저자 동물 검 시와 선 격리 지원에 대 한 4 월 간 계 및 박사 로저 Broderson를 각각 인정 하 고 싶습니다. 이 작품에 대 한 자금 지원 Osteopathic 약의 필라델피아 대학 센터에서 만성 장애의 노화 한다.

동물 과목이이 프로토콜에 관련 된 절차 검토 되었고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 Osteopathic 약의 필라델피아 대학의 승인 그리고 모든 기술에서 엄격한 실시 했다 윤리적 지침.
 1. 샘플 조달 및 처리 <ol><li>선택 적절 한 동물 주제와 CO 2 챔버로 장소. 이 실험에 대 한 사용 8 10 주 오래 된 여성 미 b 6. Cg-Cav1tmMIs/J와 C57BI/6J.</li>
	<li>가스 흐름 30-40%로 설정. 일단 동물 가시 의식이 약 2 분 후, 추가 5 분에 대 한 전체 압력 가스 밸브를 열고 
	참고: CO 2 배달 중지 후 10 분 동안 (예: 가슴의 움직임) 호흡의 눈에 보이는 징후를 관찰 하 여 동물의 죽음을 확인 합니다. 동물 아직 살아있다, CO 2 챔버에 다시 삽입할 수 있습니다. 자 궁 경관 탈 구도 사용 될 수 있지만 그것은 권장 하지 않습니다 혈액 해 부 결과와 방해 하는 유 방 땀 샘 주위 누적 될 수 있습니다.</li>
	<li>희생, 부정사 자리에 시체를 고정 하 고 70% 에탄올과 포화.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 치 골 바로 위에 펠트를 꼬 집 고 작은 수술가 위 닉. 가 위, 회전 이동 복 부 정중 선 따라 펠트 꼬리를 잘라 두개골.</li>
	<li>큰가 위 또는 한 hemostat, 퉁 명 스럽게 해 부 피하 근 막 양측, 하지 복 펑크에 주의 사용 하 여. 절 개의 원심 양쪽에 가로 여백을 따라 컷.</li>
	<li>핀에 펠트 플랩 열고 다시 70% 에탄올 스프레이. 
	참고: 비록 70% 에탄올의 사용 허용 더 나은 시각적 구분 선와 주변 피하 조직,이 솔루션의 사용으로 인해 조직의 건조 하지 않도록 주의 해야 합니다. 건조 하지 않도록, 선 하지 4 분을 초과 하는 시간 프레임에서 제거 합니다. 70% 에탄올을 대신, 탐정 또한 조직의 건조를 피하기 위해 1 x PBS 같은 일반적인 격리 버퍼 대체할 수 있습니다.</li>
	<li>유선 및 관련된 피부 지방 진 피에서 무료 절단 가죽 플랩의 안쪽을 따라 #4 메스 블레이드 슬라이드 찾기 관심, 유 방 땀 샘. 
	참고: 외과 마이크로 loupes x 3.5 땀 샘의 쉽게 시각화에 도움이 있습니다.</li>
	<li>즉시 24-48 헤에 대 한 10% 중립 버퍼링된 말린의 10:1 솔루션-조직 볼륨을 포함 하는 원뿔 관에 새로 절연된 선 잠수함 
	참고: 연구의 의도 따라 많은 다른 fixatives 사용할 수 있습니다 paraformaldehyde, 게놈 연구, 그리고 버퍼를 보존 하는 상용 RNA에 대 한 에탄올 등.</li>
	<li>는 파라핀 포함을 위한 기관 프로토콜에 따라, 포함, 처리에 대 한 공급 업체에 샘플을 제출 하 고 슬라이스/슬라이드 장착. 5 µ m에서 조직 섹션. 
	참고: 초과 지방 주변 동맥 때문 보십시오 제거 조직의 단면을 얼룩이 지기 전에 100-200 µ m.</li>
</ol> 2. 조직 얼룩 <ol><li>Immunohistochemistry <ol><li>장소 슬라이드 열 블록에 얼룩이 질에 녹기 파라핀 1 h 58 ˚C 설정. 
		주의: 파라핀 왁 스를 녹는 슬라이드 해제 실행할 수 있습니다. 밀접 하 게 모니터링 하거나 결선 왁 스를 잡으려고 슬라이드 아래 닦아. 
		참고:이 단계는 중요 하지 않습니다 하 고 건너뛸 수 있습니다. 결과 예상 대로 되지, 하는 경우 결과 향상 시킬 수 있습니다이 단계를 다시 추가.</li>
		<li>품 슬라이드는 슬라이드에 포함 된 100% 자일 렌 30 분 보장 완전 한 침수에 대 한 항아리. 한번 반복. 
		참고:이 시점에서, 검사 수행 되어야 한다 직물 단면도 지방 조직 및 파라핀 되도록. 이면 추가 지방 조직 또는 왁 스 분명 크 실 렌에 슬라이드를 다시 침수 한다. 주의 사용 하 여이 조직의 수 축을 일으킬 수로 자일 렌을 추가 노출을 최소화.</li>
		<li>10 분에 대 한 100% 에탄올을 포함 하는 슬라이드 항아리에 리하이드레이션 조직 반복 한 번.</li>
		<li>이동 슬라이드 10 분에 대 한 95% 에탄올을 포함 하는 슬라이드 항아리를 반복 한 번.</li>
		<li>슬라이드는 슬라이드 항아리 포함 75% 에탄올 5 분에 대 한 이동</li>
		<li>슬라이드는 슬라이드 항아리 포함 50% 에탄올 5 분에 대 한 이동</li>
		<li>10 m m 나트륨 구 연산 염 해결책 (pH 6.0) 핫 플레이트 또는 전자 레인지에 끓인 고 Coplin 항아리에 붓는 다. 
