저자는 연구 참가자와 그들의 부모를 감사드립니다. 우리는 또한 자신의 ELISPOT 리더, 통계 분석 박사 Lubo 알렉산드로에 액세스 박사 Réjean LAPOINTE (미끼 노트르담, 몬트리올, 캐나다) 감사, 데니스 BLAIS, 산드라 카론, Silvie 루아 및 기술 전문가에 대한 마틴 CATY 것 지원. 르 퐁 디부 작업 라 매그 센터 드 cancérologie 찰스 - Bruneau에 의해, HS 및 PO에 레 projets 드 공들인 크리니크 등 디부 인 evalution 데 기술 (CHU 세인트 - 저스틴)를 부어, 그리고 백혈병과 림프종 사회에 의해에서 교부금에 의해 지원 캐나다. ISF는 라 매그 CHU 세인트 - 저스틴 르 퐁 드 라 공들인 뒤 퀘벡 - 상테 (FRQS)에서 장학금으로 지원되었다. AJG 미생물학, Infectiology &amp; 면역학, Université 드 몬트리올 (가브리엘 - 후작 장학금), FRQS학과에서 장학금을받는 사람, 그리고 건강의 캐나다 연구소 R이 esearch (CIHR). 뉴 멕시코 라 매그 CHU 생트 저스틴, 콜 재단과 FRQS에 의해 지원되었다.

