우리는 원래 단일 분자 준비 프로토콜에 대한 박사 틸 뵈킹 감사합니다. 
이 작업은 NSF 교부금 1121972(SS)에 의해 지원되었습니다.

1. 화학 준비
<ol><li>PLL-g-PEG-비오틴 및 아비딘의 준비 및 저장:<ol>
<li>1.0 mg/ml의 농도에서 제조업체의 지시에 따라 PBS 버퍼에서 폴리머 PLL-g-PEG-biotin을 용해하십시오.</li>
		<li>표지 슬립 크기에 따라 알리 쿼트 (표 1참조) 최대 1 년 동안 -80 °C에 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>아비딘/노이트르아비딘의 준비 및 보관<ol>
<li>1.0 mg/ml의 농도에서 제조업체의 지시에 따라 PBS 버퍼에서 라벨이 없는 아비딘/NeutrAvidin을 용해하십시오.</li>
		<li>표지 슬립 크기에 따라 알리 쿼트 (표 1참조) 최대 3 년 동안 -20 °C에 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>바이러스 샘플 준비: 이 분석 전에 실험적 필요 및 실험실 프로토콜에 따라 바이러스 샘플을 준비합니다. 방법 5A용 단계 1.3.1 또는 방법 5B의 경우 1.3.2를 활용한다.<ol>
<li>2단계 전에 5A 방법에 대한 바이러스 샘플을 준비한다. 준비 후 1-2일 이내에 준비된 바이러스 성 시료를 활용하거나, 커버 슬립 크기에 따라 알리쿼트(표 1참조)를 한 다음 액체 질소에 플래시 동결하고 최대 1년 동안 -80°C에 보관하십시오. 해동 시 즉시 사용하십시오.</li>
		<li>1.3.1과 유사한 방법 5B에 대한 바이러스 샘플을 준비합니다. 5B에 앞서 바이러스의 알리쿼트를 해동하고 항체와 혼합하기 전에 24 시간 이상 4 °C에 저장하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험에 적합한 생체 개화 항체를 준비하십시오.</li>
</ol>2. 화학 적 치료 준비에 커버 슬립 청소
<ol><li>커버립을 수직 방향으로 잡고 여과(0.2 μm) 에틸 알코올(190 증거)으로 채워진 비커에 담는 적절한 크기의 테플론 커버슬립 랙에 커버립을 놓습니다.</li>
	<li>30 분 동안 여과 된 에틸 알코올 (190 증거)에서 커버립을 초음파 처리합니다.</li>
	<li>알코올에서 커버립을 제거하고 초순수물로 커버립을 광범위하게 헹구습니다.</li>
	<li>헹구는 커버립을 별도의 깨끗한 테플론 랙에 놓고 1M NaOH로 채워진 비커를 놓습니다.</li>
	<li>1 M NaOH에서 30분 동안 커버립을 초음파 처리합니다.</li>
	<li>NaOH에서 커버립을 제거하고 초순수물로 광범위하게 헹구습니다.</li>
	<li>헹구는 커버를 질소 스트림으로 말리고 깨끗하고 건조한 테플론 랙에 넣습니다.</li>
	<li>커버슬립에 남아 있는 눈에 보이는 필름이나 파티클에 대해 커버립을 검사합니다. 눈에 보이는 재료가 남아 있으면 커버슬립이 제대로 세척되지 않고 헹구지 않았습니다. 제대로 청소하지 않은 경우 반복 단계 2.1-2.7.</li>
	<li>2 분 동안 산소 플라즈마로 커버립을 청소하십시오. 이 단계는 선택 사항이지만 권장됩니다.</li>
</ol>3. PLL-g-PEG 박막 층 형성
<ol><li>질소 스트림(또는 선택적 산소 플라즈마)에서 건조한 직후, 멸균 페트리 접시에 뚜껑을 수평으로 놓습니다. 커버의 중심에 파이프슬립 해동 된 PBS 의 적절한 양의 PLL-g-PEG-비오틴을 버퍼링 (표 1참조).</li>
	<li>또 다른 청소 커버 슬립을 샌드위치 방법으로 유체 위에 놓습니다. 이 방법은 현재 화학 층으로만 분리된 화학적 처리된 "활성 면"을 서로 방향으로 향하여 화학 필름을 배양하는 두 개의 커버립을 갖는 것으로 구성됩니다. 두 커버립 사이의 부피가 완전히 유체로 채워지지만 커버립 사이에 유체가 누출되지 않도록 충분한 유체가 있는지 확인하십시오(표 1참조). "액티브 페이스"는 이제부터 샌드위치 구성의 유체와 접촉한 커버슬립 면을 지정합니다.</li>
	<li>페트리 접시 뚜껑을 커버슬립 샌드위치 위에 놓고 RT에서 45-60분 동안 배양합니다.</li>
	<li>페트리 접시 뚜껑을 제거하고 핀셋으로 샌드위치를 집어 들세요. 과도한 액체를 꼬집어하지 않도록주의하십시오. 엄지와 검지 손가락을 사용하여 샌드위치를 가볍게 꼬집어 서로 반대로 커버립을 수평으로 밀어 넣은 다음 활성 면을 건드리지 않고 두 개의 커버립을 서로 분리합니다.</li>
	<li>활성 면 25ml를 액티브 페이스 2-4배 위에 파이프로 파이프를 한 다음 질소 스트림으로 커버립을 건조시켜 두 활성 면을 초순수물로 헹구십시오. 어떤 커버슬립 면이 활성화되어 있는지 주의해야 합니다.</li>
	<li>커버립을 즉시 활용하거나, 활성 면을 먼지가 없는 낮은 습도 환경에 배치한 멸균 페트리 접시에 활성 면을 업하여 O/N을 보관하십시오.</li>
</ol>4. 아비딘 바인딩 향상
<ol><li>PLL-g-PEG 처리 커버슬립을 활성 페이스업에 멸균 페트리 접시에 올려 놓습니다.</li>
	<li>파이펫은 활성 면의 중간에 버퍼(1.2단계에서 준비)에 적절한 양의 해동 아비딘을 적당히 적어 보입니다.</li>
	<li>샌드위치 방법의 유체 위에 다른 커버슬립(액티브 페이스 아래쪽)을 놓습니다. 커버립의 활성 면을 기록합니다. 활성 면이 인큐베이션 중에 유체와 접촉하는 것이 중요합니다(단계 3.2 참조).</li>
	<li>페트리 접시 뚜껑을 커버슬립 샌드위치 위에 놓고 RT에서 25-30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>페트리 접시 뚜껑을 제거하고 3.4 단계에서 설명한 대로 두 개의 커버립을 분리하여 활성 면을 추적하고 만지지 않도록 합니다.</li>
	<li>활성 면 25ml를 활성 면에 2-4배 파이프로 파이프로 헹구고 질소 스트림으로 커버립을 건조시다. 커버립의 활성 면을 기록합니다. 다음 단계에 즉시 사용하십시오.</li>
</ol>중요 사항: 실험이 수반하는 분석의 유형에 따라 샘플 준비를 완료하기 위한 두 가지 방법이 있습니다. 실험자는 초해상도 이미징에 필요한 추가 항체 치료가 추가되기 전에 바이러스가 유리에 고정되는 단계 5A를 진행해야합니다. 5B는 유리에 고정하기 전에 용액에 바이러스를 라벨링하는 다른 방법을 설명합니다. 이 원고의 대표 데이터는 5A를 사용하여 준비됩니다. 실험 분석 유형에 따라 적절한 방법을 선택해야 합니다.
