We thank K. Delaney for comments on the manuscript. This work was supported by the National, Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Intramural Program.

1. 조직 수집 및 해부 <ol><li> 건조 효모를 포함하는 각각의 유리 병에서, 문화 (10) 성인 여성 2 ~ 3 일 동안 10 명의 남성으로 날아갑니다. 참고 : 잘 먹인 여성 파리를 유지하는 것은 전반적인 품질과 난소의 생산 수율을 향상시키고 박리를 촉진 할 것이다. </li><li> 여성은 이산화탄소 (CO 2) 패드 플라이에 날아 마취. </li><li> 입체경에서 RT 매체 해부 패드 (10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 슈나이더의 초파리 배지) 몇 방울을 놓는다. 살아 있고 건강한 조직을 유지하기 위해 매체의 모든 해부 절차를 실시한다. </li><li> 살찐 여성이 낮은 흉부에서 날카로운 미세 코 집게 비행 잡아. 복부에 조직이 노출 될 때까지 파리의 극단적 인 후방에서 부드럽게 예인선 집게의 또 다른 세트를 사용합니다. 다른 조직 (예를 들어 내장)에서 두 개의 난소를 분리합니다. 참고 : 각 난소 표시 작성이다 불투명 한 구조를16 ~ 20 부착 ovarioles의 라. </li><li> 시약의 침투를 강화 떨어져을 당겨 몇 번 ovariole 각각의 사이에 포셉의 팁을 전달하여 난소를 엽니 다. 다음 절차 중 조직의 손실을 최소화하기 위해 난소 내에서 연결된 ovarioles를 유지합니다. </li><li> 10 % FBS와 슈나이더의 초파리 배지 500 μl를 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 즉시 전송 난소. </li><li> 해부를 반복하고 각 microcentrifuge 관에서 10 ~ 15 난소를 수집합니다. </li></ol> 2. 에듀 라벨 <ol><li> 각 튜브의 매체를 대기음, 7 μM의 aphidicolin을 포함하는 10 % FBS와 슈나이더의 초파리 매체의 500 μL로 교체합니다. 주 : Aphidicolin는 미토콘드리아 DNA의 복제 (7), (12)에 영향을주지 않으면 서 DNA 폴리머 라제 α의 억제 핵 DNA 합성을 차단하는 데 사용된다. aphidicolin 농도까지 증가시킬 수있다70 μM 더 나은 억제를 달성했다. DMSO에 3-30 밀리미터 aphidicolin의 원액 최대 6 주 동안 -20 ℃에서 어둠 속에서 저장 될 수있다. </li><li> 매체를 변경하는 동안 그들이 솔루션에서 포장되어 있는지 확인 건강한 난소를 유지합니다. 단계 2.6을 통해 10 % FBS와 슈나이더의 초파리 매체를 사용합니다. </li><li> 부드러운 회전 벤치 탑 로커에 실온에서 3 시간 동안 난소를 품어. <ol><li> 약물 치료, 예를 들어 미토콘드리아 uncoupler 보닐 시안화 -4- 트리 플루오 로메 톡시 페닐 (FCCP) 들어 aphidicolin 처리 2 시간 후 배지에 약물을 적절한 농도 (예를 들면, 10 μM FCCP)를 추가한다. 또 다른 1 시간 동안 배양을 계속합니다. </li></ol></li><li> 또는 약물없이 매체를 포함 aphidicolin를 제거합니다. 