이 검토는 건강 보조금 국립 연구소, AI074420 - 02, 버로우즈 웰컴의 탐정 수상, BKC에 Hirschl 경력 과학자 수상에 의해 및 Biophotonics 과학 기술에 대한 NSF 센터, 협동 계약 PHY012099, 그리고 TH에 UCD 보건 시스템 연구 수상에 의해 지원되었다 UCD CTSC NCRR ULRR024146.

이 방법에 보고된 연구에 사용된 <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">허브너 외 과학 323 :. 1743년에서 1747년까지 (2009)가</a> . 1. 개요 HIV의 휴대 전화의 전파는 원래 기증자 세포 및 기본 CD4 + 세포 수용체 1,2,3으로 T lymphocytes으로 HIV 감염 Jurkat 세포를 사용하여 설명했다. 이러한 연구에서 바이러스 항체 염색법을 사용하여 고정 세포에서 발견되었다. 라이브 세포에서 세포로 세포에서 바이러스의 전송을 추적하기 위해, 우리는 HIV 개그 - iGFP 4 불리는 HIV의 재조합, 전염성 분자 클론을 이용. 그것은 MA와 CA 도메인 사이의 개그 단백질에 내부 삽입 녹색 형광 단백질 (GFP)을 수행합니다. HIV의 분자 복제는 도우미 바이러스에 대한 필요없이 감염을 유지합니다. 이 클론으로 만든 바이러스 입자는 세포 사이 stoichiometrically 바이러스 조립 및 전송을 모니터 강한 형광 신호를 제공하는 녹색 형광 단백질과 함께로드됩니다. 와 함께 사용하면 불활성 셀 추적 형광 염료를받는 세포가 입력 기증자 세포에서 차별, 그리고 하나는 감염된 T 세포에서 감염되지 않은 T 세포 5 HIV의 전송을 시각화 수 있습니다. 그들은 밀봉, 가스 투과 이미징 챔버에서 양식하는 동안 Virological 버렸네 형성 한 세포에서 다른 바이러스의 전송은 다음 살아있는 세포에서 볼 수 있습니다. (1 일) 2. HIV 개그 - iGFP의 준비 Jurkat T 세포를 Transfected <ol><li> 주의 2 X 10 5, 8 X 10 5 셀 / Jurkat 문화 미디어 (RPMI 1640 10 % 태아 소 혈청에서 ML 사이의 농도에서 세포를 유지하여 인간의 CD4 + T 세포 라인 Jurkat (ATCC, 머내서스, VA)을 준비, 100 단위 / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신). 성공에 열쇠 : 8 X 10 5 세포 / ML을 초과하는 농도의 Jurkat 세포의 문화 transfection 효율의 감소가 발생합니다. 참고 : 아래 설명 HIV 개그 - iGFP proviral DNA T 세포로, 복제 - 유능한 인간 면역 결핍 바이러스의 생산에 결과의 transfection. 따라서, 모든 절차는 인증 biosafety 레벨 2 + 또는 biosafety 레벨 3 (BL2 + / BL3) 조직 문화 룸에서만 교육 연구소 요원에 의해 실시되어야하는 것입니다. 영상 시설 전염성 HIV와 함께이 지역 기관 biosafety 사무소의 승인을 받아야합니다. </li><li> Amaxa의 nucleofection 방식 (Lonza, 워커스빌, MD)를 사용하여 바이러스 플라스미드, HIV의 개그 - iGFP로 Jurkats을 Transfect. 150 10 분 원심 분리하여 펠렛 5 X 10 6 세포 X G. 뜨는을 기음과 멸균 인산의 세포를 세차 호수 (PBS)를 버퍼. 세포를 원심과 제조 업체의 보충을 포함하는 미리 예열, nucleofector 솔루션 V 97 μL로 펠렛을 resuspend. 세포 현탁액에 플라스미드 내독소 무료 HIV 개그 - iGFP (1 μg / μL)의 세 μL를 추가하고 부드럽게 섞는다. 프로그램 S - 18을 사용하여 쿠베트과 nucleofect에 세포 현탁액을 전송합니다. 즉시 항생제없이 prewarmed Jurkat 문화 미디어 3 ML에 세포를 전송합니다. </li><li> virological 시냅스에 대한 CD4 + 대상 세포를 준비하려면, 우리는 표준 Ficoll - Paque (GE 헬스케어, 웁살라, 스웨덴) 프로토콜을 사용하여 버피 외투에서 인간의 말초 혈액 mononuclear 세포를 구하십시오. CD4 + T 세포는 다음 부정적인 자기 비드 절연 키트 (Miltenyi Biotec, 오번, CA)를 사용 선택됩니다. 이들은 저온 동결 미디어 5 X 10 6 cells/500 μL (90% 태아 소 serum/10 % DMSO)의 aliquots에서 액체 N2에 저장되어있을 수 있습니다. 해동 기본 CD4 + T 세포 10 대 / IL - 2의 ML과 보충 RPMI 10% FBS에 양식 있습니다. </li></ol> (주 2) 3. HIV 개그 - iGFP와 형광 염료와 대상 세포의 스테 이닝과 Transfected Jurkats에서 생방송으로 세포의 복구 <ol><li> Jurkat 세포는 밤새 transfection에서 복구할 수 있습니다. 그런 다음 ficoll의 hypaque 밀도 기울기 원심 분리를 통해 물질에 의해 세포 파편을 제거합니다. 