이 작품은 보건 기금의 국립 연구소 NS - 38849과 DK - 076160, 당뇨병의 합병증 연구에 대한 소아 당뇨병 연구 재단 센터에 의해 지원 되었음 : 신경과 연구와 발견과에서 A. 알프레드 타어브먼 의학 연구소에 대한 프로그램 미시간 대학. 이 작품은 형태론과 당뇨병과 소화기 및 신장 질환 국립 연구소에서 보건 부여 5P60 DK - 20572 국립 연구소에 의해 자금 미시간 당뇨병 연구 및 교육 센터의 이미지 분석 코어를 사용했습니다. 저자에 그의 귀중한 조언을 분자 프로브 / Invitrogen에서 스콧 T. 클라크 감사 다양한 클릭 그것이 에듀의 증폭 기술의 초기 개발을 지원하는 키트와 시약의 관대한 기부 라벨 이두.

1. 뉴런의 준비 <ol><li> 도설 루트 신경절 (DRG) 뉴런은 24 웰 플레이트에 문화 멸균 (autoclaved) 12mm 유리 coverslips에서 재배하고 있습니다. </li><li> 이두의 10 MM 재고는 (DMSO, 클릭 IT 에듀 Microplate 어세이 키트)를 (예 : 30 일반적으로 10X 에듀 솔루션 (100 μm의)를 만들어 문화 매체 1:100 희석 후 문화 우물에 1시 10분를 희석합니다 문화 매체 300 μL의 총에 10X 에듀 솔루션)의 μL. DRG의 뉴런은 37에서 10 μm의 정보 에듀의 최종 농도와 incubated 아르 ° C와 5% 2~24시간 사이에 CO 2. 시간의 길이는 치료가 mtDNA 합성의 속도에 영향을 미칠 방법에 따라 달라집니다. </li><li> 4 최대 1 개월에 퓸 후드에서, DRG 뉴런은 실온에서 10-15 분 2 % paraformaldehyde에 고정 각 씻어 1X PBS 2-5분 두 번 씻어 신선한 1X PBS에 저장된 ° C. </li><li> Coverslips가 준비 습기가 실로 미세 밀고 포셉와 함께 전송됩니다 (대비에 대한 검정에 뿌리고 바닥과 코닝 BioAssay 요리, 가벼운 민감한 구성 요소와 물로 포화 Kimwipes와 humidified를 보호하기 위해 알루미늄 호일에 싸서)와 Parafilm M의 시트에 배치 제공 coverslip으로 솔루션 범위를 제한하기 위해 소수성 표면. 아래의 프로토콜은 28 coverslips 위해 설계 및 솔루션는 32 coverslips (14 % 추가 볼륨에 대한) 준비하고 있습니다. 값비싼 또는 제한된 구성 요소와 솔루션은 75-80 μL 각 coverslip에 사용되도록 만들 수 있습니다. 그렇지 않으면, 200-300 μL는 철저하게 이전 솔루션을 씻어 세척 및 차단 솔루션에 대한 사용됩니다. </li><li> 1X PBS 각 coverslip의 표면 (200-300 μL)를 충당하기 위해 다시 적용됩니다. 클릭 IT 분석하고 아래와 제조 업체의 지침에 설명된 tyramide 신호 증폭 키트를 준비합니다. </li></ol> 클릭 IT 에듀 Microplate 어세이 키트의 준비 클릭 IT 에듀 Microplate 분석 키트에서 대부분의 구성 요소와 미리 만들어 4 저장됩니다 ° C [2X 클릭 IT 반응 버퍼 (10X 컴포넌트 E), CuSO4 (100 MM, 구성 요소 F)를 클릭 - IT 이두 정착액 ( 구성 요소 D) 및 차단 버퍼 (2X 구성 요소 H)]. 클릭 IT 에듀 버퍼 첨가제 (10X 구성 요소 G)은 시간이 지남에 따라 노란색 - 갈색 변하는 그것을 방지하기 위해 -20 ° C에 저장됩니다. 이 구성 요소는 반복 동결 - 해동 사이클을 허용합니다. 오레곤 그린 488 azide (컴포넌트 B)은 동결 - 해동 사이클을 최소화하기 위해 작은 aliquots (10-20 μL)으로 나누어 -20 ° C.에 보관해야 안티 - 오레곤 그린 HRP 공액 (구성 요소 I)의 주식 솔루션을 준비하려면, 유리병에 밀리 Q DH 2 O 75 μL를 추가합니다. 거품 방지 및 저장 4 ° C.에 부드러운 pipetting 또는 반전에 의해 믹스 와동하지 마십시오. TSA 키트의 준비 HRP 염소 안티 - 토끼 IgG와 알렉사 플루어 488 Tyramide 키트와 함께 # 12, tyramide 재고 솔루션을 준비하려면, DMSO (구성 요소 B) 150 μL에 (알렉사 플루어 488 tyramide, 구성 요소 A) 고체 물질을 분해. 모든 tyramide 코팅에게 유리병의 측면을 분해하기 위해 유리병 여러 번 반전. ≤ -20에서 작은 aliquots의 상점 재고 솔루션 (10-20 μL) ° C, desiccated과 빛으로부터 보호. 2. 클릭 IT 5 - ethynyl - 2 - deoxyuridine (이두) 레이블 참고 : 모든 솔루션 부드럽게 상실 세포없이 액체를 제거하는 끝에 부착된 200 μL 팁과 벌브 전송 피펫과 함께 제거됩니다. 