연구 자원, 보건 국립 연구소를위한 국립 센터에서 밴더빌트 CTSA 부여 한 UL1 RR024975에 의해 부분적으로 지원. 이 작품은 NIH R01 HL 83839에 의해 투자되었다; R01 AI 65,744합니다.

다음과 같은 프로토콜을 위해, 우리는 관심의 세포로 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)를 사용합니다. 그러나,이 프로토콜은 다른 세포 유형에 사용할 수 있습니다. 무균 기술을 사용하여 조직 문화 후드에서 분석을 수행합니다. 1 일 : 플레이트와 셀의 준비 <ol><li> ELISPOT 플레이트를 타고 후드에서 엽니다. </li><li> 가능한 경우, 별도로 하나의 잘 pipetting가 수용되어 다채널 pipettor를 사용 1X PBS 150 μL와 접시에게 3 번 씻으십시오. </li><li> 저수지의 패키지를 꺼내서 후드에서 엽니다. </li><li> 2 μg / ML 캡처 항체의 안티 - 인간 인터페론 - γ, 11 1X PBS의 MLS. 추가 잘 와동. 저수지에 항체 믹스를 전송합니다. </li><li> 각 잘 다중 채널을 사용에 코팅 용액 100 μL를 놓습니다. </li><li> parafilm의 접시를 넣어. </li><li> 하룻밤 냉장고에 접시를 놓습니다. 번호판 주간 좋다. 엄지의 규칙은 우물에 액체가 남아 아직도있다면 접시가 사용될 수있다는 것입니다. </li></ol> 셀 준비 PBMCs가 신선면 37 세포를 포함하고 밤새 품어 ° C를 5 % CO 2. PBMC에 대한 세포의 해동하는 것이 필요하다, 액체 질소에 저장됩니다. 다음과 같이 프로토콜은 다음과 같습니다 : <ol><li> 37 거의 완전히 해동 때까지 ° C의 물을 욕조에있는 세포의 cryovial을 해동. </li><li> 즉시 R10 미디어 5 ML에 resuspend. </li><li> 225 X G.에서 5 분 스핀 </li><li> R10 미디어 5 ML 다시 Resuspend와 trypan 파랑을 사용하여 가능한 세포를 계산합니다. </li><li> R10 미디어 2 X 10 6 세포 / ML에 집중을 가져와. </li><li> ° C와 5 % CO 2 37 하룻밤 휴식. </li></ol> 일 2 : 설정 - 업 플레이트 <ol><li> 표본 식별 번호, 잘 조건 및 날짜와 함께 레이블 플레이트 뚜껑. </li><li> 덤프 및 얼룩 방법을 사용하여 살균 1X PBS 150 μL와 접시 6 번 씻으십시오. 덤핑 동안 번호판을 시작하지 않도록주의하십시오. 이것은 접시의 우물은 보라색 회전시킬 수 있습니다. </li><li> 각 잘하는 R20 100 μL를 추가합니다. </li><li> 37 판 ° C 1 시간을 품어. </li><li> 접시 잠복기지만, 하룻밤 푹 있던 세포를 계산합니다. </li><li> 5 분 1,500 RPM의 세포 현탁액을 스핀. 뜨는을 가만히 따르다하고 R10 미디어 1mL 당 1X10 6 세포의 최종 농도가되도록 펠렛을 resuspend. </li><li> 1 시간 부화 후, 제거 R20 덤프 및 얼룩 방법을 사용합니다. 덤핑 동안 번호판을 시작하지 않도록주의하십시오. </li><li> 각 잘하는 세포 솔루션을 100 μL를 (10 5 셀)을 추가합니다. 중복의 해당 우물에 적절한 펩티드 및 / 또는 항원을 추가합니다. 새로운 피펫 팁 당신이 펩타이드 작업 솔루션에 갈 때마다 사용하십시오. 일반 펩타이드 농도는 10-40 μg / ML입니다. 펩티드가 다르므로, 각 수사관이 최적의 결과를 얻을 펩티드를 적정하다해야합니다. </li><li> 부정적인 제어 우물에서 유일한 세포를 (없음 펩티드) 추가 </li><li> 긍정적인 제어 우물에서 phytohemagglutinin을 (; 10 μg / ML, 시그마 PHA)을 추가합니다. </li><li> 37 밤새 품어 ° C 5 % CO 2와 (과 ~ 18 시간). </li></ol> 3 일 : 플레이트 개발 <ol><li> 덤프 및 얼룩 방법을 사용하여 150 μL 1xPBS와 접시 6 번 씻으십시오. </li><li> 멀티채널 pipettor를 사용하여 판의 각 잘 ~ 100 μL PBS를 추가합니다. </li><li> 15 분 냉장고에 접시를 넣어. </li><li> 냉장고에서 꺼내 접시를 타고 조직 문화 후드에 놓으십시오. </li><li> 비오틴 항체 솔루션을 준비 <ul><li> 11mL PBS에 0.​​5 μg / 비오틴 항체의 ML을 (mAB 7 B6 - 1) 추가합니다. </li><li> 잘 섞어 소용돌이 솔루션입니다. </li><li> 다채널을 사용하여 솔루션을 추가할 계획하면 저수지에 잔. </li></ul></li><li> 휴지통으로 그것을 flicking하여 PBS를 폐기하십시오. 덤핑 동안 번호판을 시작하지 않도록주의하십시오. </li><li> 각 우물에 솔루션을 100 μL를 놓습니다. </li><li> 한 시간 만이라도 실내 온도에서 조직 문화 후드에 금속판을 품어. </li><li> 덤프 및 얼룩 방법을 사용하여 150μL 1xPBS와 접시 6 번 씻으십시오. 