이 연구 프로토콜은 연구가 실시되었다 CHU 세인트 - 저스틴, 몬트리올, 퀘벡, 캐나다의 기관 윤리 심의위원회의 승인을 받았다. 동의가 추구하고 모든 연구 참가자, 부모 또는 법적 보호자로부터 얻은 것입니다. 전체 절차는 1 일에 수행하고 2 (a 층류 후드하에 즉) 멸균 조건 하에서 수행되어야한다. 인간의 혈액을 처리하기위한 표준 안전 절차를 엄격하게 준수해야합니다. 1. 플레이트를 코팅 <ol><li> 각 웰에 1 분 35 % 에탄올 20 μl를 추가하여 96 웰 MultiScreen의 IP 흰색 ELISPOT 플레이트의 하단에 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 막을 투과. 막 약간 반투명하게한다. </li><li> MUL을 사용하여, 즉시 1X 인산염 완충 생리 식염수 200 μL (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 2 HPO 4, 2 ㎜ KH 2 PO 4, pH 7.4의 PBS)와 웰을 3 회 세척피펫 또는 유사한 장치를 tichannel. 이 단계는 에탄올 잔기가 세포 생존에 영향을 포획 항체에 결합 할 수있는 관련 중요하다. ELISPOT 판은 연약하고 신중하게 처리해야한다 : 자동 접시 세척기의 사용을 권장하지 않습니다. </li><li> 코트 10 μg / ML의 최종 농도에 1X PBS에 희석 정제 된 마우스 항 - 인간 IFN-γ 캡처 항체의 10 μL와 우물. 일반 플라스틱 랩으로 접시를 덮고 4 ℃에서 하룻밤 배양 </li></ol> 2. 플레이트 차단 <ol><li> 그들이 건조 도청, 우물을 비우기 및 1X PBS 200 μL와 접시에게 5 번 씻는다. </li><li> 전체 RPMI 1640 배지 200 ㎕ 씩 우물을 입력하고 (단계 차단) 37 ° C에서 2 시간 동안 접시를 품어. </li><li> 플레이트는 1X PBS 200 ㎕ 씩 5 배 세포 도금 할 준비가 될 때까지 전체 1X PBS의 우물을 계속 씻으십시오. </li></ol> 3. 셀 도금 및 자극 <ol><li> P 준비표준 절차를 사용하여 피콜-Paque 구배 원심 분리에 의해 인간의 정맥 혈액 샘플로부터 eripheral 혈액 단핵 세포 (PBMC). 또한, 표준 방법을 사용하여, 액체 질소에서 냉동 PBMC의 분취 량을 해동. 마지막으로 원심 분리,에 resuspend ml의 2 × 10 6 세포 /의 최종 농도에서 세포와 물 재킷 배양기에서 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 하룻밤 배양 한 후. </li><li> 인큐베이터에서 PBMC를 제거하고 완전한 RPMI 1640 배지 5 ㎖의 최종 부피를 재현 탁. </li><li> 실온에서 5 분간 세라 티아 마르세 슨스에서 유전자 조작 효소의 10 μL의 존재에 PBMC를 품어. </li><li> PBMC의 50 μL 나누어지는을 제거하고 트리 판 블루 염색의 50 μL와 혼합. 세포를 세어 혈구와 현미경 검사 (염료 배제 방식)를 사용하여 %의 가능성을 예상하고있다. 셀 카운팅과 세포 생존 캔 알의 평가를위한 다양한 자동화 된 방법그래서 사용. PBMC는&gt; 95 % 실행 가능해야합니다. 가능성이 95 %보다 낮은 경우 샘플을 폐기하십시오. </li><li> 5 분, 폐기 뜨는, 2 X 10 6 세포 / ML의 최종 농도 2 % (V / V) 불 활성화 된 사람의 혈청 (HIS)와 보충 AIM-V 매체에 resuspend 세포 700 XG에 원심 분리기 PBMC. 자극 혼합물이 판에 추가 될 때까지 37 ℃에서 보관하십시오. </li><li> , 우물에 한 번에 한 방울, 적절한 자극 혼합물의 100 μl를 추가합니다. 