간단히 두 번 매체와 난소를 (aphidicolin이 필요하지 않습니다) 헹군다. </li><li> 1 ml의 매체를 포함하는 10 μM 에듀 7 μM의 aphidicolin를 추가하고 incubatin 계속2 시간 동안 실온에서 g. -20 ° C에서 (DMSO)에 10 mM의 듀 원액을 저장합니다. </li><li> 에듀과 aphidicolin를 포함하는 매체를 제거합니다. 3 분 각각에 대해 두 번 (aphidicolin없이) 매체를 씻으십시오. </li></ol> 3. 조직 고정 및 Permeabilization <ol><li> 인산 완충 식염수 (PBS, pH 7.4의) 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 제조 하였다. 참고 : 사전 득점 앰플에 저장 상용 가능한 파라 포름 알데히드를 사용했다. 새로운 앰플을 열고 사용하기 전에 4 %로 희석. 주의 : 포름 알데히드는 독성이; 그것은 피부와 눈 보호 흄 후드에서 처리되어야한다. </li><li> 부드러운 회전 실온에서 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드와 난소를 수정합니다. </li><li> 정착액을 제거하고 5 분마다 시간 동안 PBS에서 3 % BSA 1 ㎖에 두 번 난소을 씻는다. </li><li> 조직을 Permeabilize 하시려면 위해, 세척 용액을 제거하고 PBS에서 0.5 % 트리톤 X-100 1 ㎖를 추가한다. 실온에서 20 분 동안 인큐베이션. </li><li> permeabilization 솔루션을 제거하고 1 ㎖에 두 번 세척PBS에서 3 % BSA의. </li></ol> 4. 에듀 검출 주 : 듀 검출 &quot;클릭&quot;화학을 기반으로하는 구리 (I)는 EDU의 말단 알킨 그룹 형광 지드 추가 [3 + 2] 고리 화 (13), 촉매 반응 및 형광 분자는 후속 검출을 실시한다. 쉽게 비 촉매의 Cu (II) 종에 산화 구리 (I), 이후, 반응을 촉매하는 데 필요하며, 이는 구리 (I)을 얻었다 반응계에서의 Cu (II), 황산 줄이는 것을 권장한다. 즉, 구리 (II), 황산은 아스코르브 산 (본원에서 &quot;첨가물 버퍼&quot;)를 생성하기 위해 구리 (I) 등의 환원제의 존재 하에서 사용된다. <ol><li> 실험 전에 (알렉사 플 루어 488 아 지드, 알렉사 플 루어 &quot;염료 아 지드&quot;이하로 명명 된 바람직한 형광에 따라 555 아 지드 또는 다른 사람), 에듀 반응 버퍼와 에듀 버퍼 첨가제 알렉사 플 루어 아 지드의 작업 용액을 제조 제조업체에 따라명령. <ol><li> 70 ㎕의 DMSO에 염료 지드를 재구성한다. 최대 1 년 -20 ° C에서 작동하는 솔루션을 저장합니다. </li><li> 탈 이온수로 10 배 에듀 반응 버퍼를 희석하여 신선한 에듀 반응 버퍼를 준비합니다. 참고 : 사용 후 4 ° C에서 나머지 1 배 솔루션을 저장합니다. 1 배 솔루션은 최대 6 개월 동안 안정하다. </li><li> 완전 탈 이온수 2 ㎖ 중의 분말을 용해하여 듀 버퍼 첨가제의 10 배 스톡 용액을 만든다. 참고 :이 원액 1 년까지에서 -20 ° C에 대한 안정적입니다. 상기 용액이 갈색을 개발하면이 저하하고 폐기되어야한다. </li></ol></li><li> 신선한마다 EDU 반응 칵테일을 준비하고, 준비 15 분 이내에 사용한다. 재현 가능한 결과를 달성하기 위해, 반응 성분이 같은 비율을 유지하고 있는지 확인. <ol><li> 신선한 1 배 EDU는 탈 이온수 (단계 4.1.3에서 제조)를 10 배 원액 1:10 희석 첨가제 솔루션을 버퍼링합니다. 이 S 사용같은 날 olution. </li><li> 하기의 성분을 조합하여 듀 반응 칵테일 1 ml의 준비 : 860 μL 1X 듀 반응 완충액 40 μL에 CuSO 4 2.5 μL 염료 지드 100 ㎕의 1X 듀 버퍼 첨가제. 