이 연구는 RDW에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 경력 수상 (MCB - 0746066, 응급 행동을 규제 Transcriptional Activators의 특성)에 의해 가능하게되었다 우리는 LJ Shimkus, BS 골드만, G. Suen, M. 싱어, LG 웰치, KA 머피 및 원고에 도움이 토론 및 의견을 HG 테일러에게 감사하고 있습니다.

소모품이 필요 : <ul><li> Klett m </li><li> 피펫 및 팁 </li><li> 2.5 ML microcentrifuge 튜브 </li><li> Microcentrifuge </li><li> CTTYE 미디어 : <ul><li> 1.0 %의 Casitone (Difco 연구소), 0.5 % 효모 추출물 (Difco 연구소), </li><li> 10.0 MM 트리스 - HCL (산도 8.0), 1.0 MM KH 2 PO 4, 8.0 MM MgSO 4 </li></ul></li><li> TPM 미디어 : <ul><li> 10.0 MM 트리스 - HCL (산도 8.0), 1.0 MM KH 2 PO 4, 8.0 MM MgSO 4 </li></ul></li><li> 아가로 오스 </li><li> 물 목욕 55로 설정 ° C </li><li> 유리 현미경 슬라이드 </li><li> 대형 유리 coverslips </li><li> 2 X 2cm, 0.5 - mm 두께 실리콘 고무 개스킷 (그레이스 생물 연구소 주식 회사) </li><li> Parafilm (또는 라벨 테이프) </li><li> 집게 </li><li> 작은 바인더 클립 </li><li> 마이크로 샘플링 피펫 (피셔) </li><li> 100 μl 유리 일회용 팁 (피셔) </li><li> Kimwipes </li></ul> 1 부 : 셀 준비 멸균 환경을 생성하여 시작합니다. <ul><li> 깨끗한 작업 공간, 돈 장갑, 가벼운 버너. </li></ul><ol><li> CTTYE의 국물이 들어있는 플라스크에 inoculating과 활발한 소용돌이와 32 ° C에서 어둠 속에 incubated에 의해 세포의 야간 문화를 시작합니다. </li><li> 일단 문화 5 X 10 8 셀 / ML, 2.5 ML의 microcentrifuge 관에 피펫 1 ML 세포의 밀도에 도달했습니다. </li><li> 16,000 XG (또는 최대 속도) 2 분 원심 분리하여 세포 펠렛. </li><li> 가만히 따르다 및 뜨는 폐기. </li><li> 1 ML TPM (소금 균형, 영양 무료 미디어)와 세포 펠렛을 씻으십시오. <ul><li> 다시 정지와 소용돌이 </li></ul></li><li> 16,000 XG (또는 최대 속도) 2 분 회전하여 다시 펠릿 세포. </li><li> 가만히 따르다 및 뜨는 폐기. 임계 단계 </li><li> 완전히 pipetting과 vortexing의 조합을 사용하여 100 μl TPM 미디어에서 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 중요 :이 단계는 튜브에 남아있는 세포에 대한 대단히 짧은 시간이 없다는 것을 보장합니다. 이것은 시간이 걸릴 수 있습니다. </li><li> 추적 검정 접시를 준비하는 동안 실온에서 별도로 세포를 설정합니다. </li></ol> 2 부 : 아가르 준비 <ol><li> TPM (검정 미디어)와 CTTYE (영양 디스크) 미디어 모두 50 ML을 준비합니다. </li><li> 각 (아가로 오스는 한천 미만 diffractive)로 0.5 g 아가로 오스를 추가합니다. </li><li> 소독을 압력솥. </li><li> 살균 후 55에서 미디어를 유지 ° 인큐베이터에서 C (또는 물 목욕)의 추적 분석 플레이트 단지를 건설하는 동안. </li></ol> 3 부 : 영양 디스크 건설 <ol><li> 작은 우물을 형성, 불꽃 - 소독 유리 현미경 슬라이드 위에 멸균 0.5 - mm 두께 실리콘 고무 가스켓를 놓습니다. </li><li> 피펫 ~ 55 300 μl ° 아니라 슬라이드에있는 근육에 의해 만들어지고 영양 디스크를 포함하는으로 C CTTYE 미디어 / 아가로 오스. CTTYE 미디어 / 아가로 오스가 마운드해야합니다. </li><li> CTTYE 미디어 / 아가로 오스 위에 화염 소독 슬라이드 (NO 가스켓 포함) 놓습니다. 중요 :이 슬라이드에서 거품 형성을 방지하기 위해 각도로 아래로 설정해야합니다. </li><li> 슬라이드가 자리에되면, 미니 바인더 클립과 함께 복잡한 클램프 - 하나를 양쪽에. </li><li> 4 잘린 복잡한 플레이스 ° C 및 CTTYE 미디어 / 아가로 오스가 설정할 수 있습니다. 