후술하는 바와 같이 세 개의 자극의 혼합물이 사용되어야한다 : <ol><li> 사용 AIM-V 매체는 2 % (V / V) 불 활성화 된 사람의 혈청 (IHS)와 같은 음성 대조군과 보충. </li><li> 0.5 ㎍ / ml로 긍정적 인 제어)의 최종 농도 2 % (V / V) IHS 보충 AIM-V 매체에 희석 항 CD3 단클론 항체 (클론 OKT3)를 사용합니다. </li><li> γ-조사 중 하나의 형태로, VZV의 항원을 사용하여 (10,000 Gy를, 30 분의 노출 시간) 감쇠 VZV 백신 (1,350 플라크 형성 단위 [PFU] / ml)에 살고 diluAIM-V 매체의 테드 1:200 2 % (V / V) IHS) 또는 즉시 초기에 VZV의 순서 (IE63) 인 단백질에 따라 합성 67 펩티드 (15 아미노산 잔기)의 몰 혼합물의 1 μg로 보충 . PBMC 배양 4 일 후 세포 변성 효과의 흔적이 없음을 모니터링하여 조사 효과를 제어 할 수 있습니다. </li><li> 중복의 모든 우물을 준비합니다. </li></ol></li><li> , 우물에 한 번에 한 방울, 적절한 우물 단계 5.4에서 준비 세포를 100 μl를 추가합니다. 두 우물은 음성 대조군없이 남아 있어야합니다. 물 재킷 배양기에서 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 20 시간 동안 배양한다. 흔들 이동하거나 배양하는 동안 서로의 위에 접시를 쌓아 두지 마십시오. </li></ol> 4. 스팟 개발 및 검출 <ol><li> 세포를 버리고 1X PBS로 접시에게 배 세척 0.05 % (V / V) 트윈 20 (PBST)로 보충. 트윈 20은 PVDF 나에 부착 한 세포를 분리하는 데 도움이하룻밤 배양 한 다음 mbrane. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여, 0.5 mg의 100 μl를 추가 / ㎖의 바이오틴 결합 된 항-IFN-γ 모노클로 날 항체 (w / v) 소 혈청 알부민 (BSA) 0.5 %를 함유하는 1X PBS에 희석 (4S.B3 클론). 실온에서 2 시간 동안 접시를 품어. </li><li> 우물 PBST로 6 배 세척하고 각 웰에게 (W / V) BSA 0.5 %를 포함 1X PBS에서 1:1000 희석 알칼리 포스 파타 아제와 스트렙 타비 딘의 conjugatd 100 μl를 추가합니다. 플레이트를 덮고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 판을 PBST로 3 배 세척하고 1X PBS로 3 배. 5 - 브로 모 -4 - 클로로 -3 - 인돌 일 포스페이트 (BCIP) / 니트로 블루 테트라 졸륨 클로라이드 (NBT) 기질 용액 100 ㎕를 추가하고 실온에서 5 분간 배양한다. </li><li> 증류수 흐르는 물에 접시를 씻으십시오. ELISPOT 플레이트의 바닥 부분을 제거하고 증류수로 멤브레인의 양면을 씻는다. 공기는 판을 건조. </li><li> 우물을 검사하고 입체 D를 사용하여 지점을 열거issection 현미경 또는 자동화 자리 카운터를 사용하여 번호판을 검색합니다. 그들은 동일한 날에 시험 될 수없는 경우에 얻어 빛으로부터 판을 유지한다. <ol><li> 해당 중복 우물에서 계산 지점의 수를 평균 및 테스트 우물 계산 반점의 수와 부정적인 제어 우물에서 계산 지점의 수 (무 세포)를 뺍니다. </li><li> 10 6 PBMC 당 반점 형성 단위 수 (SFU)으로 IFN-γ 생산을 표현한다. </li><li> SFU의 수가 대조군 이상&gt; 50 10 당 6 PBMC 2 표준 편차 (SD) 인 경우 그 시료가 긍정적 인 고려 (세포 + AIM-V 매체는 2 % (V / V) IHS 보충). </li><li> 장소는 계산이 너무 많은 경우 잘 당 400 SFU의 값을 사용합니다. </li></ol></li><li> 테스트 ELISPOT 데이터는 일반적으로 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 테스트를 사용하여 분산할지 여부. 데이터가 정규 분포를하는 경우, 학생의 t TES를 사용하여 통계적인 비교를 수행T (2 그룹) 또는 ANOVA와 Bonferroni 사후 테스트 (다중 비교). 데이터가 정규 분포를하지 않는 경우는 Mann-Whitney U 테스트 (2 그룹) 또는 크루스 칼 - 월리스 테스트와 던의 사후 테스트 (다중 비교)을 사용합니다. </li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