15 ML 원뿔 튜브의 바닥에 Ficoll - Paque 1.5 ML 하는걸. 부드럽게 RPMI의 5 ML 볼륨에서 transfected Jurkats이 그라데이션 자료를 오버레이. 브레이크 해제와 함께 실온에서 20 분 400 XG에서 세포를 원심 분리기. 조심스럽게 피펫을 사용하여 미디어 / Ficoll 인터페이스에서 세포를 제거합니다. 새로운 15 ML 원뿔 관에게 전송합니다. 10 분 300 XG 15 ML 및 원심 분리기의 총 볼륨 RMPI로 세포를 희석. 잘 2cm (6 잘 플레이트)의 Jurkat 문화 미디어 3 ML에서 펠렛을 Resuspend과 조직 문화 인큐베이터로 세포를 반환합니다. </li><li> 셀 - 셀 전송 실험에서 기증자 세포에서 대상 세포를 구분하기 위해 우리는 CD4를 prelabel + 형광 염료와 대상 세포를. 기본 CD4 + T 세포가도 표시 아르사용하기 전에 주입. 우리는 CellTracker 및 CellTrace의 염료 (Invitrogen, 칼스 배드, CA) 모두 훌륭한 성공 라벨 T 세포를 있었다. 염료 농도 및 배양 시간이 특정 염료 및 사용 세포 종류에 따라 최적화되어야합니다 있지만, 대표적인 프로토콜은 다음과 같습니다. 펠렛 4 X 10 6 주 CD4 + 10 분 400 XG의 회전에 의해 T 세포. PBS 2 ML의 PBS와 resuspend 5 ML있는 세포를 씻으십시오. 1.5 μm의의 최종 농도 CellTracker 오렌지 (CMTMR, Invitrogen, 칼스 배드, CA) 추가 37 20 분 ° C 품어. 전체 Jurkat 미디어 8 ML을 추가하고 10 분 400 XG에 원심 분리기. 10 대 / IL - 2의 ML과 하룻밤 조직 문화 인큐베이터의 장소 보충 전체 미디어 중 3 ML에있는 세포를 Resuspend. </li></ol> (3 일) 4. 라이브 셀 이미징을 사용하여 HIV의 모니터링 휴대 전화 전송 재갈 - iGFP 우리는 일상적으로 HIV 개그 - iGFP transfected Jurkat 세포 48 시간 이후 transfection을 사용합니다. 그러나, 우리는 성공적으로 24시간 빠르면 세포를 사용하여 있고, 72시간 이후 transfection처럼 늦었어요. <ol><li> 약 48 시간 후 transfection, HIV 개그 - iGFP 표현 Jurkats는 CO와 씻은, 계산됩니다 2 독립 미디어 (Invitrogen, 칼스 배드, CA), 그리고 라이브 셀 이미징 미디어 (CO 2 독립 미디어 10 % 태아 소 혈청에서 resuspended 1-3 X 10 7 세포 / ML의 농도 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 10 단위 / ML IL - 2). </li><li> 비슷한 방식으로, 씻고 1-3 X 10 7 셀 / 라이브 셀 이미징 미디어 ML의 농도에 표시된 기본 CD4 + T 세포를 resuspend. </li><li> 기본 CD4 + 대우 조직 문화, 가스 투과, microchamber (Ibidi, 베로나, WI)에 1시 2분 또는 1시 3분 비율 및 부하에서 T 세포와 혼합 HIV는 개그 - iGFP - transfected Jurkats. 예를 들어, 레이블 주 CD4 + T 세포의 40 μL와 HIV 개그 - iGFP transfected Jurkats 20 μL를 섞는다. Ibidi 챔버에이 혼합물의 50 μL를로드하고 플러그와 챔버를 밀봉. parafilm와 플러그 / Ibidi 챔버 인터페이스를 배치하여 플러그를 고정합니다. </li></ol> 5. 현미경 플랫폼을위한 고려 사항 : 스피닝 디스크 공촛점 이미징 전지 Ibidi 이미징 챔버를 로딩 후에, 우리는 즉시 거꾸로 광학 현미경 (iX71 올림푸스, 센터 밸리, PA)에 장치를 탑재합니다. Ibidi 챔버는 적절한 안전 의상을 입고 BL2 + - 교육 실험실 요원에 의해 현미경을 전송해야합니다. 라이브 셀 이미징은 일반적으로 안정적인 37 ° C 환경을 유지하기 위해 고가의 배양 챔버 스를 사용하지만, 이것은 T - 타입 열전대 팁과 함께 간단하고 경제적인 온도 조절 히터를 (ASI 400 Nevtek, 윌리엄스빌, VA)를 사용하여 달성되었습니다 옆에 장착 적정 온도 피드백을위한 샘플. 우리는 2 - 독립 미디어가 CO 2 챔버의 사용을 피하고있는 동안 우리는 높은 세포 생존을 유지할 수있는 CO를 사용하여 찾을 수 있습니다. 방안에 온도 변화에 대한 플랫폼을 버퍼하고 배경 객실 조명을 차단하기 위해 큰 검은 장막이 시스템 주위에 절연 공기 주머니를 만들어 온 현미경 / 히터 설정을 통해 draped 있습니다. 이것은 크게 온도 변화와 관련 온도 관련 샘플 드리프트를 감소하지만, 사전에 샘플을 설치하기 위해 30 분 미리 가열이 필요합니다. 6. 데이터 수집, 전송 및 이미지 프로세싱 이미지는 높은 수치 조리개 (NA) 크게 해상도를 향상과 같은 60x 1.42 NA 오일 침지 목표 (UPlanApo N, 올림푸스)를 사용 찍은 있습니다. 3D 공촛점 이미지를 만들려면, 검사가 동시에 극적으로 검색 속도를 높일 수&gt; 800 공촛점 장소를 사용하는 회전 디스크 공촛점 장치 (CSU - 10, Yokagawa, 일본)에 의해 수행됩니다. 