이 프로토콜을 통해 두개골 면안면 분야의 조사관은 태아 선반 고도 동안 중간엽 리모델링을 이해하기 위한 수단으로 제어 및 돌연변이 세포의 집단 운동 특성을 정량적으로 비교할 수 있습니다. 1 차마우스 배아 성 구형 중간엽 세포 및 시간 경과 화상 진찰의 사용은 성구 선반 고도 역학을 평가하기위한 접근 가능한 프록시 방법을 제공합니다. 마우스 배아에서 사발 껍질을 수확하려면 멸균 천공 숟가락을 사용하여 배아 일 13.5 배아를 스테레오 현미경으로 멸균 MEPM 배양 배지로 채워진 멸균 10 센티미터 접시에 넣습니다.
참수 후, 살균 된 미세 한 No.5 의 한 쪽 끝을 뺨 안쪽에 입에 넣고 두개골 뒤쪽을 나갈 때까지 집게 끝을 밀어 넣습니다. 다른 팔이 외이도 바로 위에 마우스를 가져가도록 집게를 방향을 조정한 후 집게를 꼬집어 조직을 잘라냅니다. 머리 의 반대편에 절개를 반복, 아래턱까지 핀치 컷 절차를 계속, 혀, 두개골의 열등한 부분이 제거 될 때까지, 구체 선반을 노출.
머리를 옆으로 놓고, 작은, 멸균, 스테인레스 스틸 가위 한 쌍의 팁을 태아의 눈 수준에 대한 두개골 앞과 뒤에 배치하고 두개골의 두개골을 제거하기 위해 눈 바로 위에 잘라, 평평한 표면을 만듭니다. 다음으로, 접시 의 바닥에 평평하게 놓여있는 우수한 측면으로 머리를 거꾸로 놓고 머리의 앞쪽 절반에 있는 중앙 홈의 양쪽에 두 개의 제기 된 다리로 볼 수있는 팔성 선반을 찾습니다. 머리에 머리를 접시에 고정하려면 머리 앞쪽의 비강 부위 근처의 조직을 통해 미세 한 집게의 한 쪽 끝을 성골 선반에 삽입하고 다른 한쪽은 두개골 후방의 베이스를 통해 성술 선반에 삽입합니다.
선반의 측면 표면의 기지에서 조직에 매우 날카롭고 미세한 집게의 두 번째 쌍의 두 점을 삽입하고 천천히 조심스럽게 꼬집어 조직을 잘라냅니다. 선반의 내측 표면 의 기저와 선반의 전방 및 후방 끝에서 선반을 머리에 부착한 다음 부드럽게 선반을 들어 올려 주변 조직에서 껍질을 완전히 풀어주도록 필요에 따라 추가 핀치를 만듭니다. 두 번째 성술 선반이 동일한 방식으로 제거되면 멸균 플라스틱 전구 이송 파이펫을 사용하여 선반을 얼음에 약 500 마이크로 리터의 멸균 1.5 밀리리터 미세 센트심분리기 튜브로 옮깁니다.
MEPM 세포 배양을 설정하려면 모든 선반이 수집되었을 때 조직을 방해하지 않고 PBS를 흡입하고 즉시 성구 선반 조직의 각 튜브에 섭씨 0.25 %의 37도 의 200 마이크로 리터를 추가합니다. 1, 000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 조직을 몇 번 피펫하고 5분 후에 잠시 파이펫을 피우며 37도에서 10분 동안 조직을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 각 튜브에 MEPM 배양 배지의 800 마이크로리터를 추가하고 세포를 수집하기 위해 튜브를 원심분리하기 전에 조직을 다시 피펫.
상체를 심은 후, 튜브 당 신선한 MEPM 배양 배지의 1 밀리리터에 펠릿을 회수하고, 우물 당 2 밀리리터를 포함하는 6 웰 조직 배양 처리 플레이트의 개별 우물에 세포를 플레이트, 다음 세포가 살균 세포 배양에서 12 시간 동안 플라스틱 표면에 부착 할 수 있도록. 2D 집단 이동 분석기를 설정하려면, 각 시료에 대해 약 1밀리미터의 높이로 멸균 2웰 실리콘 인서트의 상단을 제거하고 멸균 집게를 사용하여 6웰 플레이트의 개별 우물의 중앙에 멸균 2웰 인서트를 플레이트에 플레이트한다. 모든 가장자리를 따라 누릅니다.
상처 수리 분석서를 설정하려면 멸균 집게를 사용하여 수정되지 않은 멸균 2웰 실리콘 인서트를 샘플 당 6웰 플레이트의 중앙에 배치하고 인서트 가장자리를 단단히 눌러 배양 판에 삽입을 부착하십시오. 그런 다음 각 삽입배지내의 100마이크로리터에서 평방 밀리미터당 1, 400세포를 종자1, 400세포로 배양하고 세포 배양 배지에서 48시간 동안 세포를 배양한다. 2D 집단 이동 분석서를 수행할 때, 큰 배양 접시에 있는 2웰 실리콘 인서트에 세포를 파종하는 것은 일반적으로 화상 진찰을 위한 더 나은 세포 밀도를 제공합니다.
35mm 접시에 놓인 작은 3D 프린팅 링은 2D 운동성 분석에도 사용할 수 있습니다. 상처 수리 해석의 경우, 세포는 높은 합류까지 두 웰 실리콘 인서트에서 재배됩니다. 그런 다음 삽입을 제거하고 상처가 닫을 때까지 이미지화됩니다.
MEPM 궤적은 지속적이고 세포 운동성의 방향은 몇 시간 동안 유지됩니다. 평균 변위 대 시간 분석은 변위 형태의 지속성이 경과된 시간에 비례한다는 것을 나타냅니다. 운동성 데이터의 유동 분석은 공동 움직이는 MEPM 세포 클러스터가 약 300미크론 크기임을 보여준다.
야생 유형과 돌연변이 MEPM 세포 사이의 심오한 운동성 차이도 관찰됩니다. 이 절차는 각종 형질전환 마우스 라인에 이용되고 세포 운동에 그들의 효력을 공부하기 위하여 각종 생화확적인 시약으로 MEPM 세포를 취급하기 위하여 이용될 수 있었습니다. 우리는 1 차적인 성구 mesenchyme 세포에 집중했습니다, 그러나 시간 경과 화상 진찰 및 정량 분석은 또한 동적 발달 프로세스에 있는 어떤 motile 세포 모형의 이주 속성을 탐구하기 위하여 이용될 수 있습니다.