		주의: 신중 하 게 난방 솔루션을 모니터링 하 고 종 기 피하기 위하여 처리. 컨테이너는 매우 뜨거운 것입니다. 보호를 사용 하 여 화상을 피하기.</li>
		<li>천천히 Coplin에 장소 슬라이드 항아리, 완전 한 침수를 보장 하 고 10 분 검색 epitopes 100 ° C에서 품 어. 제거 하 고 신중 하 게 슬라이드 건조.</li>
		<li>소수 표시와 함께 조직 주위에 방 벽을 그립니다. 충분 한 내 생 효소 차단 추가 (과산화 수소와 나트륨 아 지 드, 사용할 수 있는 상업적으로) 티슈 커버 하 고 10 분에 대 한 품 어</li>
		<li>Submerge 슬라이드 1 x 인산 염 버퍼 10 분에 대 한 식 염 수 (PBS)</li>
		<li>티슈 커버 및 실내 온도 습도 챔버에 1 시간에 대 한 품 어 1 x PBS에 충분 한 나 귀 10% 혈 청 추가. 
		참고: 실험 수 수 일시 중지 여기 하룻밤에 4 ° C에서 습도 챔버 슬라이드를 저장 하 여. 당나귀 혈 청 최적의 착 결과를 발견 했다, 탐정 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 염소 혈 청 등 최적의 결과 결정 하기 위해 혈 청 말 다른 세라를 테스트 하실 수 있습니다. BSA를 사용 하는 경우 탐정이이 신선한 사용 하기 전에 준비 해야 한다.</li>
		<li>는 슬라이드에서 과잉 차단기를 가만히 따르다 고 추가 제대로 희석된 주 항 체 1% 혈 청에서 직접 조직 솔루션에 덮여 균등 하 게 보장 하는 슬라이드. 실내 온도 습도 챔버에 30 분 동안 품 어. 
		참고:이 단계 수 없습니다 계속 오래 시간 기간에 대 한 4에 저장 하는 습 한 챔버와 ° C. 확인이이 단계에서 적절 한 부정적인 컨트롤 (예: 없는 기본 항 체, 항 원 네거티브 조직, 등 알려진와 슬라이드) 슬라이드를 포함 해야 합니다.</li>
		<li>신중 하 게 약 1 mL의 diH 2 O 조직에 흐르는 슬라이드를 세척 하 고 5 분에 대 한 1 x PBS의 1 변화에 품 어</li>
		<li>초과 PBS를 가만히 따르다와 조직 및 습도 챔버에 30 분 동안 품 어 충분 한 양 고추냉이 과산화 효소 레이블을 추가. 
		참고:이 단계에서 탐정 형광 붙일 활용된 2 차 항 체를 사용 하 여 얼룩을 진행 하실 수 있습니다. 적절 하 게 설명 하는 다음 단계를 수정 해야이 바란다면,.</li>
		<li>신중 하 게 약 1 mL의 diH 2 O 조직에 흐르는 슬라이드를 세척 하 고 5 분에 대 한 1 x PBS의 1 변화에 품 어</li>
		<li>Chromogen 솔루션 제조 업체 제안된 비율에 따라 플러스 diaminobenzidine (DAB)을 확인 하 고 소용돌이 의해 혼합. 
		참고: 많은 기성 품 장비는이 프로토콜에 사용 되는 것 이외에도 상용.</li>
		<li>Decant 초과 슬라이드에서 버퍼링 하 고 조직에 직접 chromogen 얼룩의 2-3 방울 (10-50 µ L)를 추가 하 고 습 실에서 5 분 동안 품 어. 신중 하 게 조직에 흐르는 약 1 mL diH 2 O 슬라이드를 세척. 
		주의: DAB chromogen 매우 독성이 있다. 유해 폐기물에 떨어져 피부와 수집 흐름 얼룩의 직접 접촉을 방지.</li>
	</ol></li> <li>Hematoxylin 및 오신 (H &#38; E) <ol><li>해리스 되며 1-2 분에 대 한 수돗물에서 부드럽게 2-2.5 분 린스 슬라이드에서 슬라이드를 잠수함 chromogen 부 화 후 최종 린스 다음 
		참고: 조직에 물을 직접 제트를 피하기 위해 주의.</li>
		<li>Submerge 차별화 솔루션 (0.25 mL의 70% 에탄올 100ml에 염 산의)에서 2-3 s에 대 한 슬라이드. 약 1-2 분에 대 한 수돗물에서 부드럽게 슬라이드 린스</li>
		<li>30에 대 한 95% 에탄올에 60 미 린스 슬라이드 슬라이드 블루 에이전트 (4.5 mg 탄산 칼슘 100 mL 수돗물, pH 9.4 조정) 잠수함 s.</li>
		<li>Submerge 슬라이드 알코올 오신 2-3 분에 대 한 Y</li>
		<li>조직 2 변화 1 분에 대 한 95% 에탄올의 탈수.</li>
		<li>1 분에 100% 에탄올의 변경 1에서 Dehydrate 조직</li>
		<li>신중 하 게 보풀 지우기와 슬라이드 건조. 적용 1 방울 (약 100-200 µ L)의 합성, 비 수, 수 지 기반 미디어를 슬라이드 및 coverslip 적용 장착. 
		참고: 다른 착 방법, 선출 하는 경우 다른 설치 미디어 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 탐정 선택 형광 활용 된 이차 항 체, 수성 산 더 이상적인 것.</li>
