저자는 CS 실험실에서 utero의 electroporation 기술의 확립에서 초기 작업에 에바 Hadzimova, 피에르 Mattar과 크리스토퍼 코바치 감사하고 싶습니다. 이 작품은 캐나다 보건 연구소 연구소 (CIHR) 부여 (청소 44,094)과 DMK에 CS와 알버타 아동 병원 연구 재단 부여 팀 그랜트 (00933-000)을 신흥 CIHR / 재단 파이팅 실명 (FFB)에 의해 재정 지원되었다. RD가 CIHR 캐나다 희망 장학금 지원 되었음 RC는 FFB의 학생이기 지원하고 LML은 유전학에 CIHR 교육 그랜트와 아동 발달 지원했다.

1. 유연 체조 <ol><li> 설정 외과 영역은 그림에서 표시됩니다. 1A,. 설정의 주요 구성 요소는 Eppendorf Femtojet microinjector, 니들 홀더, Leica의 steromicroscope, 광섬유 조명 시스템, 전극과 ECM 830 스퀘어 웨이브 Electroporation 시스템, 난방 패드 및 isoflurane 마취를위한 기화기와 함께 Narishige의 micromanipulator를 포함합니다. </li><li> 수술 도구를 sonicating에 대한 Metriclean2 낮은 거품 솔루션을 사용하여 Bransonic 초음파 클리너 모든 도구를 청소하십시오. autoclaving하여 도구를 소독. 소독 도구는 다음 Germex에 보관됩니다. </li><li> 따뜻한 무균 식염수와 멸균 Lactated 링어의 솔루션과 주사기를 준비합니다. </li></ol> 2. 마취 <ol><li> 소형 (12cm X 20cm) 마취 챔버 내부 플레이스 동물. 기화기를 사용 1L/min (그림 1A, A &#39;)에서 5% isoflurane 마취와 산소를 제공합니다. 특히, 청소 시스템을 사용 isoflurane 배기 가스를 수집하는 것이 중요합니다. </li><li> 호흡은 깊고 정규된다 챔버에서 동물을 제거합니다. 발가락이 아파와 눈 깜박임 반사 테스트는 전체 마취를 보장하는 데 사용됩니다. </li><li> 손난로 (37 ° C)의 위에는 다시 임신에 마우스를 놓으십시오. 손난로 처음 70 % 에탄올로 닦고 소독을하고, 다음 소독, lintless 거즈 패드로 덮여 있습니다. 인공 호흡기 튜브 및 수술 기간 동안 (2.25 %) isoflurane 제공하기 위해 마스크 장치를 사용하십시오. </li><li> 목 목덜미의 피부 밑에 subcutaneously buprenorphine을 (0.1mg/kg의 체중) 주사. </li><li> 깊고 정기적인 호흡에 대한 수술을 통해 동물을 모니터링합니다. 동물, 말하다 shallowly 또는 빠르게 숨을 못한다. 얕은, 빠른 호흡은 빛이 마취의 표시 수 있으며, isoflurane의 흐름이 증가한다. 동물이 말하다하기 시작하면, isoflurane의 흐름을 줄일 수 있습니다. 호흡 체포의 경우, isoflurane을 해제하고, 동물이 복구까지 산소의 흐름을 향상시킬 수 있습니다. 낮은 농도에서 isoflurane 다시 시작합니다. </li></ol> 3. 수술 동물 준비 <ol><li> 테이프는 가열 패드로 동물의 앞발과 무딘 포셉와 뒷다리 다리를 곤란하게하여 철회 응답을 다시 확인하십시오. </li><li> 멸균 솜 면봉 스쳐를 사용하여 복부에 depilatory 크림의 두꺼운 층 (즉, 나이르)을 확산. 회사 스트로크에서 underfur 완전히 코팅되어 있는지 확인하십시오. 머리 제거를위한 살균 깨끗한 면봉과 함께 일시적으로 점검, 3 분 평균에 둡니다. 멸균 물을 멸균 거즈 패드를 젖은 모든 흔적들이 갈 때까지 복부를 닦아냅니다. 물 chlorhexidine (즉, Stanhexidine) 피부가 깨끗하고 등을 통해 반복합니다. 청소, 멸균 거즈로 복부를 건조시킵니다. </li><li> 더 멸균 물 다음 chlorhexidine (즉, Stanhexidine)와 절개 사이트를 소독. 청소, 멸균 거즈로 복부를 건조시킵니다. 