보통 너무 적극적으로 해결책을 제거하는 진공 라인을 사용하지 마십시오. 전구의 피펫은 부드럽게 철저 이전 솔루션을 씻어 씻으 솔루션의 200-300 μL와 coverslips을 범람하는 데 사용됩니다. <ol><li> 세포는 0.1 % 적용 습한 실내에 상온에서 10 분 1X PBS 용액에서 트리톤 - X - 100 permeabilized 있습니다. 1퍼센트 트리튼 - X - 100 재고 솔루션을 사용합니다. <ul><li> 2700μL 1X PBS로 트리톤 - X - 100 재고 없음 300 μL 1 %를 추가하여 0.1 % 트리톤 - X - 100 3,000 μL를 확인합니다. </li><li> coverslip 당 75-80 μL를 사용하십시오. </li></ul></li><li> 트리톤 X - 100 용액을 제거하고 1X PBS로 두 번 씻어. </li><li> 내생 퍼옥시데이즈 활동은 1 %의 실온에서 30 분 1X PBS 용액에 H 2 O 2에 의해 침묵이다. 1X PBS로 30% H 2 O 2 용액을 희석. 이 솔루션은 신선한되어야하지만 위의 10 분 permeabilization 단계 (단계 3.1) 동안에 만들 수 있습니다. <ul><li> 2900 μL 1X PBS 100 μL 30% H 2 O 2를 추가하여 1 %의 H 2 O 2 3,000 μL를 확인합니다. </li><li> coverslip 당 75-80 μL를 사용하십시오. </li><li> 퍼옥시데이즈 솔루션을 제거하고 1X PBS로 두 번 씻어. </li></ul></li><li> 클릭 IT 이두 반응 <ul><li> 32 coverslips (32 X 80 μL = 들어2560 μL) 2,560 μL의 총 필요합니다. 2X 반응은 반응의 전체 볼륨의 절반이다 1,280 μL에서 이루어집니다. </li><li> 갓 5 분 게시 수정 (아래의 단계 3.5) 시작하기 전에 클릭 IT 반응 칵테일을 준비합니다. </li><li> 최대 pipetting 아래로 칵테일을 섞는다. 이 반응을 할 때 와동하지 마십시오. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 2 X 반응 칵테일 구성 요소를 클릭합니다 - IT 에듀 Microplate 어세이 키트에서 아르 </td><td> 하프 볼륨 : 1280 μL </td></tr><tr><td> 밀리 Q DH 2 O </td><td> 1132.8 μL </td></tr><tr><td> 2X 클릭 IT 반응 버퍼 (10X 컴포넌트 E) </td><td> 100.3 μL </td></tr><tr><td> 클릭 IT 에듀 버퍼 첨가제 (10X 컴포넌트 G) </td><td> 25.6 μL </td></tr><tr><td> CuSO 4 (100 MM, 컴포넌트 F) </td><td> 25.6 μL </td></tr><tr><td> 오레곤 그린 Azide (구성 요소) </td><td> 6.4 μL </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 1290.7 μL </td></tr></tbody></table> 참고 : 위에서 사용된 볼륨이 클릭 IT 에듀 Microplate 분석 키트 방향에있는 볼륨에 비례합니다. 반응 칵테일의 최종 부피는 1,280 μL보다 약간 더 있습니다. </li><li> 2X 클릭하여이 - IT 반응은 클릭 그것의 동등 볼륨 에듀 정착액 (구성 요소 D) 바로 사용하기 전에 함께 희석 수 있습니다. 이 함께 혼합하면 모든 coverslips에 대한 균일한 반응 솔루션을합니다. </li><li> 1290.7 μL 반응 칵테일에 1290.7 μL 클릭 IT 에듀 정착액을 (구성 요소 D) 추가합니다. coverslip 당 75-80 μL를 사용하십시오. </li></ul></li><li> 클릭 IT 상온에서 5 분 에듀 정착액 (구성 요소 D)과 뉴런을 게시 - 수정. </li><li> 삭제 수정과 (3.4 단계) 위의 반응 칵테일을 추가합니다. 빛과 보호하고 실온에서 25 분 부화 커버. 부드럽게 반응 칵테일을 제거합니다. 희석 1X 차단 버퍼 (2X 구성 요소 H)와 함께 두 번 씻으십시오. <ul><li> MilliQ D H 2 O (2600 μL)의 동일한 볼륨 2,600 μL 차단 버퍼 (2X 구성 요소 H)를 diluting하여 1X 차단 버퍼의 5200 μL를 확인합니다. coverslip 당 75-80 μL를 사용하십시오. </li></ul></li><li> 에피 형광 현미경, mitotically 활성 제어 세포의 핵에있는 오레곤 그린 얼룩 확인하십시오. </li></ol> 3. 