		<li>하룻밤 실 온에서 설정 하려면 슬라이드 허용.</li>
	</ol></li> <li>Picrosirius 레드 (PSR) 얼룩 <ol><li>스테인드 될 immunohistochemistry 프로토콜 6 단계 (50% 에탄올 담가) 따라 하는 슬라이드를 선택 합니다.</li>
		<li>PSR Submerge 슬라이드 1 헤에 대 한 얼룩</li>
		<li>0.5% 초 산에 대 한 1-2, 얼룩을 차별화 하는 데 두 번 슬라이드 잠수함.</li>
		<li>조직 2 변화 1 분에 대 한 95% 에탄올의 탈수.</li>
		<li>1 분에 100% 에탄올의 변경 1에서 Dehydrate 조직</li>
		<li>짧게에 대 한에 대 한 100% 크 실 렌에 잠수 하 여 슬라이드를 취소 3-4 미</li>
		<li>신중 하 게 보풀 지우기와 슬라이드 건조. 적용 1 방울 (약 100-200 µ L)의 합성, 비 수, 수 지 기반 미디어를 슬라이드 및 coverslip 적용 장착.</li>
	</ol></li></ol> 3. 샘플 분석 α-SMA를 위한 <ol><li>Ductal 분석 <ol><li>선택 슬라이드 스테인드. 카메라 마운트 목적으로 가벼운 현미경을 사용 하 여 20 배 확대에서 대표 이미지 수집.</li>
		<li>사용 ImageJ (NIH), 구별 및 각 이미지에 관. 이러한 수동으로 열거 될 수 있다 또는 하나 개별 덕트 숫자 점수를 할당할 수 있습니다. 숫자 점수를 할당 하려면 ImageJ 열고 플러그인을 선택 합니다. 다음 분석을 선택 하 고 드롭 다운 메뉴에서에서 셀 카운터를 선택 합니다. 초기화를 클릭 합니다 다음 덕트를 표시 하려면 1을 강조 표시 합니다. 완료 되 면, ductal 카운트를 볼 결과 선택. 
		참고: ductal 및 하지 혈관 구조 확인 주의.</li>
		<li>에 &#39; 설정 측정 &#39; 옵션, 확인 &#39; 경계 &#39;와 &#39; 지역 &#34;.</li>
		<li>Myoepithelial 구획 (α-SMA 얼룩에 의해 원조 하는 시정)에서 각 덕트 주위 선을 그리는 자유형 다각형 도구를 사용 하 여. 선택 &#39; 측정 &#39; 경계와 영역 기록.</li>
		<li>다시 루멘의 내부에 ductal 상피의 꼭대기 측면을 따라 선을 그립니다 자유형 다각형 도구를 사용 하 여. 선택 &#39; 측정 &#39; 경계와 영역 기록.</li>
		<li>Ductal 상피의 둘레를 얻기 위하여 myoepithelial 구획의 경계에서 luminal 구획의 둘레를 뺍니다. Ductal 상피의 영역을 얻기 위해 myoepithelial 구획의 지역에서 luminal 구획의 영역을 뺍니다.</li>
	</ol></li> <li>Immunohistochemistry 분석 <ol><li>ImageJ 등 피지 스위트 분석 소프트웨어에 명시 이미지를 업로드. 
		참고:이 프로토콜 분석 ImageJ IHC 도구 상자 플러그인을 사용 하 여 얼룩에 대 한 단계를 간략하게 설명.</li>
		<li>는 플러그인 메뉴에서 IHC 도구 상자를 엽니다. 에 &#34; 선택 모델 &#34; 열립니다, 적절 한 얼룩을 선택 하는 콤보 상자 (즉, H-DAB, PSR, 등). 선택은 &#34; 색상 &#34; 얼룩을 옵션. 이 결과 창이 열립니다. 
		참고:이 메서드는 관심사의 단백질 extracellular 또는 cytosolic 공간에 있는 또는 원형질 막에 바인딩된 경우 적절 한. 관심사의 단백질 핵 이면 선택 &#34; 핵 &#34; 긍정적으로 얼룩진된 핵에 대 한 이미지를 분석 하는 플러그인을 묻는 메시지가 표시 됩니다.</li>
		<li>를 사용 하 여 색상 선택기 슬라이드 배경 포함 또는 과도 한 얼룩 제외 없이 얼룩의 적절 한 절연. 
		참고: 자동 모드 얼룩을 감지할 수 없거나 허용 이미지 귀착되 지 않는다, 그릴 사각형 관심 영역 (ROI)는 확인 된 이상 스테인드 영역. IHC 도구 상자 창에서 선택 &#34; 기차 &#34; 적절 한 대상에 플러그인 직접.</li>
		<li>16 비트 이미지를 변환합니다. 이동 이미지 &#8594; 유형 &#8594; 16 비트.</li>
		<li>임계값 이미지입니다. 이동 이미지 &#8594; 조정 &#8594; 임계값을 자동.</li>
		<li>길이 할당 이미지에서 눈금 막대 바로 위에 선 ROI를 그려서 이미지 측정 비율을 설정 합니다. 눈금 막대를 설정 하려면로 이동 분석 &#8594; 비율 설정. 길이 (예: 120 픽셀 당 50 µ m)의 원하는 단위 당 픽셀 수를 입력.</li>
		<li>결과 영역을 측정 하 고 회색 값을 의미. 이동 분석 &#8594; 설정 측정 클릭 하 여 측정을 수집 분석 &#8594; 측정.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