당신이 Streptavidin 항체를 준비 때까지 6 번째 세척에서 접시에 PBS를 두십시오. </li><li> Streptavidin 항체를 준비합니다. <ul><li> 11mL PBS (1:2000 희석) 5.5 μ 리터 Streptavidin 항체 (Streptavidin - 알프)를 추가합니다. </li><li> 잘 섞어 소용돌이 솔루션입니다. </li><li> 다채널을 사용하여 솔루션을 추가할 계획하면 저수지에 잔. </li></ul></li><li> 우물에 남아있는 PBS를 삭제하고 번호판을 가릴. </li><li> 각 잘하는 Streptavidin 솔루션을 100 μL를 추가합니다. </li><li> 1 시간 동안 실온에서 조직 문화 후드에 금속판을 품어. </li><li> 접시 PBS는 덤프 및 얼룩 방법을 사용하여, 6 번 씻으십시오. 당신이 컬러 솔루션을 만들 때까지 6 번째 세척에서 접시에 PBS를 두십시오. </li><li> 어둠 속에서 작동합니다. 알칼리성 인산 가수 분해 효소 기판 솔루션 (알카라인 인산 가수 분해 효소 기판 키트 IV BCIP / NBT) 준비 : <ul><li> 기판 시약 1-11 ML 트리스 버퍼 잘 와동 4 방울을 추가합니다. 트리스 버퍼 잘 소용돌이에 기판 시약이 4 방울을 추가합니다. 트리스 버퍼 잘 소용돌이에 기판 시약 3 4 방울을 추가합니다. </li></ul></li><li> 나머지 PBS를 무시하고 번호판을 가릴. </li><li> 다채널을 사용하여 접시의 각각 잘 수있는 색상의 솔루션을 100 μL를 추가합니다. </li><li> 색상 5~10분가 개발 후 불을 켭니다. </li><li> 명소 보라색을 설정하는 시작하고 매우 어두운 때까지 색상 시약은 접시에 남아 수 있습니다. 이것은 5에서 20 분 거리에 걸릴 것입니다. 이렇게하면 높은 배경을 일으킬 수 있기 때문에 너무 오래에서 기판 솔루션을 떠나지 않도록주의하십시오. </li><li> 수돗물로 ELISPOT 판에게 3 번 씻으십시오. </li><li> 한 시간이나 야간을 위해 건조에 둡니다. </li><li> 수동 또는 ELISPOT 플레이트 리더와 플레이트를 참조하십시오. </li><li> 가벼운 노출 멀리 상자에 접시를 저장합니다. </li></ol> 대표 결과 : ELISPOT는 미생물 항원에 대한 면역 반응을 quantitate하도록 설계되었습니다. 각 지점의 관심 시토킨 표현, 단일 세포 응답을 나타냅니다. 장소는 수동으로 또는 ELISPOT 플레이트 판독기를 사용하여 계산하실 수 있습니다. ELISPOT가 올바르게 수행되었는지 평가는 관심의 시토킨의 배경 제작에 대한 부정적인 제어 조사로 시작한다. 약간의 배경 (보라색 색상)이있을 수 있지만 부정적인 제어 우물에서 하나는, 아무 반점을 볼 수있을 거라고 기대합니다. 일반적으로 잘 따라 오 명소 평균 이하가되어야합니다. 긍정적인 제어 우물은 반응이 제대로 수행되었는지 확인하고, 전지 antigenic의 자극에 반응하는. 긍정적인 제어 우물에서는 관광 명소 (Fig1)의 합류로 인해 깊은 보라색 배경을 보여야하는데. 없음 흰색 배경에 조금이 있어야합니다. 긍정적인 제어 및 대조군 샘플 적절한있다면, 하나는 다음 관심의 항원을 포함하고있는 우물을 계산하실 수 있습니다. &quot;suboptimal&quot;결과는 높은 배경 (우물은 자주색), 아니 명소 또는 거의 명소, 빈 센터, 저조한 정의 반점 또는 합류 관광 명소로 반영됩니다. 문제 해결 팁 목록 (표 1) 제공됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2221/2221fig1.jpg" /> 그림 1. ELISPOT 판의 대표. 각각의 플레이트는 긍정적인 컨트롤, 대조군 두 우물에 최소한의 관심 실시 펩티드를 포함해야합니다. 딥 퍼플 색상, 합류 세포 거의 모든 흰색 배경이 당신이 볼 수 있듯이 C9, C10, D9과 D10은 긍정적인 제어 우물입니다. 부정적인 제어 우물은 G11, G12, H11 및 H12 있습니다. 이 우물은 보라색 배경과 예상 없음 명소가 없습니다. 명소 G7, G8, H7 및 H8은 미생물의 펩티드로 세포 반응을 설명하고, 자주색 반점이 관심 시토킨을 표현하는 하나의 세포 응답을 나타냅니다. 표 1 <table border="1"><tbody><tr><td> 관찰 </td><td> 가능한 문제 </td><td> 가능한 솔루션 </td></tr><tr><td> 하이 배경 </td><td> 1. 막 양쪽 제대로 씻어 없습니다 2. 너무 많은 세포의 secreting의 시토킨 3. 플레이트가 제대로 건조되지 4. 개발 판 이상 </td><td> 1. 컬러 개발 이전과 이후 증류수와 함께 막의 양면을 씻으십시오. 시약은 접시의 바닥으로 세포막을 통해 누설 수 있으며, 씻어하지 않을 경우 이들은 높은 배경을 일으킬 수 있습니다. 2. 물론 당 세포의 수를 감소, 이것은 최적화가 필요합니다 3. 읽기 전에 접시 이상 건조 4. 개발 시간을 단축 </td></tr><tr><td> 관광 명​​소 없음 / 거의 명소 없음 </td><td> 1. secreting의 시토킨 / 관심의 단백질 충분하지 세포의 2. 세포가 제대로 자극되도록 3. 내 말 좀 incubated하지 세포충분히 긴 사연 또는 흥분제에 응답하는 시간이 오래 걸릴 수 있습니다 4. 부적 절한 컬러 개발 5. 충분한 기본 또는 보조하지 항체 </td><td> 1. 세포의 수를 늘립니다. 이것은 최적화가 필요합니다 2. 당신이 시토킨 / 관심 단백질의 표현을 유도합니다 알고 흥분제 - 또한 긍정적인 자극의 컨트롤을 사용 3. 세포 배양 시간을 늘리거나 간접적 방법 (자극과 사전 치료 전지)를 사용 4. 오버헤드 현미경으로 컬러 개발을 모니터링하고 개발 시약이 올바르게 저장되었습니다 활동을 잃었하지 않도록 5. 기본 및 / 또는 보조 항체의 농도가 증가해야합니다. 이것은 최적화가 필요합니다. </td></tr><tr><td> 빈 영역 </td><td> 1. 