5A. 액티브 페이스 항체 테더
<ol><li>4.6 단계에서 질소 스트림으로 건조한 직후, 아비딘 처리 커버슬립 활성 면을 멸균 페트리 접시에 올려 놓습니다.</li>
	<li>파이펫활성면의 중간에 완충되어 적정량의 해동된 생체화 항체(표 1참조).</li>
	<li>다른 커버슬립(액티브 페이스 아래쪽)을 샌드위치 방법으로 유체 위에 놓습니다. 커버립의 활성 면을 참고, 활성 면이 인큐베이션용 유체와 접촉하는 것이 중요하다(단계 3.2.참조).</li>
	<li>페트리 접시 뚜껑을 커버슬립 샌드위치 위에 놓고 RT에서 45-60분 동안 배양합니다.</li>
	<li>페트리 접시 뚜껑을 제거하고 3.4 단계에서 설명한 대로 두 개의 커버립을 분리하여 활성 면을 추적하고 만지지 않도록 합니다.</li>
	<li>액티브 페이스 2-4배 위에 PBS 25ml를 피펫팅하여 PBS로 두 활성 면을 헹구고 건조하지 않고 즉시 사용하십시오. 어떤 커버슬립 얼굴이 활성화되어 있는지 추적해야 합니다.</li>
	<li>항체 처리 커버슬립 활성 면을 멸균 페트리 접시에 올려 놓고, 파이펫은 활성 면의 중간에 버퍼에 적절한 양의 해동 바이러스를 놓습니다.</li>
	<li>다른 커버슬립(액티브 페이스 아래쪽)을 샌드위치 방법으로 유체 위에 놓습니다. 활성 면은 배양을 위한 유체와 접촉하는 것이 중요하기 때문에 활성 면을 유의하십시오(단계 3.2 참조).</li>
	<li>페트리 접시 뚜껑을 커버슬립 샌드위치 위에 놓고 RT에서 45-60분 동안 배양합니다.</li>
	<li>페트리 접시 뚜껑을 제거하고 3.4 단계에서 설명한 대로 두 개의 커버립을 분리하여 활성 면을 추적하고 만지지 않도록 합니다.</li>
	<li>액티브 페이스 2-4x에 PBS 25ml를 피펫팅하여 PBS로 두 활성 면을 헹구습니다. 커버립을 말리지 말고, 대신 테플론 랙에 놓고 PBS로 채워진 비커를 즉시 배치하십시오. 어떤 커버슬립 얼굴이 활성화되어 있는지 추적해야 합니다.</li>
	<li>준비된 샘플을 즉시 활용하거나 4°C에서 적절한 버퍼에 보관하여 무결성을 크게 잃지 않고 최대 3일 동안 보관하십시오. 중요 참고: 샘플이 AFM 분석에서 사용되는 경우, 준비는 완료되고 즉시 활용되거나 5A.20 - 5A.21 단계에 설명된 대로 저장될 수 있다. 샘플이 초분해능 형광 이미징 분석에서 활용되어야 하는 경우, 5A.12 - 5A.19 단계에 기재된 항체 라벨링을 진행한다.</li>
	<li>두 바이러스 처리 커버립을 멸균 페트리 접시에 활성 면과 커버슬립의 중앙 95%를 커버하기에 충분한 유체 부피를 구사할 수 있는 충분한 단백질 차단 버퍼를 커버슬립(일반적으로 100-200 μl)에 배치합니다. 60-90 분 RT에서 인큐베이션하십시오.</li>
	<li>페트리 접시에서 한 번에 하나씩 커버립을 제거하고 커버슬립의 액체를 폐기물 비커에 부어 차단 버퍼를 조심스럽게 제거합니다. 커버슬립을 떨어뜨리지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>액티브 페이스 2-4배 위에 PBS 25ml를 피펫팅하여 PBS로 두 활성 면을 헹구고 건조하지 않고 즉시 사용하십시오. 어떤 커버슬립 얼굴이 활성화되어 있는지 추적해야 합니다.</li>
	<li>단일 블로킹 버퍼 처리 커버슬립 활성 면을 멸균 페트리 접시에 올려 놓고, 파이펫은 활성 면의 중간에 완충제에 적절한 양의 형광라벨 바이러스 항체를 배치한다.</li>
	<li>다른 커버슬립(액티브 페이스 아래쪽)을 샌드위치 방법으로 유체 위에 놓습니다. 어떤 면이 활성화되어 있는지, 활성 면이 인큐베이션용 유체와 접촉하는 것이 중요하다(3.2단계 참조).</li>
	<li>페트리 접시 뚜껑을 커버슬립 샌드위치 위에 놓고 RT에서 30분 동안 인큐베이션을 합니다.</li>
	<li>페트리 접시 뚜껑을 제거하고 3.4 단계에서 설명한 대로 두 개의 커버립을 분리하여 활성 면을 추적하고 만지지 않도록 합니다.</li>
	<li>액티브 페이스 2-4배 위에 PBS 25ml를 피펫팅하여 PBS로 두 활성 면을 헹구고 건조하지 않고 즉시 사용하십시오. 어떤 커버슬립 얼굴이 활성화되어 있는지 추적해야 합니다.</li>
	<li>커버립을 말리지 말고 PBS로 채워진 비커 내에 테플론 랙에 넣습니다. 어떤 커버슬립 얼굴이 활성화되어 있는지 추적해야 합니다.</li>
	<li>준비된 샘플을 즉시 활용하거나 4°C에서 적절한 버퍼에 보관하여 무결성을 크게 잃지 않고 최대 3일 동안 보관하십시오.</li>
</ol>5B. 용액 항체 공격에서
이 방법은 초해상도 형광 이미징을 위한 라벨링 전략의 선택적 향상입니다. 용액 공격을 가함으로써 바이러스 성 표면에 더 나은 항체 코팅을 얻을 수 있습니다.
<ol><li>실험 필요에 따라 비율로 항체 솔루션을 혼합합니다. 실시예 1:4 01 mg/ml 바이오티니졸화 항체의 0.01 mg/ml 형광 표지 항체의 비율은 좋은 결합 친화성을 제공하고 초해상도 이미징 분석에서 좋은 봉투 회복을 허용할 것이다.</li>
	<li>각각 (5B.1) 및 (1.3)에 제조된 항체 및 바이러스 용액의 동등한 부분을 혼합한다. 알리쿼트에서 몇 번 위아래로 파이프를 섞어 부드럽게 섞는다. 이 결과 용액은 4°C에서 최대 24시간 동안 필요할 때까지 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>4.6 단계가 완료되면, 멸균 페트리 접시에 활성 얼굴위로 아비딘 처리 커버 슬립을 배치합니다.</li>
	<li>파이펫은 활성 면의 중간에 항체 용액(5B.2 단계에서 제조)을 가진 적절한 양의 바이러스를 한다.</li>
	<li>다른 커버슬립(액티브 페이스 아래쪽)을 샌드위치 방법으로 유체 위에 놓습니다. 활성 면은 활성 면이 인큐베이션용 유체와 접촉하는 것이 중요하기 때문에 주의하십시오(3.2단계 참조).</li>
	<li>페트리 접시 뚜껑을 커버슬립 샌드위치 위에 놓고 RT에서 45-60분 동안 배양합니다.</li>
	<li>페트리 접시 뚜껑을 제거하고 3.4 단계에서 설명한 대로 두 개의 커버립을 분리하여 활성 면을 추적하고 만지지 않도록 합니다.</li>
	<li>액티브 페이스 2-4x에 PBS 25ml를 피펫팅하여 PBS로 두 활성 면을 헹구습니다. 커버립을 말리지 말고, 대신 테플론 랙에 놓고 PBS로 채워진 비커를 즉시 배치하십시오. 어떤 커버슬립 얼굴이 활성화되어 있는지 추적해야 합니다.</li>