에듀 신호의 Tyramide 신호 증폭 (TSA) <ol><li> 각 coverslip에 1% TSA 블록 솔루션을 추가하고 실온에서 30 분 알을 품다. <ul><li> TSA 차단 시약의 0.06 G (TSA 키트 # 12 구성 요소 D)를 무게와 6000 1X PBS μL에 추가 1 % TSA 블록 솔루션의 6000 μL을 만듭니다. 섞어 와동. 1퍼센트 TSA 블록 솔루션에 5 % 염소 혈청 또한 종종 아닌 특정 바인딩을 줄이기 위해 도움이 될 것입니다. </li></ul></li><li> 간단히 방지 오레곤 그린 양고추냉이 퍼옥시데이즈 복합 항체 재고 (클릭 IT 에듀 Microplate 분석의 구성 요소 나), TSA 미리 2~24시간을 준비 스핀. 1퍼센트 TSA 차단 솔루션에서 기본 항체 1:300을 희석하고 반전이나 믹스로 부드럽게하고 아래로 피펫. HRP - 복합 항체를 방해하지 않도록 와동하지 마십시오. 1퍼센트 TSA 블록 솔루션을 제거, 각 coverslip 75 μL를 추가하고 4 박 품어 ° C. <ul><li> 항체가 같은 1:150으로, 더 집중적으로 사용할 수 있지만이 제한 금액을 제공하므로 그것을 아껴서 사용합니다. 다시 1% TSA 블록 솔루션에 5 % 염소 혈청 또한 종종 방지 오레곤 그린 양고추냉이 퍼옥시데이즈 복합 항체가 아닌 특정 바인딩을 줄이기 위해 도움이 될 것입니다. </li><li> 주식 래빗 방지 오레곤 그린 - HRP (의 8.53 μL를 추가하여 1:300 항체 솔루션의 2560 μL 만들기를 누릅니다 - I2560 μL 1퍼센트 TSA 차단 T 에듀 Microplate 어세이). 부드러운 pipetting 또는 역전하여 섞는다. </li></ul></li><li> 다음날 항체 솔루션을 제거하고 1X PBS로 세 번 씻어. 언바운드 기본 항체가 제거되도록 실온에서 추가 30-60분의 최종 세척에 coverslips을 품어. </li><li> 2,560 μL (32 coverslips X 80 μL)에 대한 Tyramide 반응을 준비합니다. <ul><li> 398 μL 증폭 버퍼 (TSA 키트 # 12 컴포넌트 E)로 30% H 2 O 2 (TSA 키트 # 12 구성 요소 F) 2 μL를 추가하여 0.15 % H 2 O 2 용액 (100X) 400 μL 만들기 . 이것은 바로 직전에 필요한하여야한다. </li><li> 2560 μL의 최종 볼륨에 결합 : <ul><li> 25.6 μL Tyramide - 488 (TSA 키트 구성 요소) </li><li> 2508.8 μL 증폭 버퍼 (TSA 키트 구성 요소 E) </li><li> 25.6 μL 0.15 % H 2 O 2 (최종 0.0015 % H 2 O 2 위에서) </li><li> 실온에서 15 분 Tyramide 반응과 1X PBS과 부화를 제거합니다. </li></ul></li></ul></li><li> Tyramide 반응을 제거하고 이전처럼 실온에서 30-60분의 최종 세척의 잠복기, 1X PBS로 세 번 씻어. </li><li> 에피 형광 현미경으로 mtDNA 라벨 확인합니다. <ul><li> 같은 antifade 장착 매체와 유리 현미경 슬라이드에 마운트 coverslips는 DAPI와 골드를 연장. 또는, 에듀 라벨과 증폭이 다른 세포 마커를 라벨 표준 형광등 immunocytochemistry 다음 수 있습니다. </li></ul></li></ol> 4. 대표 결과 : Mitochondrial DNA 복제의 시각화 Mitochondrial Biogenesis의 마커로 우리는 감각 뉴런 (그림 1)는 mitochondria의 수를 조절하는 방법에 관심이 있습니다. 이 프로토콜은 새로운 mitochondria을 측정하는 방법으로 형광 마커와 새로 합성된 mtDNA 레이블을 것입니다. 녹색 형광 신호 (그림 2)와 mtDNA의 라벨에있는 알렉사 - 플루어 488 tyramide 결과 오레곤 그린 - azide와 후속 증폭의 Click 화학 다음에 합성 염기 에듀의 결합. 제대로하면, 증폭 녹색 신호는 형광 배경 (예 : 셀룰러 autofluorescence 또는 HRP - TSA 반응의 부작용 등)보다 충분히 높다. 이 기술은 뉴런 (그림 3)의 subcellular 구획 내에 mtDNA biogenesis를 시각화하고 계량하기 위해 새로 복제 mtDNA 레이블을하도록 설계되었습니다. 에듀 라벨은 neurofilament (그림 3D) 등 다른 세포 마커를 라벨 이후 형광등 immunocytochemistry를 허용합니다. TSA 반응은 이러한 알렉사 플루어 594 - tyramide 등 다른 형광 알렉사 플루어의 tyramides와 함께 할 수 있습니다. 핵에있는 오레곤 그린 - azide 클릭 반응하지만 전에 TSA에 감지됩니다 mtDNA에없이 녹색 신호에서 녹색 형광 신호를 핵이 발생합니다. 