진균 및 바이러스성 병원체에 대한 항원 특이적 숙주 면역을 결정하기 위한 유세포 분석 및 사이토카인 분석을 위한 전혈 샘플 준비

유세포 분석을 위한 시료 준비를 시작하려면 인큐베이터에서 Brefeldin A가 함유된 전혈 시료가 들어 있는 자극 튜브를 꺼냅니다. Brefeldin A가 함유된 각 자극 튜브에 500 마이크로리터의 0.5 molar EDTA 용액을 추가합니다. 샘플을 새로운 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 1m리터의 적혈구 용해 완충액을 각 자극 튜브에 피펫팅하여 헹굽니다.

완충액과 세포 현탁액을 동일한 원심분리 튜브로 옮깁니다. 600g의 튜브를 7분 동안 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 피펫팅하여 빼냅니다. 그런 다음 펠릿에 적혈구 용해 완충액을 추가하고 재현탁시킵니다.

샘플이 투명해질 때까지 또는 최대 6분 동안 실온에서 샘플을 배양합니다. 600g에서 7분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상층액을 버린 후 펠릿에 HBSS 1밀리리터를 추가합니다.

세포 현탁액을 2밀리리터 반응 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 400g에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 유세포 분석 염색을 수행하기 전에 상층액을 폐기하십시오.

Brefeldin A가 포함되지 않은 자극 튜브의 샘플을 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 2, 000 g에 20 분 동안 관을 분리하십시오. 이제 상층액을 새 1.5밀리리터 튜브에 조심스럽게 피펫팅합니다.

상층액을 즉시 분석하지 않는 경우 샘플을 섭씨 80도에서 냉동 보존합니다. 언 표본을 이용할 때, 분리기는 분석의 앞에 7 의 000 g 보다는 더 중대한 속도로 상층액을 다시 녹였다. cytokine assay 프로토콜에서 요구하는 대로 샘플의 사전 희석을 수행합니다.

세포 펠릿을 1m리터의 RNA 보호 완충액에 재현탁시킵니다. 후속 RNA 분리를 위해 섭씨 80도에서 냉동 보존합니다. 또는 즉각적인 RNA 분리를 위해 세포 펠릿을 700 마이크로리터의 용해 완충액에 재현탁시킵니다.