	<li>준비된 샘플을 즉시 활용하거나 무결성을 크게 잃지 않고 최대 3일 동안 4°C에 보관하십시오.</li>
</ol>6. 원자력 현미경 물질 특성 측정
<ol><li>AFM 레이저를 켜고 AFM 소프트웨어를 엽니다. 오프닝 대화 상자에서 원하는 분석에 적합한 검색 모드를 선택합니다. 필요한 모든 창은 기본적으로 열려 야 합니다. 원하는 창을 열기 위해 사용자의 설명서를 참조하지 않을 경우.</li>
	<li>원하는 측정에 적합한 캔틸레버를 선택하고 제조업체 지침에 따라 캔틸레버 하우징에 삽입합니다. 다양한 캔틸레버가 있는 다양한 조건과 실험 유형이 있습니다. 실험자는 필요에 따라 캔틸레버를 연구해야 합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 캔틸레버 하우징을 AFM 헤드에 삽입합니다.</li>
	<li>샘플이 젖은 조건에서 사용되는 경우 저장소 버퍼에서 샘플을 제거하고 6.7 단계로 진행합니다.</li>
	<li>샘플이 주변(dry) 조건에서 사용되는 경우 저장 버퍼에서 샘플을 제거하고 초순수 수의 비커에 담그어 간단히 헹구십시오. 참고: 이것은 낮은 스프링 상수를 갖는 캔틸레버와 모세관 매력을 유도 할 수있는 샘플에 얇은 수분 층을 남길 것입니다.</li>
	<li>시료가 주변(dry) 조건에서 활용되어야 하는 경우 질소 스트림으로 샘플을 부드럽게 건조시로 건조시.</li>
	<li>커버슬립의 뒷면을 먼지가 없는 필터 용지로 부드럽게 말리면 시료의 활성 면을 만지지 않도록 합니다.</li>
	<li>샘플을 적절한 AFM 샘플 홀더에 배치한 다음 샘플을 AFM 단계에 배치합니다.</li>
	<li>샘플이 젖은 조건에서 이미지화될 경우 소량의 버퍼가 샘플(~10 μl)에 스페펫을 합니다.</li>
	<li>AFM 헤드를 샘플 위에 놓습니다.</li>
	<li>샘플이 젖은 경우 캔틸레버와 AFM 팁이 표면 층에 침투하고 캔틸레버와 캔틸레버 하우징 사이에 거품이 없는지 확인합니다.</li>
	<li>최적의 신호를 얻기 위해 제조업체권장 사항에 따라 AFM 레이저를 캔틸레버와 정렬합니다.</li>
	<li>캔틸레버 공진 주파수를 측정하고 실험 유형에 따라 스캔 주파수를 설정합니다.</li>
	<li>AFM 팁을 표면으로 낮추고 신호 설정을 최적화합니다.</li>
	<li>선택한 모드에서 20 μm 사각형 AFM 스캔을 수행합니다. 탭(AC) 모드는 대표 데이터를 생성하는 데 사용되었습니다. 일반적으로 유리 표면에 날카로운 스파이크로 볼 수 있는 대략적인 높이에 의해 바이러스 후보를 식별합니다.</li>
	<li>바이러스 후보를 선택하고 검사 헤드를 그 위에 중심으로 합니다.</li>
	<li>토폴로지 및 방향을 얻기 위해 선택한 바이러스에 대한 250 nm 사각형 스캔(또는 적절한 슈퍼 해상도 검사)을 수행합니다.</li>
	<li>재료 특성측정(예: 영의 계수 측정을 위한 구형 바이러스의 중심)을 위해 바이러스에 대한 점을 선택하고 제조업체의 지시에 따라 측정을 수행한다.</li>
</ol>7. 초해상도 이미징 방법
<ol><li>초해상도 이미징 소프트웨어를 열고 제조업체의 지침에 따라 소프트웨어를 보정합니다.</li>
	<li>형광 구슬을 활용하는 제조업체의 지시에 따라 초해상도 이미징 장비를 교정합니다.</li>
	<li>1M MEA의 50 μl과 10x Gloxy의 100 μl을 스톡 버퍼 850 μl에 결합하여 이미징 직전에 주식에서 샘플 이미징 버퍼를 조립합니다. 실험 기간 동안 얼음에 이미징 버퍼를 유지합니다.</li>
	<li>저장 버퍼에서 샘플로 준비된 커버슬립을 제거하고 초순수 수의 비커에 담그어 5배 헹구세요.</li>
	<li>먼지가 없는 필터 용지를 사용하여 비활성 커버슬립 페이스를 건조시다. 활성 면을 만지지 않도록 하십시오.</li>
	<li>이미징 시스템 샘플 홀더에 삽입하고 샘플 홀더에 이미징 버퍼 250 μl을 추가합니다. 일관된 결과를 유지하기 위해 2시간마다 샘플에서 이미징 버퍼를 교환하는 것이 합리적입니다.</li>
	<li>파라필름으로 샘플 홀더를 덮어 실내 환경과의 대기 상호 작용을 줄입니다.</li>
	<li>이미징을 위해 샘플 홀더를 이미징 장비에 넣습니다.</li>
	<li>제조업체의 방향을 활용하여 샘플을 집중시다.</li>
	<li>사용되는 슈퍼 해상도 기술에 따라 샘플을 이미지합니다. 화상 진찰 조건을 조정하여 신호를 최적화하는 동시에 사진 전환 형광의 동시 활성화를 줄여야 합니다. 중요 참고: 이미징 조건은 샘플에 따라 다르며 실험적 필요에 따라 다릅니다. 이미징 버퍼에서 어두운 상태로 효율적으로 초기화된 Alexa 647을 활용한 전형적인 실험은 405nm UV 광의 적용을 통해 사진 활성화될 수 있다. 이미지는 조밀하게 표지된 시료 내에서 Alexa 647 분자의 스파스 하위 집합을 흥미롭고 수집된 광자의 수에 의해 주로 제한된 정밀도로 각 플루오로포어를 국소화함으로써 얻어진다. 이 절차는 원하는 수의 획득 주기가 일어날 때까지 소프트웨어에 의해 반복적으로 반복됩니다. 실험자는 이 설정이 사진 표백된 샘플의 각 불소와 상관관계가 있어야 합니다.</li>
	<li>이미징이 완료되면 제조업체의 지시에 따라 이미징 장비를 종료합니다. 소프트웨어는 데이터 분석을 위해 열려 있을 수 있습니다.</li>
	<li>데이터 분석은 실험에 크게 의존합니다. 그러나, 모든 경우에 그들의 전체 폭으로 바이러스를 반 최대로 식별, 알려진된 바이러스 치수에 비해, 고려 하 게 형광 라벨의 추가 크기.</li>