막 미리 처리하지 2. 막 어떤 단계에서 밖으로 건조했다 3. 세포는 unevenly 배포 </td><td> 1. 확인 막은 충분히 70 %의 에탄올 (모든 점막이 너무 귀하의 공급 업체에 확인하지 않아도)와 pretreated 있습니다. 나중에 PBS 배와 잘 씻으십시오 2. 막 건조되지 않도록 3. 당신이 우물 밖으로 pipetting 전에 좋은 동종 세포 현탁액을 가지고 부드럽게 세포를 섞어 확인 </td></tr><tr><td> 빈 센터 </td><td> 1. 세탁 피해 </td><td> 1. 자동 와셔 (또는 pipetting)에 유량이 너무 높은 수 있습니다. 보다 부드러운 세척 절차를 필요 </td></tr><tr><td> 잘못된 반응 </td><td> 1. 차 항체 집계 2. 아직 막에 셀 3. 세포 배양 오염 </td><td> 1. 보조 항체를 필터 2. 모든 세포가 이차 항체 부화하기 전에 PBS 트윈 20과 멤브레인에서 세탁 있도록. 멤브레인 왼쪽 세포는 불규칙한 모양의 반점를 제공합니다 3. 살균 및 가능한 한 깨끗한 등 시약 보관하십시오. 당신의 세포 배양 기술은 무균 있는지 확인하십시오. 미디어 부정적인 컨트롤을 실행하여 잘못된 반응 있는지 확인합니다. 판 운동, <a href="http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&amp;rid=11457#7">제대로 정의 명소를 참조하십시오</a> </td></tr><tr><td> 콘플루앙 명소 </td><td> 1. 불쌍한 코팅, 너무 많은 항체 2. 연장 세포 배양 3. 세포가 과잉 자극 </td><td> 1. 기본 항체 농도를 줄입니다 2. 더 이상 세포가 incubated 있으며, 더 시토킨 / 단백질들이 분비됩니다. 이것은 합병과 분간이 될 시작합니다 더 큰 장소가 발생합니다. 3. 세포 배양 단계 배양 시간을 줄일 수 있습니다. 이상 - 자극이 시토킨 / 세포에 의해 분비되는 단백질이 많이 발생합니다. 이것은 합병과 분간이 될 시작합니다 장소를 생산합니다. 시간이 짧은 금액에 대한 문화 미디어 또는 문화에 자극의 양을 줄이기 </td></tr><tr><td> 저조한 정의 명소 </td><td> 1. 멤브레인 아니라 사전 처리는 (귀하의 세포막이 필요한 경우, 공급 업체에 문의하십시오) 2. 세포 배양 중에 플레이트의 움직임 </td><td> 1. 막은 에탄올 또는이 퍼지, 저조한 정의 명소가 발생할 수 있습니다 사전 취급해야합니다. 독자가 이들을 구별하는 것은 어려운 것입니다 2. 이사 세포가 두 개 이상의 자리를 만들 수 있으므로 접시 세포 배양 중에 이동하는 것을 허용하지 않습니다. 가능한 부화하는 동안 공개되지 않습니다 전용 배양기를 사용하는 경우. 세포를 추가한 후 번호판을 탭하지 마십시오 </td></tr><tr><td> 긍정적인 제어 우물이 낮습니다 </td><td> 1. Underdevelopment가 - 실내 온도로 이동되지 않은 Streptavidin - 알프 및 / 또는 BCIP / NBT 솔루션을 사용하여 결과 수 있습니다 </td><td> 1. 우물에 추가하기 전에 실내 온도에 시약 가져와 </td></tr><tr><td> 명소 밀도는 어려운 그들을 계량 수 있습니다 </td><td> 1. 너무 많은 세포가 우물에 추가되었습니다 </td><td> 1. 뚜렷한 반점 형성집니다 세포의 최적의 수를 결정하는 세포의 dilutions (예 : 1, 물론 당 × 10 6, 5 × 10 5, 1 × 10 5, 5 X 10 4, 1 X 10 4 세포)를 만들 </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+diagnostic+evaluation+of+suspected+tuberculosis.">Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis.</a> Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).</li><li>Sung, H. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+abdominal+tuberculosis+by+T-cell+based+assays+on+peripheral+blood+and+peritoneal+fluid+mononuclear+cells.">Diagnosis of abdominal tuberculosis by T-cell based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells.</a> Journal of Infection. 59, 409-415 (2009).</li><li>Kim, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+Central+Nervous+System+Tuberculosis+by+T-Cell-Based+Assays+on+Peripheral+Blood+and+Cerebrospinal+Fluid+Mononuclear+Cells.">Diagnosis of Central Nervous System Tuberculosis by T-Cell-Based Assays on Peripheral Blood and Cerebrospinal Fluid Mononuclear Cells.</a> Clinical and Vaccine Immunology. , 1356-1362 (2008).