70 % 에탄올과 신선한 멸균 면봉을 사용하여이 단계를 반복합니다. </li><li> 자궁 뿔이 수술 중에 뽑아하게됩니다 통해 중앙에 슬릿과 복부를 통해 멸균 거즈 패드를 놓습니다. </li></ol> 4. 절개와 자궁 달린 노출 <ol><li> 자궁 뿔를 노출하려면 먼저 정중선에서 피부 아래에 희미한 선이으로 linea 알바를 찾습니다. 포셉를 사용하여, 멀리 복벽의 피부를 당겨 피부 가위 (길이 약 1cm)로 중간 복부 아래쪽에서 작은 직선 절개를 잘라. </li><li> 곡선 집게와 가위를 사용하여 복막으로 과정을 반복합니다. </li><li> 절개를 통해 작은 수직 슬릿과 멸균 거즈를 삽입하고 따뜻하게 무균 식염수에 저해할 수. </li><li> 절개로 포셉 슬​​라이드와 자궁을 찾습니다. 자궁 뿔을 제거하는 동안 집게와 오픈 절개를 잡아. </li><li> 조심스럽게 첫 번째와 두 번째 보이는 태아의 자궁을 파악하고 거즈로 배아를 가져옵니다. , 자궁 뿔의 양면을 제거 멸균 거즈에 넣어하고 resorptions 또는 &quot;건강하지 못한&quot;(예 : 작은 바디 크기) 배아를 지적, 배아의 수를 계산합니다. 생리와 자궁 뿔이 젖은 조심스럽게 복부에 자궁의 절반을 반환합니다. </li></ol> 5. 심실로 DNA의 주입 <ol><li> 외과 바늘은 모세 혈관과 borosilicate micropipettes를 사용하여 셔터 플라밍 Micropipette의 풀러와 함께 준비하고 있습니다 (프로그램 : 열 = 750 = 30 당겨, 벨 = 90 시간 = 150). 멸균 메스 블레이드를 사용하여 바늘 끝이 부드럽게 각도는 45도 이내에서 하차 면도 있습니다. </li><li> 바늘을로드하려면, 파스퇴르 pipettes은 불꽃 아래 좁은 직경 뽑아 있습니다. . 마우스 피스는 0.01 % 메틸 그린과 혼합 3mg/ml 내독소 무료의 DNA ~ 10 μl (메틸 녹색 염료는 DNA를 주사를 시각적으로 수 있습니다 참고) 세우도록 로딩 피펫에 첨부되어 가득 바늘은 다음 micromanipulator 스탠드에 장착하고 Femtojet 인젝터에 붙어있다. </li><li> 난소에 가장 가까운 배아를 시작으로, 원형은 포셉그것이 주사가 꼬리 방향으로 주동이의 발생 수 있도록, &quot;얼굴 앞으로&quot;위치되도록 부드럽게 decidua 내에서 배아를 설정하는 데 사용됩니다. 조명을위한 광섬유 광원이 주동이의 지역에서 대형 측면 심실 (그림의 1B, B &#39;)의 어귀있는 배아 뇌의 정중선을 시각화하는 데 사용됩니다. </li><li> 배아는 원형 집게를 사용하여 위치에 개최됩니다. 두뇌에 항목의 각도는 약 45도되도록 바늘은 자궁 위에 위치합니다. micromanipulator, 그리고 신속하고 지속적인 운동을 사용하여 바늘 끝은 질 벽에 통해 배아의 측면 뇌실에 삽입됩니다. 주사는 측면 심실, 3 뇌실이나 각각 telencephalon, diencephalon과 망막을 대상으로 s​​ubretinal 공간으로 이동합니다. 배아 두뇌 vesicles는 DNA 측면 심실로 주입은 제 3의 꽂혔어 흐름을 것입니다 이러한 초기 배아 단계에 개방됩니다. </li><li> Eppendorf Femtojet microinjector를 사용하여 내독소없는 DNA (1-3 μL)를 주입하기 위해 발 페달을 누르십시오. 성공적인 주사가 태아의 뇌 심실 내내 메틸 녹색 염료의 확산에 의해 쉽게 시각이다. 바늘 그런 다음 천천히 파손을 방지하기 위해 백업 도면에 의해 제거됩니다. </li></ol> 6. Electroporation <ol><li> 주입 배아 (여전히 자궁 내에서)은 어머니의 복부와 예열 식염수에 충분히 젖었 overlying 멸균 거즈에 위치합니다. 참고 ** 멤브레인 표면에 염분의 덧셈 전류의 효율적인 통과를 허용하는 것이 필수적입니다. </li><li> GenePaddle 전극은 DNA의 주입 다음과 같은 자궁을 그립하는 데 사용됩니다. 