	<li>더 나은 시각화를 위해 Isosurface 렌더링 옵션 또는 볼륨 렌더링 옵션을 활용하여 샘플을 볼 수 있으며, 둘 다 일반적으로 초해상도 이미징 소프트웨어에서 찾을 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pang, H. -. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virion+stiffness+regulates+immature+HIV-1+entry.">Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry.</a> Retrovirology. 10, 4 (2013).</li><li>Kol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Stiffness+Switch+in+Human+Immunodeficiency+Virus.">A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus.</a> Biophys. J. 92, 1777-1783 (2007).</li><li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+tip&#8211;sample+forces+in+jumping+mode+atomic+force+microscopy+in+liquid.">Minimizing tip&#8211;sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid.</a> Ultramicroscopy. 114, 56-61 (2012).</li><li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamics+of+human+adenovirus+disassembly+induced+by+mechanical+fatigue.">Monitoring dynamics of human adenovirus disassembly induced by mechanical fatigue.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li><li>Hernando-P&#233;rez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+Virology:+Direct+Measurement+of+Phage.">Physical Virology: Direct Measurement of Phage.</a> phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).</li><li>Carrasco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-mediated+anisotropic+mechanical+reinforcement+of+a+virus.">DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+Grafted+to+Silicon+Surfaces:+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption.">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Visnapuu, M. -. L., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+surfaces+in+single-molecule+bioscience.">The importance of surfaces in single-molecule bioscience.</a> Mol. Biosyst. 4, 394-403 (2008).</li><li>Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+binding+experiments+on+long+time+scales.">Single-molecule binding experiments on long time scales.</a> Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).</li><li>van Oijen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Kinetics+of+&#955;+Exonuclease+Reveal+Base+Dependence+and+Dynamic+Disorder.">Single-Molecule Kinetics of &#955; Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li><li>B&#246;cking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+a+molecular+disassemblase+reveals+the+mechanism+of+Hsc70-driven+clathrin+uncoating.">Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).</li><li>Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Five+Seconds+in+the+Life+of+a+Clathrin-Coated+Pit.">The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit.</a> Cell. 150, 495-507 (2012).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> 3, 793-795 (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy.">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples.">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).</li><li>Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin,+Spectrin,+and+Associated+Proteins+Form+a+Periodic+Cytoskeletal+Structure+in+Axons.">Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons.</a> Science. 339, 452-456 (2013).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Hodges, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+packaging+of+polymerases+within+vesicular+stomatitis+virus.">Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).</li><li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA.">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li></ol>