</li><li>Drake, W. P., Dhason, M. S., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Vadivelu, S., Hajizadeh, R., Newman, L. S., Kalams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+recognition+of+Mycobacterium+tuberculosis+ESAT-6+and+KatG+peptides+in+systemic+sarcoidosis.">Cellular recognition of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and KatG peptides in systemic sarcoidosis.</a> Infect Immun. 75, 527-530 (2007).</li><li>Allen, S. S., Evans, W., Carlisle, J., Hajizadeh, R., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Pride, D. T., Johnson, J. E., Drake, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+dismutase+A+antigens+derived+from+molecular+analysis+of+sarcoidosis+granulomas+elicit+systemic+Th-1+immune+responses.">Superoxide dismutase A antigens derived from molecular analysis of sarcoidosis granulomas elicit systemic Th-1 immune responses.</a> Respir Res. 25, 36-36 (2008).</li><li>Mutsvangwa, J., Millington, K. A., Chaka, K., Mavhudzi, T., Cheung, Y. B., Mason, P. R., Butterworth, A. E., Corbett, E. L., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+recent+Mycobacterium+tuberculosis+transmission+in+the+setting+of+high+HIV+and+TB+burden.">Identifying recent Mycobacterium tuberculosis transmission in the setting of high HIV and TB burden.</a> Thorax. 65, 315-320 (2010).</li><li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research.">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat Protoc. 4, 461-469 (2009).</li><li>Chaudhary, N., Staab, J. F., Marr, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+human+T-Cell+Responses+to+Aspergillus+fumigatus+antigens.">Healthy human T-Cell Responses to Aspergillus fumigatus antigens.</a> PLoS One. 5, e9036-e9036 (2010).</li><li>Manigold, T., Mori, A., Graumann, R., Llop, E., Simon, V., Ferr, S. M., Valdivieso, F., Castillo, C., Hjelle, B., Vial, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+differentiated,+resting+gn-specific+memory+CD8++T+cells+persist+years+after+infection+by+andes+hantavirus.">Highly differentiated, resting gn-specific memory CD8+ T cells persist years after infection by andes hantavirus.</a> PLoS Pathog. 6, e1000779-e1000779 (2010).</li><li>Ndongala, M. L., Kamya, P., Boulet, S., Peretz, Y., Rouleau, D., Tremblay, C., Leblanc, R., C&#244;t&#233;, P., Baril, J. G., Thomas, R., V&#233;zina, S., Boulassel, M. R., Routy, J. P., S&#233;kaly, R. P., Bernard, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+function+of+HIV-specific+T-cell+responses+with+increasing+time+from+infection.">Changes in function of HIV-specific T-cell responses with increasing time from infection.</a> Viral Immunol. 2, 159-168 (2010).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