변형 및 문제 해결 : IFN-γ ELISPOT 분석법은 인간 면역 결핍 바이러스 1 형 (HIV-1) 24, 25, 간염 C 바이러스 (HCV) (26)를 포함하여 미생물 병원체의 종류에 대하여 지시 세포 매개 성 면역 반응을 조사하는 데 사용되어, 27, 및 결핵균 28,29, 그냥 몇 가지 이름을 지정합니다. 여기에서 우리는 소아 UCBT받는 사람을 복구하는 VZV 특정 면역 재구성의 상관 관계를 정의하는 ?...

처음으로 1989 년에 수행 UCBT 점점 아이들 1에서 다양한 종양 및 nonneoplastic 혈액 장애의 치료의 일부로서 사용된다. VZV는 두 개의 서로 다른 질환, 수두 (차 감염 후)과 대상 포진 (활성화 후)를 일으키는 원인이되는 세포 변성 인간 alphaherpesvirus입니다. 차 감염 후, VZV는 후근 신경절의 감각 신경에서 숨겨 호스트의 전 생애에 걸쳐 지속. UCBT 다음 가장 위협하는 감염성 합병증의 하나가 VZV 2-4와 연결되어 있습니다. 우리의 임상 센터에서, VZV 예방의 부재에서 3 년에서 VZV 질환 VZV 질환의 누적 발생률은 postUCBT 46 % 2. 이러한 환자에서 새로이 감염 또는 VZV의 재 활성화는 종종 중추 신경계, 폐, 간 5-7에 내장 보급과 관련이 있습니다. 그 결과, 아 시클로 비르, 팜 시클로 비어 발라 시클로 비르 또는 예방 일반적 UB에 투여함에CT받는 8,9. 그러나,이 치료 전략의 계정에 VZV 특정 T 림프구 또는 VZV 특정 T 세포 반응의 재구성의 반응 속도의 보호 가능성을 고려하지 않습니다. 장기 antiherpetic 예방의 확장 사용과 관련된 잠재적 인 문제는) 환자의 overtreatment를 포함한다; b) 항 바이러스 약제 내성 10, 11의 개발; 및 C) VZV 특정 면역 재구성 (12, 13)의 손상. 기능 VZV 특정 T 림프구의 검출은 이식 후 기간 동안 VZV에 대한 감독 세포 매개 면역 반응을 모니터링, VZV 감염에서 장기 보호의 존재와 개선 된 임상 결과 4,14,15과 관련이 있기 때문에 바이러스의보다 합리적인 사용이 발생할 수 있습니다 VZV부터 혜택을받을 환자를 구별하기 위해 의료인 있도록함으로써 치료는 그의 면역 시스템 VZV 복제 4,13를 제어 할 수있다 것과 예방 치료. IFN-γ ELISPOT 분석 널리 실험 시스템 및 임상 다양한 조건의 모니터링 세포 매개 면역 반응에 사용됩니다. 스팟은 반응 사이트에 가시적이고 안정적​​ 침전물을 생성, 발색 기질의 절단 뒤에 생성된다. 각각의 자리하여 개별 사이토 카인을 생산하는 셀의 공간을 나타냅니다. IFN-γ ELISPOT은 동족 항원 시험 관내 자극에 응답하여 IFN-γ를 생산하는 개별 세포를 생체의 능력을 측정 할 수있을뿐 아니라 관련 세포 집단 (16, 17)의 셀 응답의 주파수의 추정치를 제공한다. 높은 감도 외에, IFN-γ ELISPOT은 항 바이러스 치료의 개시 또는 정지를 안내 겨냥 개인화 임상 프로토콜 컨텍스트에서 가능한 사용을 만드는 수행 간단하다. 절차는 describ 아래에 자세히 설명ES 구체적 VZV 유래 항원 시험 관내 자극 다음 말초 혈액 단핵 세포에 의해 IFN-γ의 생산을 검출하고 측정하기 위해 설계된 ELISPOT 분석.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leucocep tube</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">89048-936/89048-932</td>
			<td style="width:397px;">12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:101px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:143px;">17-1440-02</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:101px;">Novagen</td>
			<td style="width:143px;">70746-3</td>
			<td>Keep at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MultiScreenHTS-IP Filter Plate</td>
			<td style="width:101px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">MSIPS4W10</td>
			<td>Sterile with pore size of 0.45 &#181;m.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti-human IFN-&#947; capture antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">551221</td>
			<td>NIB42 clone.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pepmix VZV IE63&#160;</td>
			<td style="width:101px;">JPT Peptide Technologies</td>
			<td style="width:143px;">PM-VZV-IE63</td>
			<td>Dissolve contents of one vial in 40 &#956;L of DMSO. Use within 6 months.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-conjugated anti-IFN-&#947; monoclonal antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">554550</td>
			<td>4SB3 clone.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-3554</td>
			<td>Dilute for use on the same day.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BCIP/NBT</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-6432</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an ifn-&#947; elispot assay to assess varicella-zoster virus-specific cell-mediated immunity following umbilical cord blood transplantation

수두 대상 포진 바이러스 (VZV)는 탯줄 혈액 이식 (UCBT) 다음과 같은 병적 상태와 사망률의 중요한 원인이다. 이러한 이유로, antiherpetic 예방은 VZV 감염과 관련된 합병증을 방지하기 위해 소아 UCBT받는 사람에게 체계적으로 투여하지만, 최적의 기간을 정의하는 더 강력한 증거 기반의 합의가되지 않습니다. T 세포 성 면역은 UCBT는 예방이 유지되어야하거나 중단 할 수 있는지 여부에 대해 표시를 제공 할 수있는 다음과 같은 VZV 특정 T 세포 반응의 재구성을 평가, VZV 감염의 관리에 대한 책임이 있기 때문이다. 이를 위해, VZV 특정 감마 인터페론 (IFN-γ), 효소 - 결합 immunospot (ELISPOT) 분석은 조사 된 약독 VZV 백신 시험 관내 자극에 반응하여 T 림프구에 의해 IFN-γ 생산을 특성화하기 위해 개발되었다. 이 분석은 VZV 특정 C의 빠른 재현하고 민감한 측정을 제공합니다엘 임상 환경에서 VZV 특정 면역 재구성을 모니터링하고 VZV 항원에 면역 응답 성을 평가하기위한 적절한 면역을 중재.