의 속도, CSU - 10 photobleaching과 phototoxicity 모두 감소 빠르고, 낮은 조명 이미징 수 있도록 매우 민감한 전자 - 곱한 충전 - 결합 장치 (EMCCD, iXon + 897, Andor 기술, 아일랜드) 카메라에 대응됩니다. 경의를 표할 형광 광원이 선정하는 원하는 파장 (488 nm의)과 레이저의 파워는 바로 현미경 목표 (&lt;1 MW)하기 전에 측정 멀티 파장 ArKr 이온 가스 레이저 (이노바 70C, 일관된, 산타 클라라)입니다 음향 광학 조정할 수있는 필터 (AOTF), (Andor 기술). 추가 photobleaching 절감 및 총 이미징 시간을 연장하기 위해 빠르게 AOTF은 (마이크로초) 레이저 빔을에게 새로 취득한 이미지가 CCD (15-30 MS 노출)에서 제공하는 동안 카메라 (10-20 MS) 비활성 때마다을 껐다 컴퓨터에. 레이저 빛은 405/488/568/647 쿼드 밴드 이색성 거울 (Semrock, 로체스터, NY)를 사용하여 회전 디스크 시스템에 결합됩니다. 형광 방출이 필터 휠 (Ludl 전자 제품, 호손, NY) 안에 50분의 525 대역 통과 필터 (Semrock)를 사용하여 필터링 장착 BEMCCD 카메라와 공촛점 회전 디스크 장치를 etween. Z - 스테이지 (매드시 연구소, 매디슨, WI)을 포함한 모든 하드웨어 및 인수는, Andor IQ v1.8 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 1.2-1.9 주위에 초 3D 이미지 스택에서 인수의 속도를 극대화하기 위해, 우리는 아래로 휴대 쌍의의 즉시 지역에 EMCCD의 카메라의 녹화 영역을 자르기. 또한, Z의 일부 정보의 비용으로, 0.45-0.75 μm의 사이에 큰 Z - 단계는 획득 속도를하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 조건 하에서 영상은 6 시간까지 지속 - 지속적인 20-60 분의 세그먼트를 사용하여 - 최소한의 photobleaching과 함께. 모두 각 데이터 세그먼트는 일반적으로 이미지의 수만을 가져옵니다 같은 공간의 5-20 GB를 가득 메우고 있습니다. 대용량 데이터 파일의 전송 및 분석을 촉진하기 위해 각 인수 세트 세분화하고 Andor IQ v1.8 소프트웨어를 사용하여 1 GB TIFF 이미지 파일을 세그먼트로 내보낼 수 있어야합니다. 여기에서 많은 우수한 소프트웨어 패키지는 Metamorph, Volocity 및 ImageJ (우리는 변화 피지를 권장합니다)와 같은 이미지 분석을 위해 사용할 수 있습니다. 이 형광 마커가 추적해야하는 경우, 우리는 동시에 사용하여 인수를 늦추고없이 모두 기록 &quot;분할 화면 모드를.&quot; 두 마커는 한 번에 두 개의 서로 다른 ArKr 레이저 라인 (보통 488와 568 nm의)에 의해 기쁘게 생각합니다. EMCCD 카메라가 두 개의 다른 이미지를 분리 이미지 스플리터 (OptoSplit II, 케언, 켄트, 영국)되기 전에 직접 삽입. 각각의 이미지가 독립적으로 한 번 &#39;분할 화면&#39;효과를 만드는 카메라에 형광 필터 (Semrock)와 예상되는 side - by - side를 사용하여 필터링됩니다. 이것은 다음 수동 자르기 이상의 이미지 프로세싱에서 이미지의 정렬을 필요로합니다. 7. 이미지 처리 및 데이터 분석을위한 고려 사항 우리는 일반적으로 매킨토시 컴퓨터에 Volocity (PerkinElmer, 월섬, MA) (애플, 병원)과 이미지 분석을 수행합니다. 스피닝 디스크 레이저 공촛점 현미경 이미지는 처음엔 Volocity와 deconvolved, photobleaching에 대해 올바른 자신의 강도 조정됩니다. 개그 puncta의 강도 측정 및 추적은 Volocity의 부량 모듈로 수행됩니다. 미리 구성된 버렸네에 상대적인 움직임이 계산해야 할 이미지 집합에 대한, 자동 추적 알고리즘은 전체 시퀀스에 걸쳐 신경 버튼을 추적하는 고용이다. autotracking 소프트웨어에 의해 정의된 관심 영역의 수동 검사는 소프트웨어가 올바르게 원하는 객체를 추적 것을 확인하기 위해 수행되어야합니다. 주변 물체와 대비가 너무 약한 객체에 대한 수동 추적 프레임으로 프레임 단위로 수행할 수 있습니다. Volocity 소프트웨어 패키지는 원하는 개체 내에서 XYZ 위치, 볼륨 및 통합 신호의 수출을 허용합니다. 추적할 개체의 버렸네과 속도에서 거리는 시냅스 단추의 중심에 움직임을 정규화하여 계산됩니다. 8. 대표 결과 혼합의 10 ~ 15 분 내에 하나는 기본 CD4을 준수하는 HIV 개그 - iGFP 표현 Jurkat 세포 + T 세포를 시각화 할 수 있어야합니다. 이미징 이러한 conjugates는 하나는 감염된 세포뿐 아니라 synaspe 후 대상 세포의 개그 puncta의 움직임을 평가할 수 있습니다. 시냅스가 형성되면 하나는 곧 대상 세포에 개그 - iGFP의 puncta의 움직임을 관찰 수 있습니다.