ELISPOT 분석은 인간의 면역 반응을 모니터링하는 가장 중요하고 널리 사용 assays의 하나로서 등장과 다른 종의 다양한 있습니다. ELISPOT 분석과 함께, 면역 세포 주파수는 세포 집단의 확장이나 조작없이 단일 세포 수준에서 측정할 수 있습니다. ELISPOT 분석 널리 감염증, 암, 알레르기 및 면역 질환 등 다양한 질병의 항원 특정 면역 반응을 조사하기 위해 적용되었습니다. 이 분석의 응용 프로그램은 ?...

미디어 A. 준비 <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsA.jpg" alt="자료" /> 트리스 버퍼의 B. 준비 <ol><li> 1 L의 비커에 ddH 2 O 800 ML을 추가합니다. </li><li> 트리스의 12g를 측정하여 비커에 추가할 수 있습니다. </li><li> 비커에 : 마그네슘 염화 hexahydrate의 0.12 g (6H 2 O MgCl 2) 추가합니다. </li><li> 자동 교반 접시에 자석 교반 막대로 저어. </li><li> 일단 9.5에 대한 솔루션은 산도, 해산. </li><li> 1000mL로를 데리고, 비커에 ddH 2 O 200 ML을 추가합니다. </li><li> 0.22 μm의 필터와 솔루션을 필터링합니다. </li></ol> ELISPOT 분석에 필요한 C. 재료 : <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsb.jpg" alt="재료 B" />