신문에서 우리 그대로 마우스 유 방 땀 샘: ECM 표현과 ductal 형태학의 다운스트림 조직학 분석을 분리 하는 기법을 설명 했습니다. Ductal 형태학의 분석, 관련이 방법론 ductal 아키텍처 기반으로 얼룩진된 조직학 섹션의 신속한 조사를 수 있습니다. Ductal 분석의 다른 방법 염료 ductal 트리의 시각화 수 있도록 기술적으로 도전적이 고 많은 시간이 소요 될 수 있는 방법의 주사에 의존 합니다.
<p class=...

유방암 조직 섬유 증1,2,,34의 상당한 정도 의해 특징입니다. ECM,이 아닌 휴대 엔터티 모든 조직에서 다양 한 각도에서 발견 하며 주로 원 및 원 비 collagens, 엘라 스 틴, 그리고 다양 한 신호 분자는 뿐만 아니라 glycoproteins의 복잡 한 채널의 구성 이 매트릭스에서 격리. 항상성 조건에서 증 착 및 ECM의 긴밀 하 게 제어 됩니다. 5 유 방 tumorigenesis, 동안 ECM 증 착 및 저하의 균형은 중단 됩니다. 이와 같이, 유 방 종양 collagens, fibronectin 다른 tenascin C 등 풍부한 ECM 단백질 표현 하 보고 되었습니다. 6 매트릭스 가교의 증가 패턴 뿐만 아니라이 단백질의 비정상적인 식 유 방 종양 진행, 전이 및 치료 저항1,3, 를 홍보 하기 위해 문서화 되었습니다 4,7,,89.
ECM 구성과 ductal 형태 평가, 그대로 유 방 땀 샘의 격리 수행 되었다. 여기, 우리 caveolin-1에 대 한 결핍 여성 미 마우스를 사용는 적극적인에 연결 되어있다는 완전 한 막 단백질 종양 서명10,,1112, 유 방 및 여성 미 b 6를 제어 쥐입니다. 조직학 처리 하 고 이러한 직물의 얼룩이 ductal 형태학의 특성화와 함께 여러 가지 ECM 단백질의 id 허용.
전반적으로, 전체, 그대로 유 방 땀 샘의 조직 전체 형태학 또는 세포 변화 발생 하는 외 인 성 또는 내 인 성 요인에 대 한 응답에서을 조사 기회 연구자를 제공 합니다. 기술의 단점 ductal 나무의 복잡 한 형태학의 더 완전 한 그림을 얻을 것 이다 3D 관점 반대로 2 차원 (2D) 조직 단면도의 분석에 연결 되어 있습니다. 유 방 동맥에서 세포-세포와 세포-ECM 상호 작용의 복잡성을 감안할 때, 전체, 그대로 샘의 격리는 ductal 형태 및 단백질 표현의 다양 한 지역에서는 murine 유를 효율적으로 분석 하기 위한 유리한 선입니다.