<ol>
	<li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells.">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li><li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes.">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li><li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced,+actin-dependent+synapse.">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li><li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent,+fluorescently+tagged+HIV-1.">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li><li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses.">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 여기서 세포 세포에서 HIV의 전송을 시각화를위한 간단한 방법을 설명합니다. 저희 연구실과 다른 &#39;에서 최근 연구는이 T 세포 사이에 확산 HIV의 주된 모드있을 것입니다. 방법은 여기에 설명된 HIV의 재조합 형태를 채용, 핵심 구조 단백질, 개그의 유전자 인코딩 녹색 형광 단백질 태그를 실시 개그 - iGFP, HIV를했다. 때문에 각각의 바이러스 입자의 생산 GFP의 높은 수준, HIV의 복제 - 유능한 복제가 실시간으로 각각의 바이러스 입자를 추적하기 위해 연구자 수 있습니다. 이 바이러스는 HIV의 조립 및 셀 셀 전송에 관한 연구에 특히 유용합니다. 셀 - 셀 전송에 의해 HIV의 전송이 매우 효율적입니다. 3 시간 동안 공동의 문화, 우리가 일상이 유동세포계측법에 의해 평가와 같은 바이러스가 기본 T 세포의 20-30%로 전송을 참조하십시오. 비슷한 효율성은 질적 라이브 셀 이미징 동안 볼 수 있습니다. Virally 감염된 T 세포가 거의 즉시 공동 문화의 개시 이후에 감염되지 않은 기본 T 세포와 시냅스 형성을 시작합니다. 흥미, 모든 기본 T 세포가 레이저 핀셋 (게시되지 않은 관찰, GM)와 강제로 상호 작용에도 불구하고 HIV에 감염된 Jurkat 세포와 상호 작용이 가능합니다. HIV 개그 - iGFP은 의심의 여지없이 체외 및 생체내 세포 모두에서 세포 전송에 가장 민감한 T 세포 하위 집합을 결정하는 데 유용합니다.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Jurkat T Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leukocyte buffy coats from whole blood</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New York Blood Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nucleofector System and Solution V</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EndoFree Maxi Prep Kits</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HIV Gag-iGFP plasmid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chen Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ficoll-Paque</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Celltracker/CellTrace Dyes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CO2-Independent Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ibidi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Olympus IX-71 Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlanApo N 1.42NA 60X oil objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C ArKr ion gas laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yokogawa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>525/50 bandpass filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Andor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ASI 400 Thermostatic Heater</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nevtek</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualizing cell-to-cell transfer of hiv using fluorescent clones of hiv and live confocal microscopy