알렉사 플루어 594 - tyramide로 증폭이 핵 라벨을 intensifies과 빨간색 형광 신호 (그림 4)와 mtDNA의 통합 에듀를 보여준다. 유사한 증폭 절차가 새로 합성 mtDNA (그림 5)에 BrdU의 설립을 시각화하는 데 사용됩니다 그러나,이 방법은 추가 단계 에듀에 필요한도 않았습니다 가혹한 산성 (HCL) 또는 효소 소화에 의해 BrdU 에피토프를 복구할 필요 라벨. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 대표 차등 간섭 대비 (DIC) 배아의 이미지 (왼쪽)와 성인 (오른쪽) 일반적으로 분석. 바 = 10 μm의에 사용되는 등의 루트 신경절 (DRG) 뉴런. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 녹색 형광 신호와 mtDNA의 이두를 라벨에 대한 절차를 나타내는 설계도를 그림. 도식은 녹색 형광 신호와 mtDNA의 이두를 라벨에 대한 3 단계 프로토콜을 나타냅니다. Mitotically 활성 F11 neuroblastoma 세포는 긍정적인 제어 역할과 핵 및 mitochondrial DNA에 통합되었다 에듀의 상표 패턴을 보여줍니다. 첫 번째 단계 (P1)은 에듀의 존재의 세포를 잠복기가 새로 합성 mtDNA에 thymidine 아날로그를 포함하는 것입니다. 두 번째 단계 (P2)는 오레곤 그린 - azide와 통합 에듀 레이블을 클릭하여 화학을 기반으로합니다. 녹색 신호는 핵 DNA를 복제 세포의 핵에서 볼 수 있습니다. 마지막 단계는 (P3) 오레곤 할머니를 증폭하는 것입니다오레곤 그린에 대한 HRP - 복합 토끼 항체와 잠복기에 의해 een - azide 신호는 알렉사 플루어 mtDNA에서 녹색 신호를 시각화하는 과산화수소의 존재에 표시된 tyramide 488 (H 2 O 2)와 부화하여 따라갔다. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 지느러미 루트 신경절에서 mtDNA의 에듀 라벨 (DRG) 뉴런. 뉴런은 에듀와 함께 incubated되며 신호가 연속적으로 mtDNA되는 통합 EDU을 나타내기 위해 증폭됩니다. 배아 (A)와 성인 (BD) DRG의 신경 모두 새로 합성된 mtDNA에 포함 증폭 에듀 (EDU - OG - TSA, 녹색)의 작은 반점이있는 녹색 신호를 보여주는 전송 조명에 중첩 대표 형광 이미지. 에듀 라벨 절차는 neurofilament (D, αNF, 빨간색)으로의 연결을 마커의 후속 immunofluorescence 얼룩을 허용합니다. 스케일 바 = 10 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 붉은 형광 신호와 mtDNA의 이두를 라벨에 대한 절차를 나타내는 설계도를 그림. 개략도 붉은 형광 신호와 mtDNA의 이두를 라벨에 대한 3 단계 프로토콜을 나타냅니다. Mitotically 활성 F11 neuroblastoma 세포는 긍정적인 제어 역할과 핵 및 mitochondrial DNA에 통합되었다 에듀의 상표 패턴을 보여줍니다. 첫 번째 단계 (P1)은 에듀의 존재의 세포를 잠복기가 새로 합성 mtDNA에 thymidine 아날로그를 포함하는 것입니다. 두 번째 단계 (P2)는 오레곤 그린 - azide와 통합 에듀 레이블을 클릭하여 화학을 기반으로합니다. 녹색 신호는 핵 DNA를 복제 세포의 핵에서 볼 수 있습니다. 마지막 단계는 (P3) 오리건 그린에 대한 HRP - 복합 토끼 항체와 잠복기하여 오레곤 그린 - azide 신호를 증폭하는 것은 알렉사 플루어 시각화하는 과산화수소의 존재에 594 표시 tyramide (H 2 O 2)와 인큐베이션 다음 mtDNA의 빨간 신호. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. BrdU 분류 및 mtDNA에 녹색 또는 빨간색 형광 신호 tyramide 신호 증폭. 설계도 그림 중 녹색 또는 빨간색 형광 신호를 새롭게 합성 mtDNA에 BrdU를 라벨에 대한 절차를 나타냅니다. 초기 단계는 에듀 라벨에 대한 필요하지 않습니다 중 하나 산성 (HCL) 또는 효소 소화에 의해 BrdU 에피토프를 복구해야합니다. 다음 단계는 마우스 기본 방지 BrdU 항체와 잠복기 있습니다. 이 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (HRP) 복합 염소 항 마우스 항체와 잠복기옵니다. 마지막으로, 신호는 mtDNA의 신호를 시각화하는 과산화수소의 존재에 녹색 또는 빨간색 찬란 분류 tyramide (H 2 O 2)와 함께 증폭됩니다.

