먼저 섭씨 영하 80도의 냉동고에서 FN-실크 바이알을 꺼내 드라이아이스에 넣어 운반합니다. 바이알을 생물 안전 작업대로 가져와 마이크로 원심분리기 튜브 랙에 넣습니다. 해동 시 550마이크로리터의 실크 용액을 48웰 플레이트의 두 번째 웰에 피펫팅합니다.
접시에 뚜껑을 덮고 멸균 상자 안에 넣습니다. 생물 안전 작업대에서 상자를 조심스럽게 옮기고 밤새 주변 조건에 두십시오. 다음 날, FN-실크 멤브레인과 멸균 삽입물이 들어 있는 플레이트가 들어 있는 상자를 생물 안전 작업대로 가져옵니다.
상자에서 플레이트를 조심스럽게 들어 올리고 플레이트의 뚜껑을 열고 우물의 탁도를 관찰하여 멤브레인 형성을 육안으로 확인합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 하나의 인서트를 집어 손잡이가 웰 상단에 닿을 때까지 멤브레인으로 안내합니다. 모든 삽입물을 내린 후 플레이트에 뚜껑을 놓고 플레이트를 멸균 상자에 다시 넣습니다.
멤브레인이 2시간 동안 인서트에 부착되도록 합니다. 그런 다음 상자에서 접시를 제거하고 뚜껑을 엽니다. 멸균 핀셋을 사용하여 웰에서 삽입물을 제거합니다.
기초 파종의 경우 100마이크로리터의 DMEM/F12, 정점 파종의 경우 200마이크로리터로 인서트를 채웁니다. 인서트를 24웰 플레이트의 빈 웰로 옮기고 웰에 DMEM/F12 1밀리리터를 채웁니다. 원하는 수의 인간 각질형성세포를 채취한 후 P200 피펫을 사용하여 20-50 마이크로리터의 세포 현탁액을 흡인합니다.
피펫 팁을 멤브레인 중앙을 향하게 하고 피펫 플런저를 천천히 눌러 액적을 인서트 내부의 배양 배지에 접촉시킵니다. 모든 멤브레인이 이동되면 플레이트를 8자 모양으로 이동하여 셀이 멤브레인 전체에 고르게 분포되도록 합니다. 섭씨 37도에서 배양액을 배양하고 이산화탄소를 5% 배양합니다.
핀셋을 사용하여 24웰 플레이트에서 인서트를 들어 올려 배양 배지를 웰에 남겨 둡니다. 그런 다음 기저면이 위쪽을 향하도록 인서트를 뒤집습니다. 거꾸로 된 인서트를 페트리 접시에 놓습니다.
P200 피펫으로 재현탁된 인간 각질세포 세포 현탁액 20마이크로리터를 흡입합니다. 피펫 팁을 멤브레인 중앙을 향하게 하고 피펫 플런저를 천천히 눌러 멤브레인 위로 떨어지는 물방울을 형성합니다. 페트리 접시에 뚜껑을 덮습니다.
페트리 접시와 배지 함유 24웰 플레이트를 30분 동안 인큐베이터로 옮깁니다. 배양 후 24웰 플레이트와 페트리 접시를 생물 안전 캐비닛으로 가져옵니다. 핀셋을 사용하여 하나의 인서트를 선택하고 멤브레인의 정점 쪽이 위쪽을 향하고 기저 쪽이 아래쪽을 향하도록 뒤집습니다.
P200 피펫을 사용하여 인서트 내부에 200마이크로리터의 배양 배지를 추가합니다. 인서트를 24웰 플레이트의 미리 채워진 웰에 다시 놓습니다. 섭씨 37도에서 인서트를 배양하고 이산화탄소를 5% 배양합니다.
FN-실크 막에서 배양된 각질 세포는 표면을 고르게 덮었고 첫날에 조약돌 형태를 보여주었습니다. 각질세포는 3일째에 합류층(confluent layer)을 형성하여 상피 기능을 나타내고, 생리적 상피 기능을 가정하고 있음을 나타내는 긴밀한 연접 네트워크를 형성했습니다. 3일 후 FN-실크 멤브레인 전체에서 높은 세포 생존율이 관찰되었으며, 중심과 주변부 간의 생존력에는 큰 차이가 없었습니다.
FN-silk 멤브레인 시스템은 상용 PET 멤브레인 시스템과 유사하거나 더 나은 각질세포 생존력을 지원했습니다.