융합 자신이 좋아하는 단백질에 녹색 형광 단백질로, 생물학 자 이제 형광 영상 현미경을 사용하여 복잡한 세포 프로세스를 살아있는 공부를하는 기능이 있습니다. 인간 면역 결핍 바이러스의 휴대 전화 전송하는 동안 인간 면역 결핍 바이러스 핵심 단백질의 움직임을 추적하려면, 우리는 HIV의 감염 분자 복제의 컨텍스트에서 개그 단백질, HIV 개그 - iGFP라는 GFP가 - 태그있다. 우리는 비디오 공촛점 현미경을 사용하여이 바이러스 복제를 공부합니다. 다음과 같은 시각 실험에서, 우리는 HIV 개그 - iGFP와 인간의 T 세포 라인을 transfect, 우리는 찬란 분류 감염되지 않은 CD4 + T 세포 바이러스에 대한 대상 세포 역할을 사용합니다. 우리가 쉽게 세포 구조를 통해 바이러스 생산과 운송에 따라 서로 다른 형광 라벨을 사용하면 virological 시냅스라고. 단순 가스 투과 이미징 챔버 스는 우리가 일 분 라이브 공촛점 현미경과 시냅스를 관찰할 수 있습니다. 이러한 방법들은 하나의 세포에서 다음에 이동 바이러스성 단백질을 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