<ol>
	<li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fusion+and+fission+in+mammals.">Mitochondrial fusion and fission in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 79-99 (2006).</li><li>Dimmer, K. S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(De)constructing+mitochondria:+what+for.">(De)constructing mitochondria: what for.</a> Physiology (Bethesda). 21, 233-241 (2006).</li><li>Suen, D. F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis.">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li><li>Clay Montier, L. L., Deng, J. J., Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+matters:+control+of+mammalian+mitochondrial+DNA+copy+number.">Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number.</a> J. Genet. Genomics. 36 (3), 125-131 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Buck, S. B., Bradford, J., Gee, K. R., Agnew, B. J., Clarke, S. T., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li><li>Yu, Y., Arora, A., Min, W., Roifman, C. M., Grunebaum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU+incorporation+is+an+alternative+non-radioactive+assay+to+[(3)H]thymidine+uptake+for+in+vitro+measurement+of+mice+T-cell+proliferations.">EdU incorporation is an alternative non-radioactive assay to [(3)H]thymidine uptake for in vitro measurement of mice T-cell proliferations.</a> J Immunol Methods. 350 (1-2), 29-35 (2009).</li><li>Heusden, J. V. a. n., Jong, P. d. e., Ramaekers, F., Bruwiere, H., Borgers, M., Smets, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein-labeled+tyramide+strongly+enhances+the+detection+of+low+bromodeoxyuridine+incorporation+levels.">Fluorescein-labeled tyramide strongly enhances the detection of low bromodeoxyuridine incorporation levels.</a> J. Histochem. Cytochem. 45 (2), 315-319 (1997).</li><li>Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+based+on+click+chemistry,+which+overcomes+limitations+of+cell+cycle+analysis+by+classical+determination+of+BrdU+incorporation,+allowing+multiplex+antibody+staining.">A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining.</a> Cytometry A. 73, 626-636 (2008).</li><li>Kaiser, C. L., Kamien, A. J., Shah, P. A., Chapman, B. J., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Ethynyl-2'-deoxyuridine+labeling+detects+proliferating+cells+in+the+regenerating+avian+cochlea.">5-Ethynyl-2'-deoxyuridine labeling detects proliferating cells in the regenerating avian cochlea.</a> Laryngoscope. 119, 1770-1775 (2009).</li><li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., Backus, C., McLean, L. L., Haines, K. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+(mtDNA)+Biogenesis:+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In.">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In.</a> Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li><li>Edwards, J. L., Quattrini, A., Lentz, S. I., Figueroa-Romero, C., Cerri, F., Backus, C., Hong, Y., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+regulates+mitochondrial+biogenesis+and+fission+in+mouse+neurons.">Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons.</a> Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).</li><li>Davis, A. F., Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+mitochondrial+DNA+replication+in+intact+mammalian+cells.">In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells.</a> J. Cell Biol. 135, 883-893 (1996).</li><li>Magnusson, J., Orth, M., Lestienne, P., Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+mitochondrial+DNA+occurs+throughout+the+mitochondria+of+cultured+human+cells.">Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells.</a> Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).</li><li>Amiri, M., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+biogenesis+in+the+axons+of+vertebrate+peripheral+neurons.">Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons.</a> Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 이두의 tyramide 신호 증폭을 사용하여 개별 셀을 새로 합성 mtDNA를 라벨에 민감한 분석을 개발했습니다. 이 프로토콜의 최적화 중에 가장 큰 문제 중 하나는 coverslips 사이에 일관성없는 결과가되었다. 변경 사항은 개별 coverslips에 작은 볼륨을 혼합하고 마스터 솔루션은 모든 coverslips에 사용할 수 있도록 피하기 위해 Invitrogen 키트 프로토콜되었다. 각 12mm 원형 유리 coverslip에 사용되는 75-80 μL는 샘플 사이에 일관성있는 결과를 줄 정도로 솔루션을 제공하면서 완전히 표면 영역을 커버하는 이상적인 볼륨입니다. 배양 시간 및 시약의 농도가 최적화된했지만 개선은 그들에게 조정과 함께 볼 수 있습니다. 프로토콜은 한 번 각각의 프로세스를 실행하도록 설계되었습니다. 그러나, 몇 가지 단계는 첫 번째 시도 후 실패 샘플을 복구할 수있는 새로운 솔루션을 반복했습니다. 특히, 에듀 클릭 반응 단계 (3.4-3.6)는 형광 배경에 상당한 증가없이 반복되었습니다. 안티 오레곤 그린 - HRP 항체 보육 (4.1-4.3) 및 tyramide 증폭 (4.4-4.5) 단계는 반복하지만, 더 자주하기 때문에 증가 배경 형광의 노이즈 비율에 가난한 신호를 발생합니다.했습니다 가장 민감한 시약은 클릭 IT 에듀 Microplate 분석 키트에서 클릭 IT 에듀 버퍼 첨가제 (컴포넌트 G)와 토끼 방지 오레곤 그린 - HRP 항체 (구성 요소 I)입니다. ° C 및 6-12 개월 사이가 상당히 어두워 4 저장할 때 클릭 IT 에듀 버퍼 첨가제 점차 시간이 지남에 따라 노란색으로 변합니다. -20 °에서 클릭 IT 에듀 버퍼 첨가제의 스토리지 C는이 문제를 완화합니다. 레이블 및 tyramide 증폭 단계 토끼 방지 오레곤 그린 - HRP 항체가 MilliQ DH 2 O.에서 reconstituting의 4-6개월 이내에 사용할 때 최고의 작품 mtDNA의 이두의 온화 라벨링 추가 셀룰러 마커 9-11과 직접 비교를 허용하고 같은 취급은 복구할 수 있어야합니다 5 - 브로모 - 2 - deoxyuridine (BrdU), 다른 thymidine의 analogs를 통해이 기술의 유틸리티를 향상 DNA 이내에 에피토프. 저희 연구실 11-12과 다른 13-15 성공적으로 mtDNA를 레이블에 BrdU를 사용했습니다. BrdU 라벨 기술은 에듀에 사용되는 것과 비슷하지만 몇 가지 중요한 차이점 (그림 5)을하고 있습니다. 위에 나열된 permeabilization 단계 (3.1-3.2) 후, BrdU 에피토프은 변성 단계로 복구됩니다 (37시 30 분 2 N HCL ° C가 1X PBS 세 세척 다음). BrdU는 다음 BrdU에 대한 일차 항체로 분류된다 (벡터 실험실 TSA 키트에서 1퍼센트 차단 솔루션 1시 50분 희석 4 ° C에서 하룻밤 incubated). 이차 항체 단계 이전에 BrdU 신호 (염소 안티 - 마우스 IgG 1% 차단 솔루션 1:100 희석 TSA 키트 # 2와 # 5에서 HRP을 복합하여 실온에서 45 분 incubated)를 증폭하기 위해 필요 TSA 단계 (위 4.3-4.5). 레이블 mtDNA 두 thymidine의 analogs, 에듀와 BrdU를하는 것이 mtDNA가 순차적으로 펄스 분류 패러다임 11 표시 수있는 이중 레이블 실험을 수행하는 데 유리합니다. 저희 연구실은 당뇨병 신경 장해, 당뇨병의 일반적인 합병증의 맥락에서 mitochondrial biogenesis의 규정을 검토 에듀와 mtDNA의 BrdU 라벨을 사용하고 있습니다. 우리는 성공적으로 개별 뉴런 11-12의 mtDNA biogenesis의 변화를 측정하기 위해 신호 증폭을 사용합니다. 이 기술은 mtDNA 복제 및 매출이나 mtDNA 합성을 억제 약물을 식별을위한 메커니즘을 탐구하기위한 다른 실험에 유용하게 사용될 것입니다. 또한, 확장 에듀와 BrdU 신호의 기본 원리는 다른 연구에 적용할 수 수 측정 DNA 복제 또는 복구합니다.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>12 mm coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-82</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>245 mm x 245 mm BioAssay Dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431111</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm M</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>PM-996</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>paraformaldehye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T-8532</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline 10X solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer Pipet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-711-7M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrogen peroxide, 30% in water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP2633</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Click-iT EdU Microplate Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C10214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #12, with HRP&#x2014;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20922</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #15, with HRP&#x2013;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20925</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P-36931</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyclonal rabbit Neurofilament antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>AB1981</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-BrdU antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>VP-B209</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #2, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #5, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20915</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualization of mitochondrial dna replication in individual cells by edu signal amplification