위에서 자세히 IFN-γ ELISPOT 프로토콜은 크기 및 VZV 4 향한 세포 매개 성 면역 반응의 품질을 측정하기 위해 개발하고 실험실에서 최적화되었다. VZV 항원의 다양한 소스는 자극 공정에 사용될 수있다. 풍향 :) VZV에서 시판 세제를 불 활성화 추출물 베로 세포 18 감염; IE63 15 ORF4 19을 포함한 특정 VZV 인코딩 된 단백질의 합성 펩티드를 중복 B) 풀; C) 약독 화 수두 대상 포?...

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Development of an IFN-&amp;#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

이러한 단일 세포 수준에서 사이토 카인 생성을 감지하고 T 세포 반응의 양적 및 질적 인 특성을 제공하는 감마 인터페론 (IFN-γ) ELISPOT 등 기능적 분석법 비발 세대 수두 대상 포진 향한 세포 매개 성 면역 반응을 평가하기 위해 사용될 수있다 바이러스 (VZV).

제대혈 이식을 다음과 IFN-γ 평가하기 ELISPOT 분석을 수두 - 대상 포진 바이러스 - 특정 세포 성 면역의 개발

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

development-an-ifn-elispot-assay-to-assess-varicella-zoster-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

15.5K 조회수.  Université de Montréal.  이러한 단일 세포 수준에서 사이토 카인 생성을 감지하고 T 세포 반응의 양적 및 질적 인 특성을 제공하는 감마 인터페론 (IFN-γ) ELISPOT 등 기능적 분석법 비발 세대 수두 대상 포진 향한 세포 매개 성 면역 반응을 평가하기 위해 사용될 수있다 바이러스 (VZV). 

비디오: Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

효소 링크된 Immunospot 분석 (ELISPOT) : 미생물 항원 반대 예뻐 - 1 세포 면역 반응의 부량

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

연구

면역학 및 감염병학

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

탯줄 혈액에서 세포 독성 T 림프구 확장이 대상 사이토 메갈로 바이러스, 엡스타인 - 바 바이러스, 그리고 아데노 바이러스

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

임상 신청<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em유전자 주변과 배꼽 탯줄 혈액에서 T 세포를 수정하는 셀을 제시&gt;과 인공 항원

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합의 절연

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

를 사용하여 폐렴 구균 식민지에서 생균제의 효과를 조사<em&gt; 체외</em&gt; 준수의 분석

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are used for host defense. For the quantitative determination of the functional status of the humoral immune response of an individual, both serum Abs and circulating ASCs are commonly measured as functional readouts. In humans, peripheral blood is the most convenient and readily accessible sample that can be used for the determination of the humoral immune response elicited by host B cells. Distinct B-cell subsets, including ASCs, can be isolated directly from peripheral blood via selection with lineage-specific Ab-conjugated microbeads or via cell sorting with flow cytometry. Moreover, purified na&#239;ve and memory B cells can be activated and differentiated into ASCs in culture. The functional activities of ASCs to contribute to Ab secretion can be quantified by ELISpot, which is an assay that converges enzyme-linked immunoabsorbance assay (ELISA) and western blotting technologies to enable the enumeration of individual ASCs at the single-cell level. In practice, the ELISpot assay has been increasingly used to evaluate vaccine efficacy because of the ease of handling of a large number of blood samples. The methods of isolating human B cells from peripheral blood, the differentiation of B cells into ASCs in vitro, and the employment of ELISpot for the quantification of total IgM- and IgG-ASCs will be described here.

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

단핵구 단층 분석의 사용은 Fcγ 수용체 - 매개 식균 작용을 평가하기

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

형광 기반의 뉴 라미니다 아제 억제 분석은 항 바이러스제의 뉴 라미니다 아제 억제제 클래스에 인플루엔자 바이러스의 감수성을 평가하기 위해

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

Zika 바이러스 특정 진단 Epitope 발견

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...