<table><tbody><tr><td>Light Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Camera</td><td>Olympus</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis Software</td><td>Olympus</td><td>cellSens Entry software</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>3.5x-R Surgical Micro Loupes</td><td>Rose Micro Solutions</td><td></td><td>Magnification at researcher&#039;s preference</td></tr><tr><td>Mayo Scissors</td><td>Medline</td><td>DYND04035</td><td></td></tr><tr><td>Staining Rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>121</td><td></td></tr><tr><td>Staining Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>112</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-4</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Size appropriate for tissue</td></tr><tr><td>IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+)</td><td>Dako</td><td>K400611-2</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red Kit</td><td>Abcam</td><td>AB150681</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y, alcoholic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HHS16</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>EMD Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes, Reagent Grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td><td>suitable for molecular biology</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline, 1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Citrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Carbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202932</td><td></td></tr><tr><td>Permanent Mounting Medium</td><td>Dako</td><td>S1964</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt&#039;s Mounting Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin antibody</td><td>Abcam</td><td>AB23750</td><td></td></tr><tr><td>Tenascin-C antibody</td><td>Abcam</td><td>AB108930</td><td></td></tr><tr><td>Alpha Smooth Muscle Actin antibody</td><td>Abcam</td><td>AB124964</td><td></td></tr><tr><td>Dako Envision Dual Link System HRP</td><td>Dako</td><td>K4065</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of intact, whole mouse mammary glands for analysis of extracellular matrix expression and gland morphology