저자는이 논문에서 경쟁 재정적 이익이 없습니다.

AFM 및 고해상도 형광 이미징을 사용한 단일 비리온 이미징은 CryoEM 단층 촬영의 대체 방법론으로 사용될 수 있습니다. 이러한 방법론의 각각은 특정 강점을 가지고 있습니다. 예를 들어 AFM은 샘플 또는 내부 바이러스 성 단백질에 태그를 지정할 필요없이 WT virions에서 수행 할 수 있습니다. 바이러스 구조의 위치는 비리온의 탄성 특성에 대한 기여에서 감소된다.
새로 개발된 바이러스 성 역 유전 접근법과 결합된 단일 비리온 슈퍼 해상도 이미징은 낮은 카피 수 바이러스 성단백질(20)을국소화하는 강력한 기술이 된다. 형광 단백질에 융합된 단백질과 단백질을 대체하는 재조합 바이러스는 이러한 역유전적 접근법을 사용하여 만들고 정제할 수 있다. 초해상도 화상 진찰은 유전 태깅 때문에 부분적으로 특이성을 가지고 있지만, 돌연변이 바이러스의 사용을 요구합니다.
AFM 및 초해상도 이미징은 매우 유사한 샘플 제제를 활용하는 무료 방법입니다. 이 논문에 설명된 방법은, 이전 단일 분자 화상 진찰 소사 양식을 채택하는, virions의 토폴로지에 거의 효력을 가진 단 하나 바이러스의 고정을 허용합니다.