주 : 재료가 최적의 성능을 보장하기 위해 추가되는 것이 중요하다. </li></ol></li><li> 3 % BSA와 PBS를 제거하고 각 튜브에 EDU 반응 칵테일의 0.5 ml를 추가합니다. 부드러운 회전을 실온에서 30 분 동안 인큐베이션. 빛으로부터 보호 샘플을 유지합니다. </li><li> 에듀 반응 칵테일을 제거하고 PBS에서 3 % BSA 1 ㎖로 한 번 씻는다. </li><li> 1 ml의 PBS로 한번 샘플을 세척한다. </li></ol> 5. 항체 라벨링 참고 : 에듀 염색 후 항체 라벨링을 수행합니다. 추가 염색이 요구되지 않는 경우, 하나는 직접 장착 및 영상을 진행할 수 있습니다. 모든 샘플들이 다음 절차에서 빛으로부터 보호하는 것이 중요하다. <ol><li> 세척 용액을 제거합니다. 30 분 동안 PBS에서 0.2 % BSA, 0.1 % 트리톤 X-100을 함유하는 차단 용액에 1 ml의 난소를 차단. </li><li> 차단 솔루션을 제거하고 차단 솔루션에 희석 차 항체 (항체 α 예를 들어, 마우스 ATP 합성 효소 서브 유닛, 1 : 1,000 희석)로 교체합니다. 4 ° CO / N에서 어둠 속에서 품어. </li><li> 솔루션 3 회, 10 분마다 차단의 1 ml의 샘플을 씻으십시오. 백그라운드를 최소화하기 위해, 30 분마다 두 번 더 세척 하였다. 차단 솔루션을 제거합니다. </li><li> 실온에서 2 시간 동안 : (200 희석 예를 들어, 염소 항 - 마우스 알렉사 플 루어 568 차 항체, 1) 차단 솔루션에 희석 차 항체와 함께 품어. 주 : 듀에 연결된 하나 이상의 다른 색상을 사용한다. </li><li> 단계 5.3에서 수행되는 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 1 ml의 PBS로 씻어 한번 세제를 제거합니다. </li></ol> 6. 장착 및 이미지 <ol><li> 조심스럽게 모든 PBS와 IMM 제거ediately 50 μL가 (또는 DAPI없이) 매체를 장착와 난소를 다룹니다. 참고 : ovarioles가 서로 분리되는 동안 강화하지 않는 장착 매체를 사용합니다. 난소 주일까지 4 ℃에서 장착 가능 매체에 저장 될 수있다. </li><li> 피펫 팁의 단부를 절단하고, 현미경 슬라이드 상에 조심스럽게 난소 전송할 사용. </li><li> 실체 현미경 아래에서 날카로운 미세 코 집게와 완전히 분리 된 각각의 ovariole. 후방 끝 단계 14 성숙 계란 챔버에 연결 조직을 제거합니다. 젊은 계란 챔버 앞쪽 끝과 투명에 있습니다. </li><li> 이들이 서로 겹치지 않도록 집게 계란 챔버 정렬. </li><li> 천천히 샘플의 상단에 # 1.5 유리 커버 슬립을 낮 춥니 다. 설치 매체는 실온에서 몇 시간 동안 중합 할 수 있습니다. 투명 매니큐어로 밀봉합니다. </li><li> 이미지는 촬영에 앞서 4 ° C에서 다음 날, 또는 저장소를 슬라이드. </li><li> 공 초점 마일에서 시각화63X 기름 침지 목적으로 croscope. 입체 Z - 스택 이미지를 캡처합니다. 참고 : EDU는 상피 칼집에서 나중에 단계 달걀 챔버 및 배경 형광의 신호 강한이 있습니다. 특정 germarium에 EDU 라벨을 조사 할 때, 하나에 의해 중복 또는 다른 조직 또는 그 이후의 단계 달걀 챔버에 가까운 germariums을 피해야한다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