이 절차의 목표는 ECM 표현과 ductal 아키텍처 평가 #4 복 유 방 동맥 여성 미 쥐에서 수확 했다. 여기, 피부 아래 작은 주머니 메이 요가 위, 수 있도록 기본 복 막에서 피하 조직 내 분 비의 분리를 사용 하 여 만들었습니다. 땀 샘의 시각화 3.5의 사용에 의해 주 었 했다 x-R 수술 마이크로 loupes. 펠트 반전 했다 그리고 고정 다시 그대로 유 방 지방 패드의 허용 식별. #4 복 부 동맥의 각각 퉁 명 스럽게 옆으로 피하 층과 동맥 사이 메스 블레이드를 슬라이딩 하 여 해 부 했다. 수확 후 즉시 분 비 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 후속 조직 처리에 배치 했다. 전체 체의 절단은 주로 제외 ductal 상피 세포 및 다른 microenvironmental 세포 인구 부분 생 검에 놓친 수 간의 중요 한 조직 차원의 상호 작용의 위험을 제거 하기 때문에 유리 하다. 방법론의 1 결점은 동맥 내의 개별 위치로 ductal morphogenesis 고 단백질 식의 분석을 제한 하는 고정된 조직에서 직렬 섹션의 사용. 이와 같이, 3 차원 (3D) ductal 건축과 단백질 식에 변경 쉽게 얻을 수 아니다. 전반적으로, 기술 발달 ductal morphogenesis 또는 유 방 암 등 하류 조사에 대 한 전체 그대로 murine 유 방 땀 샘을 요구 하는 연구에 적용 됩니다.

여성 쥐 유 방 땀 샘의 5 쌍 있다. 특히, 자 궁 경부 분 비 (#1), 흉부 동맥 (#2 및 #3), 한 쌍의 복 부 동맥 (#4), 그리고 사 타 구니 동맥 (#5) (그림 1A)의 1 쌍의 두 쌍의 한 쌍이입니다. 여기, 우리는 그들은 쉽게 식별 #4 분 비 고립. 일부 경우에 # 4와 #5 분 비 했다 격리 함께 둘 사이의 구분이 어려웠다. 그대로 #4 복 부를 격리 하기 위해 유 방 땀 ?...

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Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

여기, 우리는 전체, 그대로 마우스의 격리에 대 한 프로토콜 세포 외 기질 (ECM) 식과 ductal 형태를 조사 하는 유 방 땀 샘을 제시. 마우스 #4 복 부 동맥은 8 10 주 오래 된 여성 미 쥐, 중립 버퍼링 된 포 르 말린에 고정, 단면화 및 immunohistochemistry ECM 단백질에 대 한 사용 하 여 스테인드에서 추출 되었다.

세포 외 기질 식 및 선 형태 분석을 그대로, 전체 마우스 유 방 땀 샘의 절연

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

isolation-intact-whole-mouse-mammary-glands-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

16.4K 조회수.  University of Nebraska Medical Center. 여기, 우리는 전체, 그대로 마우스의 격리에 대 한 프로토콜 세포 외 기질 (ECM) 식과 ductal 형태를 조사 하는 유 방 땀 샘을 제시. 마우스 #4 복 부 동맥은 8 10 주 오래 된 여성 미 쥐, 중립 버퍼링 된 포 르 말린에 고정, 단면화 및 immunohistochemistry ECM 단백질에 대 한 사용 하 여 스테인드에서 추출 되었다.

