망막 줄무늬를 0.01몰 PBS에서 각각 10분 동안 6회 세척한 후 ABC 키트의 시약 A와 시약 B로 2일 동안 배양합니다. 다음으로, 0.05 몰 트리스 완충액으로 망막 줄무늬를 각각 10분 동안 세 번 세척합니다. 디아미노벤젠 또는 DAB 키트의 5% 시약 1 및 5% 시약 3으로 망막 줄무늬를 증류수에 넣고 실온에서 1시간 동안 사전 배양합니다.
망막 줄무늬를 DAB로 염색하려면 DAB 키트에 있는 3개의 튜브에서 동일한 양의 용액을 순서대로 추가합니다. 해부 현미경으로 염색 상태를 관찰합니다. 0.05 molar tris buffer로 망막 스트립을 각각 10분 동안 세 번 세척합니다.
마지막으로 0.01몰 PBS로 스트립을 각각 10분 동안 6회 세척합니다. 대조군 실험에서, 두 개의 리본이 있는 원뿔 척추경과 하나의 리본이 있는 막대 구형은 1차 항체가 없는 상태에서 면역 반응을 보이지 않았습니다. 단백질 키나아제 C 알파는 망막에서 간상 양극성 세포를 식별했습니다.
DAB 스탠딩은 단백질 키나아제 C 알파 및 양극성 세포 수상돌기의 존재를 보여주며, 외부 망상층에서 막대 및 원뿔 말단과 시냅스를 형성합니다. 또한 DAB 반응 산물은 내부 망상층에서 간상 양극성 세포 말단과 축삭 돌기를 식별하는 데 도움이 됩니다. 물질 P 면역 반응성 무축삭 세포는 물질 P 음성 무축삭 세포에 대해 시냅스전(presynaptic)인 것으로 나타났습니다.
더욱이, 물질 P 면역 반응성 무축삭 세포는 각각 내부 망상층의 아층 3 및 아층 5 레벨에서 시냅스 후 양극성 말단에 있었습니다.