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Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

이 시각 실험 라이브 공촛점 이미징 실험에 대한 HIV의 형광 분자 클론을 활용을위한 가이드입니다.

HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

visualizing-cell-to-cell-transfer-hiv-using-fluorescent-clones-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.3K 조회수.  Mount Sinai School of Medicine. 이 시각 실험 라이브 공촛점 이미징 실험에 대한 HIV의 형광 분자 클론을 활용을위한 가이드입니다.

비디오: Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, the LTR is also responsive to cellular activation states and to the local chromatin activity where the integration has occurred. This can result in high HIV-independent activity, and has restricted the usefulness of LTR-based reporter to mark HIV positive cells 1,2,3. Here, we constructed an expression lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, numerous HIV DNA sequences that include the Rev-response element and HIV splicing sites 4,5,6. The vector was incorporated into a lentiviral reporter virus, permitting highly specific detection of replicating HIV in living cell populations. The activity of the vector was measured by expression of the green fluorescence protein (GFP). The application of this vector as reported here offers a novel alternative approach to existing methods, such as in situ PCR or HIV antigen staining, to identify HIV-positive cells. The vector can also express therapeutic genes for basic or clinical experimentation to target HIV-positive cells.

We have developed a lentiviral vector that possesses, in addition to the Tat-responsive LTR, the Rev-response element (RRE) that can regulate reporter gene expression in an HIV-1 Tat- and Rev-dependent fashion. The vector permits the specific detection of replicating HIV in living cells via the expression of GFP.

그린 형광 단백질을 표현 레브 종속 Lentiviral 벡터를 사용하여 HIV - 1 양성 세포의 특정 마킹

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

연구

면역학 및 감염병학

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) <a href="http://www.usaid.gov">(www.usaid.gov)</a>. The virus infects and destroys CD4+ T-cells thereby crippling the immune system, and causing an acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) 2. Infection begins when the HIV Envelope glycoprotein "spike" makes contact with the CD4 receptor on the surface of the CD4+ T-cell. This interaction induces a conformational change in the spike, which promotes interaction with a second cell surface co-receptor 5,9. The significance of these protein interactions in the HIV infection pathway makes them of profound importance in fundamental HIV research, and in the pursuit of an HIV vaccine.
The need to better understand the molecular-scale interactions of HIV cell contact and neutralization motivated the development of a technique to determine the structures of the HIV spike interacting with cell surface receptor proteins and molecules that block infection. Using cryo-electron tomography and 3D image processing, we recently demonstrated the ability to determine such structures on the surface of native virus, at &tilde;20 &Aring; resolution 9,14. This approach is not limited to resolving HIV Envelope structures, and can be extended to other viral membrane proteins and proteins reconstituted on a liposome. In this protocol, we describe how to obtain structures of HIV envelope glycoproteins starting from purified HIV virions and proceeding stepwise through preparing vitrified samples, collecting, cryo-electron microscopy data, reconstituting and processing 3D data volumes, averaging and classifying 3D protein subvolumes, and interpreting results to produce a protein model. The computational aspects of our approach were adapted into modules that can be accessed and executed remotely using the Biowulf GNU/Linux parallel processing cluster at the NIH <a href="http://biowulf.nih.gov">(http://biowulf.nih.gov)</a>. This remote access, combined with low-cost computer hardware and high-speed network access, has made possible the involvement of researchers and students working from school or home.

The protocol describes a high-throughput approach to determining structures of membrane proteins using cryo-electron tomography and 3D image processing. It covers the details of specimen preparation, data collection, data processing and interpretation, and concludes with the production of a representative target for the approach, the HIV-1 Envelope glycoprotein. These computational procedures are designed in a way that enables researchers and students to work remotely and contribute to data processing and structural analysis.

Cryo - 전자 Tomography 및 자동 하위 tomogram 평균을 사용하여 HIV의 봉투 Glycoproteins의 분자 구조 결정

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Genotypic 접근 방법을 사용하여 시퀀스 분석에 의한 HIV-1 Coreceptor 사용 (Tropism)의 예측

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV - 1 코어의 시험 관내 Uncoating에서

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV 역전사 및 인테그라 제 억제제의 빠른 검사

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

셀 기반의 ELISA 분석을 사용하여 HIV-1 삼량 봉투 당 단백질의 구조적 평가

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1 양성 개인의 플라즈마에서 엑소 좀의 분리

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

HIV-1 감염 라이브 차 인간 대 식세포에서 측정 Phagosome 마이그레이션 및 속도

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

측정<em&gt; 체외</em&gt; HIV-1 사전 통합 단지의 통합 활동

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...