충전 기반비특이적 상호 작용은 원자력 현미경검사법 1,2에서비온의 유착을 위해 일상적으로 사용된다. 이러한 기술은 매우 뻣뻣한 캡시드3-6과비 봉투 된 virions에 사용할 때 특히 잘 작동합니다. 이러한 기술은 시료를 고정하는 데 매우 효과적이지만 표면에 단백질의 비특이적 결합을 방지하지는 않습니다. 비특이적 결합은 다양한 항체를 가진 견본의 잠양을 요구하는 AFM 및 초해상도 형광 기술로 virions를 심상시도하는 때 문제를 만들 수 있습니다. 여기서 우리는 virions의 특정 고정을위한 샘플 준비 방법을 설명합니다.
폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)는 폴리(L-lysine)(PLL)에 접목되어 유리 표면에 흡착되어 유리7을가진 단백질의 정전기 상호작용을 위한 중요한 블록을 제공한다. 유리 표면에 단일 분자의 고정화를 필요로 하는 단일 분자 소는 이 특성을 이용하고 특정 PEG 기반 단일 분자 고정 기술을 만드는 데 사용되었다8-10. 이러한 제제는 또한 유리표면(11)에 클래트린 케이지를 고정하고 대조군 세포 접착을위한 균질성 섬유네틴 코팅을 만드는 데 사용되었다.
단일 분자 이미징 방법론으로부터 유리 표면에 PLL-g-PEG 흡착에 기초한 샘플 준비 방법을 채택하고 이를 VEsicular 구내염 바이러스(VSV)의 단일 바이러스 를 이미징하는 데 적용했습니다. 이 단 하나 virions는 원자력 현미경 검사법 (AFM)를 사용하여 이미지되었다. 기능성 구슬에서도 대조군으로 유사한 실험이 수행되었다. 바이러스는 또한 알렉사 647로 표지된 VSV-G 항체가 단일 바이러스의 봉투의 이미지를 생성하는 데 사용되었다는 초해상도 형광 현미경 검사법에 의해 이미지되었다. 고분해능 형광 화상 진찰은 단일 분자의 국소화를 활용하여 이미지13-15를생성한다. fPALM 쌍면 이미징은 평면에서 20 nm와 광학 축15,16을따라 50 nm 해상도로 단일 분자의 국소화를 허용합니다. 이 쌍층 기술은 이 연구에 존재하는 초해상도 형광 심상을 이미지하기 위하여 이용되었습니다. 비슷한 결과를 가지고 다른 기술은 STORM13,17,18입니다.
이 논문에 설명된 절차에 의해 유리에 고정된 VSV의 AFM 및 초해상도 형광 이미지 모두 최소 비특이적 상호작용(19)을사용하여 유리에 대한 특이적 결합을 보였다. 여기서 우리는 AFM 및 초해상도 형광 화상 진찰 실험을 위한 견본 준비 프로토콜을 제시합니다. 요약: 클린 글래스 커버립은 PLL-g-PEG와 PLL-g-PEG-비오틴의 혼합물을 흡착하여 기능화됩니다. 이 박막은 코팅 된 표면에 15-25 % 기능성 비오틴을 제공하도록 설계되는 것이 일반적입니다. 커버립은 테트라메릭 아비딘으로 더 배양됩니다. 생체화 바이러스 항체는 그 때 virions를 위한 유일한 결합 사이트를 만드는 데 이용됩니다. 항체의 결합은 두 가지 방법으로 수행 될 수있다.
첫 번째 방법은 AFM에 최적화되어 있지만 초해상도 형광 이미징에 적합합니다. 이 방법에서 아비딘 코팅 표면은 바이러스 성 접착 전에 생체 개화 항체로 처리된다. 고정 된 virions는 봉투를 커버하고 바이러스의 초해상도 형광 이미징을 허용하기 위해 Alexa 647 표지 된 항체로 처리됩니다.
두 번째 방법은 아비딘 처리된 표면에 바이러스를 부착하기 전에 생체화 항체 및 Alexa 647 표지항체를 사용하여 용액에서 바이러스를 공격하는 것이다. 이 방법은 바이러스 봉투의 회복이 중요한 초해상도 형광 화상 진찰 실험에 최적화되어 있습니다. 이 방법은 바이러스 성 표면에 균일 한 항체 코팅을 허용하는 장점이 있다. 상기 생체화 항체는 바이러스 봉투의 외부에 높은 농도의 형광 라벨을 유지하면서 아비딘 처리된 표면에 바이러스의 충분한 흡착을 허용하는 비율로 Alexa 647 표지된 바이러스 항체와 혼합될 수 있다. 이러한 Alexa 647 표지 된 바이러스 성 항체는 생체 화되지 않으며 그들의 과잉은 배경 소음을 줄이기 위해 멀리 씻어 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glass coverslips (fPALM)</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">72225-01</td>
			<td style="width:167px;">25 mm Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">SuSoS&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.5 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NeutrAvidin biotin-binding protein</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A2666</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.25 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A21245</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">&#945;-VSV-G&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">ab34774</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gluox</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G2133-250KU&#160;</td>
			<td>Glucose oxidase type seven from Aspergillius&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Catalase</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C40-100mg&#160;</td>
			<td>Catalase from Bovine liver&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>30070-10G&#160;</td>
			<td>Cysteamine (MEA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stock Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NTE</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:71px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging

유리 표면에 비온의 고정은 단일 virion 이미징에서 중요한 단계입니다. 여기서 우리는 특이성을 가진 유리 표면에 단 하나 비약의 접착을 허용하는 단 하나 분자 화상 진찰 소사에서 채택된 기술을 제시합니다. 이러한 제제는 PLL-g-PEG 와 PLL-g-PEG-Biotin의 혼합물로 유리 표면을 접목하고, 아비딘층을 추가하고, 마지막으로 생체화 바이러스 특이적 항체의 부착을 통해 비리온 앵커를 만드는 것을 기반으로 한다. 우리는 원자력 현미경 검사법 (AFM) 및 초해상도 형광 화상 진찰을 포함하여 실험의 범위에 이 기술을 적용했습니다. 이 샘플 준비 방법은 표면에 대한 비온의 제어 접착을 초래한다.

AFM을 이용한 단일 비리온 이미징:
위에서 설명한 샘플 준비 프로토콜은 유리 표면에 야생 형 비리온을 고정하는 데 사용되었습니다. VSV 비리온은 길이 180nm, 직경 80nm의 총알 모양입니다. 이 기술이 적용될 수 있는 다양한 비리가 있기 때문에, 개념은 또한 바이오티니화 36 nm 비드에서도 여기에서 입증된다. 결과 AFM 실험은 그림 1에표시됩니다. VSV 비온은 비봉투 바이러스 (GPa)에 비해 낮은 영의 변둘루 (100 MPa)를 가지고 있음을 주의하는 것이 중요합니다. 단일 virion VSV의 특정 이미지는 경직된 캔틸레버가 있는 주변 조건에서 태핑 모드에서 획득되었습니다. 목표는 바이러스 내의 여분의 단백질 밀도가 AFM 이미지 내의 범프로 볼 수 있는 지점까지 바이러스를 변형시키는 것입니다. 이 방법은 바이러스캐비티(19)내의 여분의 단백질 밀도를 검출하는 데 사용된다.
단일 비리온 슈퍼 해상도 이미징:
알렉사 647 표지 VSV-G 항체는 방법 5A를 사용하여 초해상도 실험을 위해 개별 VSV 비온의 봉투를 코팅하는 데 사용되었다. 테더링 밀도및 낮은 비특이적 결합을 보여주기 위해 샘플의 큰 스캔이 도 2A에표시됩니다. 대표 비리온에서 바이러스 봉투의 회수는 도 2B(파란색 등색)에 도시되어 있다.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;">
그림 1. 기능화 PEGG 표면에 구슬과 VSV의 AFM 이미징. 36nm 생체개화 구슬(A,B)과VSV 비리온(C)의 AFM 스캔은 생체분해된 VSVG 항체로 표면에 고정된다. AFM은 AC 공기 지형 검사 모드에서 수행되었습니다. 팁 반경은 <25 nm이며, 측정은 힘 변조 및 빛 도청하에 수행되었다. 팁은 3 N/m의 힘 상수와 공진 주파수 75 kHz의 불확실성으로 15kHz의 불확실성을 가지고 있었습니다. 구슬은 AFM 스캔 중에 높이를 유지했지만 VSV 비온은 젊은 사람의 계수가 현저히 작으며 높이에서 크게 변형됩니다. 본 이미지에서 비리온은 작은 xy 컨볼루션(바이러스의 팁 대 무딘 끝을 결정하는 데 사용)을 생성한 도청 모드에서 딱딱한 캔틸레버로 구체적으로 이미지화되었으며 바이러스의 팁과 무딘 끝 사이의 높이 차이는바이러스(19)의무딘 끝에서 여분의 단백질 밀도를 검출하는 데 사용된다.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg"> 그림 2. PEGG 기능화 표면에 VSV 비온의 형광 기반 이미징. A)광야 형광에서 배양된 생체화 항체를 사용하여 PEGG 표면에 고정된 재조합 VSV 바이러스. B)바이오티니징 항체를 통해 PEGG 표면에 부착된 VSV의 봉투의 고해상도 형광 재구성및 알렉사 647 라벨이 부착된 항 VSVG 항체로 장식하였다(방법 5A는 이러한 이미지를 만드는 데 사용되었다). 파란색 표면은 2D 등면 투영입니다. 왼쪽은 글머리 기호 모양 바이러스의 모델을 보여줍니다. 
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212"><colgroup>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="27">
<td height="27" style="height:27px;width:119px;">커버슬립 사이즈</td>
			<td style="width:93px;">유동체</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">40mm</td>
			<td>65 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">35mm</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">30mm</td>
			<td>36 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">25mm</td>
			<td>25 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">20mm</td>
			<td>16 μl</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1. 커버 슬립 크기에 따라 유체 알리쿼트.