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Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and genetic alterations. Mammary gland whole mounts are an inexpensive method to capture the progression of morphological changes that may arise after exposure. However, in later life, when abnormalities are more prone to develop, sole reliance on this one method may not always provide enough information to make a proper diagnosis of the abnormality. Historically, in chemical test guideline studies, a single mammary gland is removed at necropsy and prepared as a hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained section. The incorporation of contralateral mammary whole-mount collection and analysis decreases the likelihood of a false-negative assessment. Evaluation of the whole mount is limited by the presence of one or two entire mammary glands on a slide, and in some cases, the abnormalities observed in the whole mount are not uniformly represented in the H&#38;E section.&#160; The goal of this study was to develop a protocol for converting coverslipped mammary whole mounts to H&#38;E-stained sections so that lesions that would otherwise have been missed or that are difficult to diagnose can be identified. Here, we detail a method to produce a high-quality, paraffin-embedded H&#38;E section from a mammary gland that was initially prepared as a whole mount. In comparison to a tissue that was intentionally prepared for H&#38;E sectioning, the whole mount requires additional preparation for tissue removal and processing. However, this method is considered inexpensive, as it requires common lab reagents and little additional time. As a result, this method can provide invaluable information on how chemical and environmental exposures alter normal mammary development, as well as display changes that occur because of genetic modifications.

We developed a method to successfully remove, process, section, and stain, for histopathological evaluation, mammary tissue that had originally been fixed on slides as whole mounts. This method may promote the collection and evaluation of mammary gland whole mounts in reproductive and developmental test guideline studies.

병변 식별을위한 유선 절개 전체 장착

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

연구

암 연구학

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

C57BL/6J 마우스의 Stromal 셀 및 암종 세포 이식 내유

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

의학

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal mammary epithelial cell (NAMEC)-derived extracellular vesicles can be isolated from NAMEC medium via differential ultracentrifugation. Based on their density, EVs can be purified via ultracentrifugation at 110,000 x g. The EV preparation from ultracentrifugation can be further separated using a continuous density gradient to prevent contamination with soluble proteins. The purified EVs can then be further evaluated using nanoparticle-tracking analysis, which measures the size and number of vesicles in the preparation. The extracellular vesicles with a size ranging from 50 to 150 nm are exosomes. The NAMEC-derived EVs/exosomes can be ingested by mammary epithelial cells, which can be measured by flow cytometry and confocal microscopy. Some mammary stem cell properties (e.g., mammary gland-forming ability) can be transferred from the stem-like NAMECs to mammary epithelial cells via the NAMEC-derived EVs/exosomes. Isolated primary EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells cannot form mammary glands after being transplanted into mouse fat pads, while EpCAMlo/CD49fhi basal mammary epithelial cells form mammary glands after transplantation. Uptake of NAMEC-derived EVs/exosomes by EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells allows them to generate mammary glands after being transplanted into fat pads. The EVs/exosomes derived from stem-like mammary epithelial cells transfer mammary gland-forming ability to EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells.

This protocol describes methods for purifying, quantitating, and characterizing extracellular vesicles (EVs)/exosomes from non-adherent/mesenchymal mammary epithelial cells and for using them to transfer mammary gland-forming ability to luminal mammary epithelial cells. EVs/exosomes derived from stem-like mammary epithelial cells can transfer this cell property to cells that ingest the EVs/exosomes.

extracellular vesicles / exosomes를 통한 유방 기초 상피 세포와 유방 Luminal 세포 사이 유선 형성 능력의 이전

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

발생학

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These interactions are provided by junctional proteins that form nexuses between adjacent cells. Junctional protein mislocalization and reduced physical associations with their binding partners can result in the loss of function and, consequently, to organ dysfunction. Thus, identifying protein localization and protein-protein interactions (PPIs) in normal and disease-related tissues is essential to finding new evidences and mechanisms leading to the progression of diseases or alterations in developmental status. This manuscript presents a two-step method to evaluate PPIs in murine mammary glands. In protocol section 1, a method to perform co-immunofluorescence (co-IF) using antibodies raised against the proteins of interest, followed by secondary antibodies labeled with fluorochromes, is described. Although co-IF allows for the demonstration of the proximity of the proteins, it does make it possible to study their physical interactions. Therefore, a detailed protocol for co-immunoprecipitation (co-IP) is provided in protocol section 2. This method is used to determine the physical interactions between proteins, without confirming whether these interactions are direct or indirect. In the last few years, co-IF and co-IP techniques have demonstrated that certain components of intercellular junctions co-localize and interact together, creating stage-dependent junctional nexuses that vary during mammary gland development.