40 50V 및 50 MS의 다섯 제곱 전기​​ 펄스는 ECM8300 BTX의 electroporation 시스템 (그림 1C, C &#39;)를 사용하여 초 당 하나의 펄스의 속도로 전달됩니다. </li><li> 보호 서부 유럽 표준시 거즈로 주입 / electroporated 배아를 커버하고 다음 배아를 진행합니다. </li><li> 모든 원하는 배아의 주입 / electroporation 완료되면 조심스럽게 복부 (그림의 1D)로 다시 자궁 뿔 밀어. </li><li> 조심스럽게 다른 자궁 경적을 제거하고 난소에 가장 가까운 배아와 함께 다시 시작합니다. </li></ol> 7. 봉합 및 Stapling <ol><li> 일단 모든 배아 다시 자궁 안으로, 복강 ~ 2-3 ML 따뜻한 호수에 추가됩니다. </li><li> 상처를 닫으려면, 복부에 거즈를 제거하고 복막의 측면을 식별하여 시작합니다. 블랙 꼰 실크 라인을 사용하여 복막을 suturing 시작합니다. 그것은 그것이 일반적으로 약한이며 이후 수술 출혈과 감염을 초래할 수 있으므로이 절차에 대한 흡수성 봉합사를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 흉골에 가장 가까운 복막에 선을 정박하고 멀리 앵커에서 스티치로 진행합니다. 모든 봉합이 꽉 있으며, 더 근본적인 기관이나 피부가 실수로 복막에 수놓은하지되었는지 확인하십시오. 나머지 봉합사 라인을 클립 및 폐기. </li><li> 당겨 피부는 집게와 봉합 라인을 넘어 마감했다. 리플렉스 9mm ™ 피부 폐쇄 스테이플을 사용하여, 스테이플 봉합 라인 아래를주의하지 복용, 상처 부위 피부를 클립, 또는 너무 단단히 피부를 당겨 수 있습니다. 선호하는 방법은 집게로 신체의 피부를 멀리 보유하고 주식 도구를 사용하여 90도 각도로 들어올 수 있습니다. 상처가 닫힐 때까지 계속 (약 3 스테이 플스). 끝나면, 스테이 플스가 조심스럽게 봉합 도구 (그림 1D &#39;)와 함께 누르면 작아 보장합니다. </li></ol> 8. 포스트 외과 케어 <ol><li> 마취 복구를 모니터링하려면, 그녀의 뱃속에 여성 켜고 끌 isoflurane 설정합니다. 숨쉬기가 장치 내부에 동물의 얼굴을 유지 마취에서 회복을 도와 ~ 3 %까지 산소를 켜십시오. 동물은 저체온증을 방지하기 위해 가열 패드 위에 깨끗한 마른 거즈 패드에 배치해야합니다. </li><li> 동물이 얼떨떨해지만, 동물의 목 피부 아래에 subcutaneously 2 ML 링어의 솔루션을 주입. </li><li> 라우스 동물을 위해 몇 분 온난 화 거즈 패드에 대한 산소의 흐름에 따라 동물을 들고 계속합니다. 그것이 정상적인 호흡 패턴으로 돌아갑니다으로 동물의 운동 부족 spurts을 관찰해야합니다. 동물 의식이 정신 보인다 때까지 몇 분 동안 관찰. </li><li> Gentamicin 스프레이와 함께 여성의 복부를 뿌려서 살균 거즈 패드에있는 동물을 바꿈. </li><li> autoclaved 침구와 판지 주택 살균 케이지로 동물을 전송합니다. </li><li> 워터 병은 철저하게, 세척 소독 및 멸균 물을 가득해야합니다. 물 500 ML은 sulfamethazine 항생제 (25 % 주식) 2 ML를 추가합니다. </li><li> 0.05 MG / kg subcutaneously buprenorphine 아침 다음과 같은 수술을 관리할 수 있습니다. </li><li> 처음 24 시간 후 수술 밀접하게 여성을 모니터링합니다. 동물 이상 24 시간 이상 보관하는 경우, 여성은 새로운 동생이야 이동됩니다일 2 일 연습장. </li></ol> 9. 대표 결과 네크로 텍스 네크로 텍스 시각과 sensorimotor 처리와 높은인지 기능을 담당하는 CNS의 지역입니다. 