이것은 일반적으로 약 5 분 정도 소요됩니다. </li></ol> 4 부 : 추적 분석 준비 - 플레이트 단지를 설정 부품을 조립, 슬라이드 단지를 준비 영양 디스크를 장소, TPM 미디어 / 아가로 오스, 별도의 건조 판 단지, 접시 세포 및 분석 플레이트 단지를 추적 조립을 따라줘. 판 복잡한 구성 요소를 조립 <ol><li> 각각의 복잡한 경우, 불꽃이 유리 현미경 슬라이드를 살균 </li><li> 슬라이드 위에 autoclaved 가스켓을 놓고 (측면을 소독) 따로 설정할 수 있습니다. 이것은 분석의 바닥을 형성합니다. </li><li> 화염 유리 커버 슬립과 장소를 라벨 테이프 (또는 Parafilm)로 감싸 두 번째 유리 현미경 슬라이드 위에와 (측면을 소독) 따로 세트를 소독. 이것은 균열에서 coverslip을 유지하기 위해 지원하는 슬라이드로 사용됩니다. 이것은 분석의 상단을 형성합니다. </li><li> 화염 세 번째 유리 현미경 슬라이드를 소독하고 (측면을 소독) 따로 설정할 수 있습니다. 이것은 아가로 오스를 평평하게하는 데 사용됩니다. 중요 : 가스켓은 집게로 아래로 눌러 유리 인감 양식을 확인하십시오, 그렇지 않으면 미디어 / 아가로 오스 밖으로 건조 수 있습니다. </li></ol> 피<html> 영양 디스크 레이스 중요 : 10까지 5 단계는 한 번에 하나의 슬라이드 복합 수행되어야하며 그렇지 않으면 미디어 / 아가로 오스는 좋지 영화 품질 결과 응고 시작 수 있습니다. <ol start="5"><li> 영양 디스크 복잡한 형태를 제거 4 ° C (일부 3 ~ 5 단계)와 지금은 경화 CTTYE / 아가로 오스를 노출 슬라이드를 따로 캐내다. </li><li> 물론 100 μl 유리 일회용 팁과 마이크로 샘플링 피펫을 사용하여 위에서 설명한 CTTYE 미디어 / 아가로 오스에서 1mm 직경 &#39;영양 디스크&#39;를 제거하고 잘 커버 슬립 (위 3 단계)에있는 근육에 의해 만들어진에 배치 . </li></ol> 접시를 부어 임계 단계 <ol start="7"><li> 피펫 ~ 55 300 μl ° 잘 커버 슬립과 영양 디스크를 포함하는에있는 근육에 의해 만들어진로 C TPM 미디어 / 아가로 오스. TPM 미디어 / 아가로 오스가 마운드해야합니다. 임계 단계 </li><li> TPM 미디어 / 아가로 오스 위에없이 개스킷 (3 단계부터)과 함께 화염 소독을 슬라이드를 삽입합니다. 중요 :이 슬라이드에서 거품 형성을 방지하기 위해 각도로 아래로 설정해야합니다. </li><li> 슬라이드 (5 단계에서) 위치에되면, 미니 바인더 클립과 함께 복잡한 클램프 - 하나를 양쪽에. </li><li> 4 잘린 복잡한 플레이스 ° C와 미디어 / 아가로 오스가 설정할 수 있습니다. 이것은 일반적으로 약 5 분 정도 소요됩니다. </li></ol> 별도의 건조 접시 중요 : 밖으로 건조에서 미디어 / 아가로 오스를 방지하기 위해, 20을 통해 11은 한 번에 하나의 슬라이드 복잡한에서 수행되어야합니다 단계를 반복합니다. 중요 : 최상의 결과를 얻으려면 13을 통해 11 단계 4에서 수행되어야 ° C. <ol start="11"><li> 미디어 / 아가로 오스가 설정되면, 바인더 클립을 제거하고 테이프 싼 슬라이드를 풀어야하는 복잡의 끝을 쥐어 짜기. </li><li> 테이프 싼 슬라이드를 제거하고 더 사용하기 위해 벤치에 놓으십시오. 임계 단계 </li><li> 쐐기로 집게를 사용하여 지원 슬라이드 (NO 가스켓 포함)에서 커버 슬립 / 가스켓 / 미디어 / 아가로 오스 복잡한 분리 및 지원 슬라이드를 폐기하십시오. 중요 : 커버 슬립 / 개스킷 복잡한를 구분 캐고 움직임을 사용하지 마십시오. 이것은 커버 슬립 위반 및 / 또는 미디어 / 아가로 오스 지원 슬라이드를 지키는가 발생할 수 있습니다. </li><li> 테이프 싼 슬라이드 커버 슬립 / 가스켓 / 미디어 / 아가로 오스 복합 (가스켓 사이드까지)을 놓고 4 삭제 ° C. 모두 표시 습기가 새로 노출된 미디어 / 아가로 오스 표면에서 증발하도록 버너이 복잡한 옆의 플레이스 - 2 개 이상의 분. 중요 :이 너무 오래를위한 미디어 / 아가로 오스 건조를 못하게하면 M. 영향을 미칠 수 산투스 떼를 동작. </li></ol> 플레이트 세포 임계 단계 <ol><li> 일단 과잉 수분이 떨어져 영양소 디스크에서 미디어 / 아가로 오스 약 1mm에 집중 세포 (일부 1 ~ 8 단계)의 피펫 0.5 μl를 증발했다. 중요 : 그것은 세포가 곧장 그리고 똑바로 피펫을 이동하여 입금되었는지 확인하기 위해 매우 중요합니다. 이것은 무리가 순환 수 있도록합니다. 중요 : 미디어 / 아가로 오스에 피펫 팁을 터치하지 않는 매우 중요합니다. 이것은 표면에 우울증을 만들고 M.