enzyme-linked immunospot assay (elispot):  quantification of th-1 cellular immune responses against microbial antigens

적응성 면역은 세포 내 병원균의 통관하는 중요한 구성 요소입니다. 인간이 반응을 감지하고 계량하는 능력은 중요한 진단 도구입니다. 효소 링크된 immunospot 분석 (ELISPOT)는 등 HIV 감염, 이식있는 사람으로 immunosuppressed 인구 및 스테로이드 사용을 포함한 미생물의 항원, 세포 면역에 대한 답변을 식별하는 능력에 대한 인기를 얻고있다. 이 분석은 면역 특정 미생물 항원에 대한 반응뿐만 아니라, 이러한 반응은 성격 Th1 또는 Th2 경우에는 구별을 계량하는 능력이 있습니다. ELISPOT은 염증의 사이트에 국한되지 않습니다. 그것은 주변 혈액뿐만 아니라 bronchoalveolar 세척, 대뇌 척수, 그리고 복수와 같은 적극적인 참여의 사이트 내에서 면역 반응에 대한 평가 능력에 다재 다능한 것입니다. 단일 또는 여러 항원에 대한 면역 반응의 검색이 가능합니다뿐만 아니라, 미생물 단백질 내의 특정 epitopes. 이 분석은 시간이 지남에 따라 면역 반응의 검출뿐만 아니라 호스트 T 세포에 의해 인식 항원의 구분을 용이하게합니다. 듀얼 컬러 ELISPOT assays의 두 크린 시토킨의 동시 표현의 검색이 가능합니다. 이 기술에 대한 최근의 애플 리케이션 extrapulmonary 결핵의 진단뿐만 아니라 면역 질환 감염성 항원의 공헌에 대한 조사를 포함합니다.

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Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

특발성 질환에 적응 면역의 미생물 목표 식별은 효소 연결된 immunospot 분석을 사용하여 수행할 수 있습니다.

효소 링크된 Immunospot 분석 (ELISPOT) : 미생물 항원 반대 예뻐 - 1 세포 면역 반응의 부량

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

34.6K 조회수.  Vanderbilt University School of Medicine. 특발성 질환에 적응 면역의 미생물 목표 식별은 효소 연결된 immunospot 분석을 사용하여 수행할 수 있습니다.

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Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

인간 Papillomavirus의 소설 T-세포 Epitopes를 특성화하기 위해 인터페론-γ 효소 연결된 Immunospot 분석의 이용

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

연구

면역학 및 감염병학

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

소에 이펙터 및 메모리 T 세포 반응을 평가하기위한 장기 배양 인터페론-γ 효소 링크 된 Immunospot 분석의 응용 프로그램

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

예방 접종 후 기니 돼지 모델에서 측정 T 세포 응답에 최적화 된 인터페론-감마 ELISpot 분석 결과

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic 살해 분석 결과 세균성 병원 체에 대 한 면역학 응답을 평가 하

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to assess the respiratory immune/inflammatory response to this bacterium. Flow cytometry and confocal microscopy are fluorescence-based technologies that allow detailed characterization of biological responses.&#160;Different forms of Hi antigen can be used, including cell wall components, killed/inactivated preparations, and live bacteria. Hi is a fastidious bacterium that requires enriched media but is generally easy to grow in standard laboratory settings. Tissue samples for stimulation with Hi may be obtained from peripheral blood, bronchoscopy, or resected lung (e.g., in patients undergoing surgery for the treatment of lung cancer). Macrophage and neutrophil function may be comprehensively assessed using flow cytometry with a variety of parameters measured, including phagocytosis, reactive oxygen species, and intracellular cytokine production. Lymphocyte function (e.g., T cell and NK cell function) may be specifically assessed using flow cytometry, principally for intracellular cytokine production. Hi infection is a potent inducer of extracellular trap production, both by neutrophils (NETs) and macrophages (METs). Confocal microscopy is arguably the most optimal way to assess NET and MET expression, which may also be used to assess protease activity. Lung immunity to Haemophilus influenzae can be assessed using flow cytometry and confocal microscopy.

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae induces inflammation in the respiratory tract. This article will focus on the use of flow cytometry and confocal microscopy to define immune responses by phagocytes and lymphocytes in response to this bacterium.

헤모필루스 인플루엔자에 대한 호흡기 면역 반응 평가

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...