Mitochondria 세포 에너지와 mitochondrial biogenesis의 핵심 규제 1-3 건강한 세포의 mitochondria 번호를 규제의 필수 구성 요소입니다됩니다. mitochondrial biogenesis 모니터링을위한 하나의 접근 방식은 mitochondrial DNA (mtDNA) 복제 4의 속도를 측정하는 것입니다. 우리는 mtDNA의 biogenesis를 공부하기 위해서는 각각의 세포에서 새로 합성 mtDNA를 라벨에 민감한 기술을 개발했습니다. 기술은 뉴런의 subcellular 구획 내에 mtDNA 복제를 시각화하는 tyramide 신호 증폭 (TSA) 8 프로토콜 5월 5일에서 7일까지 - ethynyl - 2&#39; - deoxyuridine (EDU)의 결합이 결합되어 있습니다. 5-7 레이블 에듀에 초기 클릭 반응 BrdU 에피토프 노출에 필요한 거친 산성 트리 트먼트 또는 효소가 소화를 요구하지 않기 때문에 에듀는 등 5 브로모 - 2 - deoxyuridine (BrdU) 같은 다른 thymidine의 analogs에 우수합니다 . 이두의 milder 라벨링은 다른 세포 마커 9-10와의 정관의 직접 비교하실 수 있습니다. mtDNA의 biogenesis를 시각화하고 계량하는 능력은 mitochondrial biogenesis 조절하고 약물 독성, 노화, 암 및 neurodegenerative 질병와 관련된 pathogenesis에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용되는 메커니즘을 조사를위한 필수 도구를 제공합니다. 우리의 기술은 감각 뉴런뿐만 아니라 다른 세포 유형에 적용됩니다. mtDNA의 biogenesis를 측정하는이 기법의 사용은 모두 정상 세포 생리학뿐만 아니라 장애인 질병 상태에 대한 이해를 발전에 중요한 의미가 있습니다.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification at JoVE.com