의 동작을 변경합니다 산투스 무리. 팁 : 미디어 / 아가로 오스에 접근하기 전에 피펫 팁을 조준해. 이것은 세포의 드롭은 피펫 팁의 하단에 표시하고 쉽게 세포를 입금 할 수 있습니다. </li><li> 세포가 침전되면, 버너에 대한 복잡한 옆에는 셀 자리가 건조 수 있도록 장소 - 아니 20 개 이상의 초. </li></ol> 분석을 조립 <ol><li> 셀 명소가 건조되면, 커버 슬립 / 가스켓 / 미디어 / 아가로 오스 / 전지 복합 (단계 13 일부터)에 가스켓과 함께 슬라이드 / 가스켓 복잡한 (1 단계) 정렬 부드럽게 도장을 형성하기 위해 함께 누르십시오. 임계 단계 </li><li> 슬라이드의 표면을 깨끗이하고 Parafilm로 남아있는 찌꺼기를 제거하는 Kimwipe와 전표를 커버. 완성된 분석은 그림 1과 유사합니다. </li><li> 32 ° C로 유지 열띤 무대에서 완성된 슬라이드 복잡한 플레이스 (슬라이드 아래, 슬립 커버) 결로 양식 형성을 방지하기 위해 (15 단계) 아래로 닦아 즉시. 결로가 생긴 경우, 이미지 수집 소프트웨어를 시작하기 전에 몇 초 동안 가열 무대에서 슬라이드 복잡한 앉아하자. </li><li> 적절한 목표를 (2X 4X 또는 10X)을 선택합니다. </li></ol> 제 5 부 : 영화 준비 t &quot;&gt; 임계 단계 <ol><li> 카메라와 현미경 켜고, 그리고 (빛이 너무 강렬하지 있는지 확인) 빛의 레벨을 확인하십시오. 컴퓨터를 시작하고 이미지 수집 프로그램을 엽니다. </li><li> 라이브 이미지 창을 클릭하고 현미경을 집중. 이미지는 그림 3에서 본 것과 유사하게 나타납니다. 유니폼 한천 표면을 확인합니다. </li><li> 이미지를 인수 시작합니다. 임계 단계 </li><li> 미디어 / 한천은 포커스가 표류하는 원인 해결하는 경향으로, 첫번째 시간 동안 정기적으로 초점을 확인합니다. </li><li> 작업 공간을 청소하십시오. </li><li> 이미지 수집이 완료되면 전송은 스토리지에 대한 이미지를 획득하여 야간 90 % 에탄올에 몸을 담글하여 슬라이드 복잡한을 파괴. </li><li> 재사용을 위해 압력솥 가스켓. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. TM 판 복합 만화 그림. (A) 분해도 및 크로스 섹션에서 기본 TM 플레이트 복잡한를 보여줍니다. (B) 큰 가스​​켓의 사용을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 현미경 클러스터. 각 현미경의 노드 (삽입된 페이지) 니콘 E400 현미경, 목표, 열띤 무대, 인사이트 카메라 및 노트북 컴퓨터로 구성되어 있습니다. 각 노드는 네트워크와 함께 마스터 컨트롤러 컴퓨터에 연결되어 있습니다. 노드의 두 가지가 EXFO 광원 두 Uniblitz 셔터로 구성되어 형​​광 기능을 설정할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 추적 분석 장치의 20X 이미지 번에 = 0. 스케일 바, 1mm. <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. TM 판 복합 적응력. M.의 (A) 100X 이미지 1.0 %의 한천에서 CTTYE에 산투스 글라이딩은 운동성. P.의 (B) 20X 이미지 녹농균이라는 박테리아는 운동성을 꿈틀. (C) 20X 이미지 S. marcescens는 운동성 진을 치고. 모두 (B)와 (C)은 1.0 %의 한천에서 LB에 assayed했다. M.의 (D) 40X 이미지 smegmatis은 0.5 % 한천의 LB에 운동성 슬라이딩. 이 이미지는 그림의 1B에서 본 대안 분석 구성을 사용 생포되었습니다. 비디오 1. 추적 분석의 대상이 무리의 시간 경과 비디오. M.의 비디오 2. 시간 경과 비디오 산투스 무리 어디 세포의 1 %는 찬란 표시됩니다. 교대 위상 콘트라스트와 형광 이미지 캡처와 무리 내에서 형광 세포의 위치를​​ 명료하게하다에 겹쳐 있었다. 이 동영상은 1.0 %의 한천에서 CTTYE에서 촬영된되었습니다. M.의 비디오 3. 시간 경과 비디오 산투스 글라이딩 운동성. 이 동영상은 1.0 %의 한천에서 CTTYE에서 촬영된되었습니다. 비디오 4. P.의 시간 경과 비디오 녹농균이라는 박테리아는 운동성을 꿈틀. 이 동영상은 1.0 %의 한천에서 LB에서 촬영된되었습니다. 비디오 5. S.의 시간 경과 비디오 marcescens는 운동성 진을 치고. 이 동영상은 1.0 %의 한천에서 LB에서 촬영된되었습니다. 비디오 6. M.의 시간 경과 비디오 smegmatis는 운동성 슬라이딩. 이 동영상은 그림의 1B에서 본 대안 분석 구성을 사용 0.5 % 한천의 LB에서 촬영된되었습니다.