이것은 각각의 지느러미와 복부 telencephalon에서 파생됩니다 glutamatergic 프로젝션 뉴런과 GABAergic interneurons 구성되어 있습니다. neocortical 개발에 여러 유전자의 역할을 해결하기 위해, 우리는 하나 misexpress에 utero의 electroporation에 사용하거나 지느러미 또는 복부 telencephalon 1,3,4 다른 유전자 (즉, shRNA 구조를 사용하여) 표현을 차단합니다. 배아 telencephalon의 유전자를 misexpress 위해, 우리는 CMV - βactin 발기인 - 확장기 및 내부 ribosome 항목 사이트 (IRES) - 향상된 녹색 형광 단백질이 포함된 bicistronic 표현 벡터 (pCIG2)를 사용 (EGFP를, pCIG2)를 카세트를 transfected 수 세포 epifluorescence (그림 2A - C)에 의해 감지합니다. 우리는 E11.5에서 E15.5 (.; 그림 2 그림 데이터가 E12.5에 있습니다)에 telencephalon로 표현 구조를 소개하기 위해이 기술을 사용합니다. 배아는 몇 일 후 electroporation을 개발함으로써, 우리는 GFP - 표시된 progenitors의 분화 및 마이 그 레이션을 추적할 수 있습니다. 차별화의 진행으로 3 일 후 electroporation GFP + 세포가 차별과 심실 구역 (VZ), subventricular 영역 (svz)과 중간 영역 (이즈)과 대뇌 피질의 플레이트 (CP.; 그림 2C) 밖으로 마이 그 레이션. , 기초 progenitors (즉, Tbr2; E12.5에서 electroporated 두뇌가 24 시간 후에 분석하는 경우, 우리는 혀끝의 progenitors의 표시와 함께 공동 라벨 (. 그림 2A 즉, Pax6)에 의해 전구 성숙과의 연결을 마이 그 레이션에 앞서 이벤트를 모니터링할 수 있습니다; . 그림 2B)와 postmitotic neocortical 뉴런 (즉, Tbr1;. 그림 2C). Diencephalon 시상 하부는 내분비 및 자율 신경 시스템 사이의 게이트웨이로서 CNS 및 기능의 복부 기지에 자리잡고 있습니다. 개발하는 동안, 성숙 시상 하부를 구성하는 여러 핵은 일반 전구 영역에서 차별되는 라인 배아 diencephalon의 복부 - 대부분의 지역. 현재, 전구 세포의 증식, 분화의 연결 및 hypothalamic 핵의 형성을 조절 분자 경로가 제대로 이해하고 있습니다. 우리는 E12 embryos.We의 제 3 뇌실에 DNA를 주입하여 배아 diencephalon에 리포터 유전자 발현을 대상으로 utero의 electroporation에 사용되는 다음 E14에서 뉴런을 차별에서 GFP의 분포를 따랐다. 이 방법론으로, 우리는 성공적으로 시상 사전 시상과 시상 하부 (그림 3A)에 GFP 발현을 목표로합니다. 코로나 섹션 분석은 우리가 성공적으로 전구 세포에 GFP 발현을 타겟으로 가지고 공개되는 핵을 형성하는 맨틀 영역 밖으로 마이 그 레이션 3 차 뇌실과 뉴런의 라인 심실 영역 (그림 3B) 망막 망막이 뇌에 전달 전기 자극 빛을 광자 변환에 대한 책임 눈 신경 계층입니다. 그것은 배아 diencephalon의 outpocketing로 개발하고, 따라서, 신경 튜브에서 파생됩니다. 신경 망막은 subretinal 공간, 머리 mesenchyme에서​​ 시선을 구분하는 캐비티에 인접 거짓말을 꼭대기의 시조 구획에서 개발하고 있습니다. 망막 progenitors로 DNA 구조를 타겟팅하면 따라서 주사가 작은 대상 영역으로 만들어집니다이 필요합니다. micromanipulators를 사용하여, 우리는 성공적으로 (; 그림 4. 그림은 mCherry 기자와 PCIC의 E15.5 electroporations입니다) E13.5 E15.5에 배아에서이 작은 지역을 타겟으로 관리합니다. ; electroporated retinae 24 시간 이후 transfection을 검사하는 경우, 우리는 대부분의 mCherry + 세포가 외부 neuroblast의 나누어 progenitors이있는 레이어 (onbl), 그리고 망막 신경절 세포 레이어에 (삽입된 페이지 이미지 gcl)에 위치하고 있습니다 관찰 postmitotic 세포는 어디에 집중. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. utero의 electroporation 설정과 방법론의 소개가. (A) 설정 수술의 주요 구성 요소는 Eppendorf Femtojet microinjector (1), 바늘 홀더 (2) Narishige의 micromanipulator, Leica의 steromicroscope (3), 광섬유 조명을 포함 시스템 (4), 전극 (5)와 손난로 (6)와 ECM 830 스퀘어 웨이브 Electroporation 시스템. (A &#39;) 동물 isoflurane 마취에 대한 기화기를 사용하여 anesthetized 있습니다. (B, B &#39;) 간단히 마취 후, 자궁 뿔은 노출과 빠른 그린과 혼합 DNA는 배아 두뇌 vesicles로 주입됩니다. 성공적인 주사는 빠른 녹색 염료 (B &#39;)의 추적에 의해 시각입니다. DNA가 성공적으로 주입되면 (C, C &#39;), 외륜의 전극은 자궁, positi의 양쪽에 배치됩니다DNA가 선택의 두뇌 지역에 긍정적인 극으로 뽑았 수 있도록 배아를 oning. (D, D &#39;) 모두 원하는 배아가 주입되면 자궁이 복부 (D)으로 반격에 나섰고이며, 복막을 봉합하고, 피부 (D 붙인 것입니다&#39;). 임신 여성은 다음 복구할 수 있으며 electroporated 새끼가 원하는 시간 지점에서 수집하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. pCIG2와 E12.5에 electroporated E13.5 등의 telencephalon 통해 코로나 섹션의 지느러미 telencephalic electroporation의 대표적인 예라고 할 수 있습니다. (AC)는 현미경 사진. Electroporated GFP + 세포 꼭대기의 progenitors의 마커 자신의 표현에 대한 분석입니다 (Pax6 +, 빨강, A), 기초 progenitors (Tbr2 +, 빨강, B)와 postmitotic의 뉴런 (Tbr1 것은 +, 빨강, C). CP, 피질 판, svz, subventricular 지대, VZ, 심실 영역. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. diencephalic electroporation의 대표적인 예라고 할 수 있습니다. pCIG2와 E12에서 electroporated되었습니다 E14 두뇌의 (A) 복부 볼 수 있습니다. GFP epifluorescence은 시상에서 볼 수있다, 사전 시상과 시상 하부는 제 3 뇌실의 전반에 걸쳐 플라스미드 microinjected pCIG2의 확산을 보여주는. electroporated 두뇌를 통해 코로나 섹션 (B) 현미경 사진, GFP의 마이 그 레이션을 보여주 + 심실 영역과 hypothalamic 핵이 형성되는 맨틀 영역에 세포 밖으로. 3V, 셋째 뇌실, T, 시상, HY, 시상 하부, mz, 맨틀 구역, 전화 번호, telencephalon; PreT, prethalamus, VZ, 심실 구역. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 망막 electroporation의 대표적인 예라고 할 수 있습니다. 외부 neuroblast 계층에 mCherry + 세포의 축적을 보여주는 E15.5에서 PCIC와 electroporated E16.5 눈에 코로나 섹션되지 Brn3b + 신경절 세포 레이어에 망막 신경절 세포. 삽입된 페이지는 박스 영역의 높은 배율 이미지입니다. gcl, 망막 신경절 세포 레이어, 레, 렌즈, onbl, 바깥쪽 neuroblast 레이어, 다시, 망막.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