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

우리는 mtDNA의 biogenesis를 공부하기 위해서는 각각의 세포에서 새로 합성된 DNA mitochondrial (mtDNA)를 라벨에 민감한 기술을 개발했습니다. 기술은 뉴런의 subcellular 구획 내에 mtDNA 복제를 시각화하는 tyramide 신호 증폭 (TSA) 프로토콜과 함께 에듀의 결합이 결합되어 있습니다.

에듀 신호 증폭 개별 세포 Mitochondrial DNA 복제의 시각화

Mitochondria are key regulators of cellular energy and mitochondrial biogenesis is an essential component of regulating mitochondria numbers in healthy ...

visualization-mitochondrial-dna-replication-individual-cells-edu

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.8K 조회수.  University of Michigan. 우리는 mtDNA의 biogenesis를 공부하기 위해서는 각각의 세포에서 새로 합성된 DNA mitochondrial (mtDNA)를 라벨에 민감한 기술을 개발했습니다. 기술은 뉴런의 subcellular 구획 내에 mtDNA 복제를 시각화하는 tyramide 신호 증폭 (TSA) 프로토콜과 함께 에듀의 결합이 결합되어 있습니다.

비디오: Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

동물 커뮤니케이션 연구를위한 자동화된 대화형 비디오 재생

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

연구

신경과학

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

의 Proprioceptors의 시각화<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레와 Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

개별 피라미드 뉴런의 고 충실도 Optogenetic 제어하는​​ 방법<em&gt; 생체 내</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types that comprise the BBB; these cells have a very high-energy demand, which requires optimal mitochondrial function. In the case of disease or injury, the mitochondrial function in these cells can be altered, resulting in disease or&#160;the opening of the BBB. In this manuscript, we introduce a method to measure mitochondrial function in CVE cells by using whole, intact cells and a bioanalyzer. A mito-stress assay is used to challenge the cells that have been perturbed, either physically or chemically, and evaluate their bioenergetic function. Additionally, this method also provides a useful way to screen new therapeutics that have direct effects on mitochondrial function. We have optimized the cell density necessary to yield oxygen consumption rates that allow for the calculation of a variety of mitochondrial parameters, including ATP production, maximal respiration, and spare capacity. We also show the sensitivity of the assay by demonstrating that the introduction of the&#160;microRNA, miR-34a, leads to a pronounced and detectable decrease in mitochondrial activity. While the data shown in this paper is optimized for the bEnd.3 cell line, we have also optimized the protocol for primary CVE cells, further suggesting the utility in preclinical and clinical models.

Endothelial cell mitochondria are critical to maintain blood-brain-barrier integrity. We introduce a protocol to measure bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells.

대뇌 혈관 내피 세포의 생체 에너지 기능의 평가

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

꼬마 선 충 을 행동에 개별 뉴런의 비율 칼슘 이미징

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and can be delineated by certain histochemical and immunohistochemical methods. In this study, we highlight a method to isolate the cortex from mammalian brains and flatten them to obtain sections parallel to the cortical sheet. We further highlight selected histochemical and immunohistochemical methods to process these flattened tangential sections to visualize cortical modules. In the somatosensory cortex of various mammals, we perform cytochrome oxidase histochemistry to reveal body maps or cortical modules representing different parts of the body of the animal. In the medial entorhinal cortex, an area where grid cells are generated, we utilize immunohistochemical methods to highlight modules of genetically determined neurons which are arranged in a grid-pattern in the cortical sheet across several species. Overall, we provide a framework to isolate and prepare layer-wise flattened cortical sections, and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods in a wide variety of mammalian brains.

This article describes a detailed methodology to obtain flattened tangential sections from mammalian cortices and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods.

병합 된 포유류 외피가 대뇌 피 질의 모듈의 시각화

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.