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	<li>Taylor, R. G., Welch, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+as+an+emergent+property+of+a+swarm.">Chemotaxis as an emergent property of a swarm.</a> J Bacteriol. 190, 6811-6816 (2008).</li><li>Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D., Shimkets, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Organization+of+Myxococcus+xanthus+During+Fruiting+Body+Formation.">Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation.</a> J Bacteriol. 189, 9126-9130 (2007).</li><li>Mignot, T., Merlie, J. P., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+pole-to-pole+oscillations+of+a+bacterial+gliding+motility+protein.">Regulated pole-to-pole oscillations of a bacterial gliding motility protein.</a> Science. 310, 855-857 (2005).</li><li>Stoodley, P., Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachment+surface+migration,+and+other+dynamic+behavior+in+bacterial+biofilms+revealed+by+digital+time-lapse+imaging.">Detachment surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging.</a> Methods Enzymol. 337, 306-319 (2001).</li><li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+as+microbial+development.">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu Rev Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li><li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+and+twitching+motility+are+necessary+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).</li><li>Dalton, H. M., Poulsen, L. K., Halasz, P., Angles, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substratum-induced+morphological+changes+in+a+marine+bacterium+and+their+relevance+to+biofilm+structure.">Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure.</a> J Bacteriol. 176, 6900-6906 (1994).</li><li>Dworkin, M., Eide, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxococcus+xanthus+does+not+respond+chemotactically+to+moderate+concentration+gradients.">Myxococcus xanthus does not respond chemotactically to moderate concentration gradients.</a> J Bacteriol. 154, 437-442 (1983).</li><li>Dworkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactic+behavior+of+Myxococcus+xanthus.">Tactic behavior of Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 154, 452-459 (1983).</li><li>Wu, S. S., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+expression+of+the+pilA+gene+in+Myxococcus+xanthus.">Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).</li><li>Bustamante, V. H., Mart&#237;nez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Frz+signal+transduction+system+of+Myxococcus+xanthus+shows+the+importance+of+the+conserved+C-terminal+region+of+the+cytoplasmic+chemoreceptor+FrzCD+in+sensing+signals.">Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals.</a> Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