utero에 electroporation은 개발 프로세스의 다양한 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, GFP, mCherry 또는 알칼리성 인산 가수 분해 효소와 같은 기자 유전자의 transfection은 혈통의 연결을 추적 및 마이 그 레이션 실험을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 또는, Cre 호텔 recombinase는 transiently 선택 공간 및 / 또는 temporally 제어 방식으로 floxed allele를 제거하는 표현하실 수 있습니다. 또한, shRNA ?...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 범주 </th></tr><tr><td> 파인 가위 </td><td> 좋은 과학 도구 주식 회사 </td><td> 14078-10 </td><td> 수술 도구 </td></tr><tr><td> 곡선 홍채 가위, </td><td> 좋은 과학 도구 주식 회사 </td><td> 14061-10 </td><td> 수술 도구 </td></tr><tr><td> 올슨 - 헤거 전 고상한 니들 홀더 </td><td> 좋은 과학 도구 주식 회사 </td><td> 12002-12 </td><td> 수술 도구 </td></tr><tr><td> 링 포셉, 9mm </td><td> 좋은 과학 도구 주식 회사 </td><td> 11103-09 </td><td> 수술 도구 </td></tr><tr><td> 아이 드레싱 Forcep </td><td> 좋은 과학 도구 주식 회사 </td><td> 11051-10 </td><td> 수술 도구 </td></tr><tr><td> 더몬트 # 7 DMX Forcep </td><td> 좋은 과학 도구 주식 회사 </td><td> 11271-30 </td><td> 수술 도구 </td></tr><tr><td> 더몬트 # 5 DMX Forcep </td><td> 좋은 과학 도구 주식 회사 </td><td> 11251-30 </td><td> 수술 도구 </td></tr><tr><td> 조직 forcep - Adson </td><td> 좋은 과학 도구 주식 회사 </td><td> 11027-12 </td><td> 수술 도구 </td></tr><tr><td> 리플렉스 클립 Applier </td><td> 세계 정밀 악기 </td><td> 500343 </td><td> 수술 도구 </td></tr><tr><td> 다공 스푼, 15mm 직경 </td><td> 좋은 과학 도구 주식 회사 </td><td> 10370-18 </td><td> 수술 도구 </td></tr><tr><td> Autoclip의 리무버 </td><td> Mikron </td><td> 427637 </td><td> 수술 도구 </td></tr><tr><td> 실크 블랙 브레이 디드 봉합해 </td><td> Ethicon 주식 회사 </td><td> K871 </td><td> 수술 도구 </td></tr><tr><td> 리플렉스 피부 폐쇄 스테인리스 상처 클립 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 500346 </td><td> 수술 도구 </td></tr><tr><td> ECM 830 스퀘어 웨이브 Electroporation 시스템 </td><td> VWR - CanLab </td><td> 58018-004 </td><td> 악기 </td></tr><tr><td> 핀셋 W / 가변 갑 2 라운드 5mm 플래티넘 플레이트 전극 </td><td> Protech 인터내셔널 </td><td> CUY650P5 </td><td> 악기 </td></tr><tr><td> 핀셋 W / 가변 갑 2 라운드 7mm 플래티넘 플레이트 전극 </td><td> Protech 인터내셔널 </td><td> CUY650P7 </td><td> 악기 </td></tr><tr><td> Eppendorf Femtojet Microinjector </td><td> VWR CanLab </td><td> CA62111 - 488 </td><td> 악기 </td></tr><tr><td> Eppendorf Femtojet Microinjector에 대한 풋 컨트롤 </td><td> VWR CanLab </td><td> CAACCESS (misc.) </td><td> 악기 </td></tr><tr><td> Bransonic 초음파 클리너 모델 1510R - DTH </td><td> VWR CanLab </td><td> CA33995 - 534 CPN - 952-118 </td><td> 악기 </td></tr><tr><td> 서터 P97 Micropipet 풀러 </td><td> 서터 악기, Carsen 그룹 주식 회사 </td><td> P - 97 </td><td> 악기 </td></tr><tr><td> Micropipettes - 필라멘트 OD와 Borosilicate : 1mm, ID : 0.78 mm, 10cm 길이 </td><td> 서터 악기 </td><td> BF100 - 78-10 </td><td> 악기 </td></tr><tr><td> 3 축 거친 조작하는 사람 </td><td> 칼 자이스 혈구 캐나다 주식 회사 </td><td> M - 152 </td><td> 악기 </td></tr><tr><td> micromanipulator에 대한 자기 홀딩 장치 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> M1 </td><td> 악기 </td></tr><tr><td> micromanipulator에 대한 스틸베이스 플레이트 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 5052 </td><td> 악기 </td></tr><tr><td> Micropipette 홀더 </td><td> 세계 환경 설정ecision 악기 </td><td> MPH3 </td><td> 악기 </td></tr><tr><td> Micropipette 핸들 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 5444 </td><td> 악기 </td></tr><tr><td> Stereomicroscope </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td> 악기 </td></tr><tr><td> isoflurane 마취를위한 기화기 </td><td> 포터 인 스트 루먼트 회사 </td><td> 모델 100 - F </td><td> 악기 </td></tr><tr><td> 수술 도구를 sonicating에 대한 Metriclean2로 거품 솔루션 </td><td> Metrex 리서치 주식 회사 </td><td> 10-8100 </td><td> 외과 시약 </td></tr><tr><td> suturing 후 0.2 g의 메틸렌 블루 스프레이에 항생제 Gentamicin 40mg/ml </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> G1264 </td><td> 외과 시약 </td></tr><tr><td> 수술 도구를 살균을위한 Germex </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00141569 </td><td> 외과 시약 </td></tr><tr><td> BNP의 안과 연고 </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00516414 </td><td> 외과 시약 </td></tr><tr><td> 나이르 ® </td><td> 처치 &amp; 드와이트 (주) (주)에 의해 배포 </td><td> 상용 </td><td> 외과 시약 </td></tr><tr><td> Stanhexidine 4퍼센트 W / V 피부 청소기 </td><td> 오메가 연구소 주식 회사 </td><td> 01938983 </td><td> 외과 시약 </td></tr><tr><td> Buprenorphine (Temgesic) 진통 </td><td> 셔링 - 플로 </td><td> 531-535 </td><td> 외과 시약 </td></tr><tr><td> Sulpha &quot;25&quot;sulphamethazine 경구 항생제 </td><td> 프로 페셔널 베티 연구소 </td><td> DIN # 00308218 </td><td> 외과 시약 </td></tr><tr><td> Lactated 링어 솔루션 </td><td> 백스터 코퍼레이션 </td><td> DIN # 0061085 </td><td> 외과 시약 </td></tr><tr><td> 생리 - 0.9 %의 나트륨 염화물 </td><td> B - 브라운 의료 주식 회사 </td><td> DIN # 01924303 </td><td> 외과 시약 </td></tr><tr><td> 흡입 마취 - Isoflurane USP </td><td> 캐나다 Inc의 제약 파트너 </td><td> DIN # 02237518 </td><td> 외과 시약 </td></tr><tr><td> 빠른 그린 FCF </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> F7252 </td><td> 외과 시약 </td></tr></tbody></table>