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Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

표면에 비리온의 부착은 슈퍼 해상도 형광 화상 진찰 또는 원자력 현미경 검사법 (AFM)에 의한 단일 virion 화상 진찰을 위한 요구 사항입니다. 여기서 우리는 AFM 및 초분해능 형광 이미징에 사용하기에 적합한 유리 표면에 대한 비온의 제어 접착을 위한 샘플 준비 방법을 시연한다.

단일 비리온 원자력 현미경 검사및 초분해성 형광 이미징을 위한 샘플 준비

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

sample-preparation-for-single-virion-atomic-force-microscopy-super

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K 조회수.  University of Utah. 표면에 비리온의 부착은 슈퍼 해상도 형광 화상 진찰 또는 원자력 현미경 검사법 (AFM)에 의한 단일 virion 화상 진찰을 위한 요구 사항입니다. 여기서 우리는 AFM 및 초분해능 형광 이미징에 사용하기에 적합한 유리 표면에 대한 비온의 제어 접착을 위한 샘플 준비 방법을 시연한다.

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

연구

생물학

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3. On the macro scale the stiffness of tissues and organs within the human body span several orders of magnitude4. Much less is known about how stiffness varies spatially within tissues, and what the scope and spatial scale of stiffness changes are in disease processes that result in tissue remodeling. To better understand how changes in matrix stiffness contribute to cellular physiology in health and disease, measurements of tissue stiffness obtained at a spatial scale relevant to resident cells are needed. This is particularly true for the lung, a highly compliant and elastic tissue in which matrix remodeling is a prominent feature in diseases such as asthma, emphysema, hypertension and fibrosis. To characterize the local mechanical environment of lung parenchyma at a spatial scale relevant to resident cells, we have developed methods to directly measure the local elastic properties of fresh murine lung tissue using atomic force microscopy (AFM) microindentation. With appropriate choice of AFM indentor, cantilever, and indentation depth, these methods allow measurements of local tissue shear modulus in parallel with phase contrast and fluorescence imaging of the region of interest. Systematic sampling of tissue strips provides maps of tissue mechanical properties that reveal local spatial variations in shear modulus. Correlations between mechanical properties and underlying anatomical and pathological features illustrate how stiffness varies with matrix deposition in fibrosis. These methods can be extended to other soft tissues and disease processes to reveal how local tissue mechanical properties vary across space and disease progression.

The stiffness of the extracellular matrix strongly influences multiple behaviors of adherent cells. Matrix stiffness varies spatially throughout a tissue, and undergoes modification in various disease conditions. Here we develop methods to characterize spatial variations in stiffness in normal and fibrotic mouse lung tissue using atomic force microscopy microindentation.

원자 힘 현미경을 사용하여 폐 조직의 미세 기계적 특성

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

세균 본부 기계의 슈퍼 해상도 이미징

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

최적화 STORM 슈퍼 해상도 현미경에 대한 테스트 샘플

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapper 슈퍼 해상도 현미경을위한 오픈 소스 단일 입자 분석

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

포유류 세포에 있는 바닥 상태 고갈 슈퍼 해상도 영상

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...