시간 저속 microcinematography (TM)는 prokaryotic 운동성 2-7를 공부하기 위해 표준 접근되고 있습니다. 전통적으로, TM은 기판 8-11과 같은 필터를 종이로 빅스, 얇은 한천 패드, 또는 한천 슬라브를 사용하여 수행됩니다. 세균성 운동의 일반적인 삽화에 대한 이미지 시퀀스를 생성하는 데 사용하면 이러한 방법은 효과가 적절하고 비용이 있습니다. 그러나, 이미지 시퀀스 재현성 및 양적 엄?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1.0% Casitone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5% yeast extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-sampling pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 &mu;l glass disposable tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grace Bio-Lab Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

recording multicellular behavior in myxococcus xanthus biofilms using time-lapse microcinematography

δ - proteobacterium Myxococcus 산투스의 메뚜기는 환경 단서에 대한 응답으로 복잡하고 역동적인 패턴을 만드는 일련의 신호를 통해 ​​집단, 운동 조정 역할을 수백만의 세포가 포함되어 있습니다. 이러한 패턴은 자기 조직 및 응급되며 이들은 각각의 세포의 동작을 관찰하여 예측할 수 없습니다. 시간 저속 microcinematography 추적 분석을 사용하여, 우리는 M.의 독특한 응급 패턴을 식별 산투스는 소스 한 방향으로 영양 구배까지 메뚜기 떼의 지시 운동으로 정의, chemotaxis를했다. 효율적으로 시간 저속 microcinematography 통해 chemotaxis를 특성화하기 위해, 우리는 매우 수정할 플레이트 복합 개발 (그림 1) 8 현미경 (그림 2), 캡처 시간 경과 비디오의 각 능력의 클러스터를 구축. 분석은 데이터의 일관성 같지는 복제를 허용하는 정도로 엄격하고, 그 결과 동영상은 우리가 메뚜기 동작에 미묘한 변화를 관찰하고 추적할 수 있습니다. 일단 캡처, 동영상은 동영상의 수천을 처리하고 저장하기 위해 충분한 메모리와 분석 / 저장 장치 컴퓨터로 전송됩니다. 이 설정의 유연성이 입증되었습니다 M. 여러 회원에게 유용합니다 산투스 커뮤니티입니다.

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Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

공부하기<em&gt; Myxococcus 산투스</em&gt; 무리의 행동, 우리는 다른 assays를 위해 수정할 수있는 시간 저속 microcinematography 프로토콜을 설계했습니다. 그것은 현미경에 맞게 표준 성장 조건을 고용하고, 저렴, 재사용 가능한 실리콘 가스켓을 사용하여 재현성 결과를 산출. 우리는 다세포 chemotaxis를 정할이 방법을 사용했습니다.

에서 다세포 행동을 기록 Myxococcus 산투스</em시간 저속 Microcinematography를 사용하여> Biofilms

A swarm of the &delta;-proteobacterium Myxococcus xanthus contains millions of cells that act as a collective, coordinating movement through a series of ...

recording-multicellular-behavior-myxococcus-xanthus-biofilms-using

Research

JoVE Journal

Biology

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

12.2K 조회수.  University of South Carolina (USC). 공부하기 Myxococcus 산투스 무리의 행동, 우리는 다른 assays를 위해 수정할 수있는 시간 저속 microcinematography 프로토콜을 설계했습니다. 그것은 현미경에 맞게 표준 성장 조건을 고용하고, 저렴, 재사용 가능한 실리콘 가스켓을 사용하여 재현성 결과를 산출. 우리는 다세포 chemotaxis를 정할이 방법을 사용했습니다.

비디오: Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

시간 경과 현미경과 분해 굴지 모니터링

연구

생물학

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

에 산소 결핍 유도 일시 중지 된 애니메이션을 시각화하기 위해 시간 경과에 현미경을 사용<em&gt; C. elegans</em&gt; 태아

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

신진 효모의 형광 시간 경과 영화를 획득 및 이식을 사용하여 단일 세포 역학 분석

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

sox10의 두개 안면 개발의 시각화 : 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬의 선은 시간 경과 공 초점 현미경을 사용하여

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

에서 다세포 행동을 기록 Myxococcus 산투스 Biofilms