efficient gene delivery into multiple cns territories using in utero electroporation

유전자 표현을 조작할 수있는 능력은 여러 개발 경로의 해설로 이어지는, 현대 실험 발생학의 초석입니다. 몇몇 강력하고 잘 설립된 유전자 변형 기술은 모두 손실과 이득의 기능 모델의 생성을 허용, 마우스의 유전자 발현 수준을 조작하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나, 마우스 트렌스 제닉의 세대 비용과 시간이 소요 모두이다. 유전자 조작의 대체 방법을 따라서 넓게 모색하고 있습니다. utero에 electroporation 우리가 성공적으로 3,4을 적응 가지고 살고 마우스 배아의 1,2에 유전자 전달의 방법입니다. 그것은 크게 일반적으로 여자는 5에서 사용되는 비켜 electroporation 기술의 성공을 기반으로합니다. 간단히, DNA는 세포로 DNA의 이해 수있게 개발 두뇌와 전류가 발생 세포 점막에 일시 모공의 형성 응용 프로그램의 열려있는 심실로 주입됩니다. 젊은 태아의 타겟팅 초음파 유도 microinjection 프로토콜로 이전 6 설명을 필요로하는 동안 우리 손에, 배아는 효율적으로 배아 일 (E) 11.5 빠르면 electroporated 수 있습니다. 반대로, E15.5은 두정 골과 두뇌에 microinjection을 초래할 이마 뼈 분화의 발병으로 인해 우리가 쉽게 electroporate 수있는 최신 단계이다. 반대로, 망막은 embryogenesis의 끝 부분을 통해 액세스할 수 있습니다. 배아는 배아 또는 출생 후의 초기 기간 동안 어떤 시점에서 수집한 수 있습니다. 기자 구조의 주사 transfected 세포의 식별을 용이하게합니다. 날짜하려면, utero의 electroporation에서 가장 널리 neocortical 개발 1,2,3,4의 분석에 사용되고 있습니다. 최근 연구는 배아 망막 7, 8, 9 및 시상 10,11,12를 타겟으로합니다. 여기, 우리는 쉽게 배아 CNS의 다른 도메인을 대상으로 적용할 수 있습니다 utero의 electroporation 프로토콜의 수정을 제시한다. 우리는이 기술을 사용하여 우리가 배아 telencephalon, diencephalon과 망막을 대상 수있는 증거를 제공합니다. 대표 결과가 처음 우리가 배아 telencephalon의 전구 성숙, 분화 및 마이 그 레이션을 모니터링 수 있도록 측면 심실로의 DNA 구조 표현을 소개하는이 방법의 사용을 보여주는 제공됩니다. 우리는 또한 모니터링하는 diencephalic 핵에 신경을 차별의 철새 경로를 허용,이 기술은 제 3의 뇌실 주위 diencephalic 지역에 DNA를 대상으로하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 우리는 우리가 망막 개발에 유전자 발현을 조작의 효과를 분석 있도록 micromanipulators의 사용 우리가 정확하게 subretinal 공간을 포함하는 작은 대상 분야로 DNA 구조를 소개하는 허용 보여줍니다.

