Isolation of Retinal Capillaries from a Mouse Eye for Atomic Force Microscope 강성 측정

시작하려면 해부 현미경 아래에서 왁스 종이 조각에 공식적이고 고정된 마우스 눈을 놓습니다. 한 쌍의 마이크로 집게를 사용하여 근육과 시신경의 잔여물을 잡습니다. 그런 다음 각막이 한쪽을 향하도록 눈의 방향을 맞춥니다.

이제 수술용 칼날을 사용하여 변두리와 평행하게 1-2mm 길이의 절개를 합니다. 앞쪽 부분이 뒤쪽 끝에서 분리될 때까지 눈을 제자리에 고정하면서 칼날로 아래쪽으로 힘을 가합니다. 그런 다음 앞쪽 분절과 수정체를 버립니다.

후방 분절을 PBS로 채워진 6cm 접시에 옮깁니다. 마이크로 주걱을 사용하여 망막을 퍼내는 동시에 마이크로 집게로 시신경을 고정합니다. 망막을 헹구려면 이중 증류수로 채워진 6개의 웰이 있는 12웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.

P1000 피펫을 사용하여 물을 불어 부드럽게 교반하면서 망막에 인접한 물을 위아래로 조심스럽게 피펫팅합니다. 다음으로, 도립 유리 피펫을 사용하여 망막을 두 번째 웰로 옮깁니다. 망막을 소화하려면 헹궈낸 망막을 반전 유리 피펫이 있는 12웰 플레이트의 트립신 용액에 넣습니다.

트립신에 적신 P200 피펫 팁을 시신경 중앙에 놓습니다. 그런 다음 전체 혈관 네트워크를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 비혈관 조직을 해리합니다. 이제 트립신으로 미리 헹구는 도립 유리 피펫을 사용하여 망막 혈관을 6웰 플레이트에 이중 증류수가 들어 있는 웰로 옮깁니다.

플레이트를 휘젓고 역트립신으로 헹궈낸 유리 피펫으로 혈관을 위아래로 피펫팅하여 잔류 비혈관 조직을 제거합니다. 망막 혈관을 하전 표면 현미경 슬라이드에서 표시된 영역의 중앙으로 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 P200 피펫을 사용하여 한쪽 가장자리에서 과도한 물을 조심스럽게 제거합니다.

슬라이드를 전면에 가까운 생물 안전 캐비닛에 놓아 잔류 물이 증발하도록 합니다. 혈관이 거의 건조되면 위상차 현미경으로 옮깁니다. P200 피펫을 사용하여 표시된 부위의 한쪽에 이중 증류수를 천천히 추가하여 혈관 조직에 조심스럽게 수분을 보충합니다.

분리된 망막 혈관을 고정한 결과 AFM 측정에 적합한 구조적으로 견고하고 충분히 내구성이 있는 조직이 생성되었습니다. 반면, 고정되지 않거나 잠시 고정된 눈에서 고립된 망막혈관은 파편화되고 붕괴되었습니다.