Intercellular junctions are requisites for mammary gland stage-specific functions and development. This manuscript provides a detailed protocol for the study of protein-protein interactions (PPIs) and co-localization using murine mammary glands. These techniques allow for the investigation of the dynamics of the physical association between intercellular junctions at different developmental stages.

Murine Mammary Gland의 갭, 타이트 및 Adherens 접합부의 구성 요소 사이의 단백질 - 단백질 상호 작용 및 공동 위치 분석

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The effects these exposures have on mammary gland development are typically evaluated using either basic dimensional measurements or by scoring morphological characteristics. However, the broad range of methods for interpreting developmental changes could lead to inconsistent translations across laboratories. A common method of assessment is needed so that proper interpretations can be formed from data being compared across studies. The present study describes the application of the Sholl analysis method to quantify mammary gland branching characteristics. The Sholl method was originally developed for use in quantifying neuronal dendritic patterns. By using ImageJ, an open-source image analysis software package, and a plugin developed for this analysis, the mammary gland branching density and the complexity of a mammary gland from a peripubertal female rat were determined. The methods described here will enable the use of the Sholl analysis as an effective tool for quantifying an important characteristic of mammary gland development.

Mammary gland development in the rodent has typically been evaluated using descriptive assessments or by measuring basic physical attributes. Branching density is an indicator of mammary development that is difficult to quantify objectively. This protocol describes a reliable method for the quantitative assessment of mammary gland branching characteristics.

Sholl 분석법을 이용한 유방 내 유선 마운트의 분지 밀도 정량화

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

마우스 모델에서 유선 개발 및 기능 평가

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

생물학

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their prominent presence is often associated with poor prognosis1,2. CAFs are an activated subpopulation of stromal fibroblasts, many of which express the myofibroblast marker &alpha;-SMA3. CAFs originate from local tissue fibroblasts as well as from bone marrow-derived cells recruited into the developing tumor and adopt a CAF phenotype under the influence of the tumor microenvironment4. CAFs were shown to facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes tumor cell proliferation, angiogenesis, and invasion5-8. We demonstrated that CAFs enhance tumor growth by mediating tumor-promoting inflammation, starting at the earliest pre-neoplastic stages9. Despite increasing evidence of the key role CAFs play in facilitating tumor growth, studying CAFs has been an on-going challenge due to the lack of CAF-specific markers and the vast heterogeneity of these cells, with many subtypes co-existing in the tumor microenvironment10. Moreover, studying fibroblasts in vitro is hindered by the fact that their gene expression profile is often altered in tissue culture11,12 . To address this problem and to allow unbiased gene expression profiling of fibroblasts from fresh mouse and human tissues, we developed a method based on previous protocols for Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)13,14. Our approach relies on utilizing PDGFR&alpha; as a surface marker to isolate fibroblasts from fresh mouse and human tissue. PDGFR&alpha; is abundantly expressed by both normal fibroblasts and CAFs9,15 . This method allows isolation of pure populations of normal fibroblasts and CAFs, including, but not restricted to &alpha;-SMA+ activated myofibroblasts. Isolated fibroblasts can then be used for characterization and comparison of the evolution of gene expression that occurs in CAFs during tumorigenesis. Indeed, we and others reported expression profiling of fibroblasts isolated by cell sorting16. This protocol was successfully performed to isolate and profile highly enriched populations of fibroblasts from skin, mammary, pancreas and lung tissues. Moreover, our method also allows culturing of sorted cells, in order to perform functional experiments and to avoid contamination by tumor cells, which is often a big obstacle when trying to culture CAFs.

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Cancer Associated Fibroblasts (CAFs) facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes proliferation, angiogenesis, and inflammation. Here we describe a method to isolate pure populations of normal fibroblasts and CAFs from fresh mouse and human tissues by cell sorting, using PDGFR&#x03B1; as a surface marker.

형광 활성 세포 정렬 (FACS)에 의해 신선한 조직으로부터 정상 및 암 관련 섬유 아세포의 분리

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

마우스 유선의 냉동 섹션에 간접 면역 형광

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...