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Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

utero의 electroporation에서 개발 중추 신경계 (CNS)에서 공간과 temporally 제어 방식으로 신속한 유전자 전달 수 있습니다. 여기서 우리는 telencephalon, diencephalon 및 망막을 포함한 여러 배아 CNS의 도메인으로 표현 구조를 제공하는 데 사용할 수있는 utero의 electroporation 프로토콜에 매우 적응을 설명합니다.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

efficient-gene-delivery-into-multiple-cns-territories-using-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

19.7K 조회수.  University of Calgary. utero의 electroporation에서 개발 중추 신경계 (CNS)에서 공간과 temporally 제어 방식으로 신속한 유전자 전달 수 있습니다. 여기서 우리는 telencephalon, diencephalon 및 망막을 포함한 여러 배아 CNS의 도메인으로 표현 구조를 제공하는 데 사용할 수있는 utero의 electroporation 프로토콜에 매우 적응을 설명합니다.

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Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. However, because the uterine wall is opaque during early embryogenesis, the ability to target specific parts of the embryo for microinjection is greatly limited. Fortunately, high-frequency ultrasound imaging permits the generation of images that can be used in real time to guide a microinjection needle into the embryonic region of interest. Here we describe the use of such imaging to guide the injection of retroviral vectors into the ventricular system of the mouse forebrain at embryonic day (E) 9.5. This method uses a laparotomy to permit access to the uterine horns, and a specially designed plate that permits host embryos to be bathed in saline while they are imaged and injected. Successful surgeries often result in most or all of the injected embryos surviving to any subsequent time point of interest (embryonically or postnatally). The principles described here can be used with slight modifications to perform injections into the amnionic fluid of E8.5 embryos (thereby permitting infection along the anterior posterior extent of the neural tube, which has not yet closed), or into the ventricular system of the brain at E10.5/11.5. Furthermore, at mid-neurogenic ages (~E13.5), ultrasound imaging can be used direct injection into specific brain regions for viral infection or cell transplantation. The use of ultrasound imaging to guide in utero injections in mice is a very powerful technique that permits the molecular and cellular manipulation of mouse embryos in ways that would otherwise be exceptionally difficult if not impossible.

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. Here we describe the use of high-frequency ultrasound imaging to guide the injection of retroviral vectors into the mouse brain at embryonic day (E) 9.5.

마우스 Forebrain에 초음파 유도 Microinjection Utero에서 E9.5에서

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

연구

신경과학

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

비 심실 플라스미드 주입 및 Electroporation에 의해 출생 후의 쥐 뇌에 유전자 전달

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

몸에 붙이기 형질 전환 쥐의 발생에 의해<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 생물 발광 상영

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

중추 신경계에 대상 물질 전달을위한 마우스 미세 주입 기술<i&gt;를 통해</i&gt; 내부 경동맥

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...