EDU 라벨링 신규 합성 DNA에 혼입 및 뉴 클레오 시드 유사체의 염색에 기반 증식 세포에서 DNA 합성을 검출하기위한 신규하고 효과적인 방법이다. 이 방법은 빠르고 매우 민감한 점에서의 BrdU 라벨링 방법보다 우수하다. 더욱 중요한 것은 10. 역사적 BrdU의 라벨링에 우수한 대안으로, 듀 표시는의 S-단계에서 핵 DNA 복제를 연구에 사용 된, 조직 (9)를 장착 전체적으로 양호한 구조적 보전 효율적 듀 염색 침투를 허용 세포주기. Aphidicolin는 S 단계 12-15에서 핵 DNA 복제의 주요 효소 인 DNA 폴리머 라제 α의 억제제이다. 미토콘드리아 DNA의 복제 처리 aphidicolin 둔감하다 DNA 폴리머 라제 γ에 의해 수행된다. 따라서, 이전에와 듀 배양 동안 aphidicolin 치료는 크게 핵 DNA에 듀 설립을 억제 하였다. 그것은해야적절하게 저장, 핵 DNA 복제를 억제 aphidicolin의 효능은 우리의 손에 변수 인 경우 aphidicolin 몇 주 동안 안정 수도있다. 추가 데이터 분석에서 강한 핵 DNA 표지와 ovarioles 또는 달걀 챔버는 제외한다. 미토콘드리아 DNA의 복제를 용이하게 또한 세포질 총 부피로 정규화 듀 puncta의 수를 카운트함으로써 미토콘드리아 DNA 복제의 수준을 정량화하기위한 간단한 방법을 수득 세포질에서 puncta에 같이 시각화 될 수있다. 이미징 소프트웨어는 자동으로 큰 데이터 세트의 계산 분석에 특히 유용 현미경 이미지에서 듀 puncta의 식별에 적용될 수있다. 핵 DNA 복제의 불완전 억제 염색체에 별개의 궤적에서 듀 통합으로 이어질 및 핵 내부 puncta에로 표시 할 수 있기 때문에,주의 사항,주의해야한다. 또한 다른 경우, 에듀의 강도는 repli에 혼입배경과 소음이 높은이 될 수있는 동안 상호간의 미토콘드리아 DNA는 약한 될 수 있습니다. 따라서, 자동 이미지 분석에 대한 개별 매개 변수는 신중하게 정의되어야한다. 또한 이미지가 적절한 듀 puncta의 식별되어 있는지 확인하기 위해 훈련 된 눈으로 검사하는 것이 좋습니다. 초파리 oogenesis 동안 새로 합성 된 미토콘드리아의 시각화 미토콘드리아 DNA 복제가 약리 유전 또는 섭동 다양한 실시 파리의 실험을 수행하여, 생리적 또는 병리 적 상태에 의해 규제되는 방법을 조사 할 기회를 제공한다. 너도 알면서 T300I 11 : 이전의 연구에서, EDU의 통합 분석은 미토콘드리아 DNA 돌연변이 초파리 산에서 수행되었다. 또한, 미토콘드리아 막 잠재력을 방해하기 위해, 난소은 미토콘드리아 uncoupler FCCP 또는 2,4- 디 니트로 페놀 (DNP) 이전 에듀에 통합의 다양한 농도로 처리 하였다. 실험 목적에 따라약물의 특성은 다른 방법이 효과적인 전달을 위해 채택 될 수 있습니다. 성인 초파리를 들어, 약물이 증기 (예를 들면, 에탄올 및 코카인)로 표현 될 수있다 (16, 17) 또는 약물이 신속하게 본체 (18)에 걸쳐 확산되어 복부에 주입 될 수있다. 가장 일반적인 방법은 약물 즉석 식품 또는 수크로오스 / 약물로 포화 된 여과지에 첨가된다는 것이다. 예를 들어, 미세 소관 조립체 콜히친의 억제제, 난소 절제술 19 전 2-3 일 동안은 파리에 공급 하였다. 따라서, 상기 약물 전달 방법을 평가하고 적절한 농도를 선택하는 것이 중요하다. 초파리의 난소에서 미토콘드리아 DNA 복제의 성공 이미징을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 단계는 신중하게 실행해야합니다. 제일, 해부 및 에듀 통합 동안 난소의 생존과 건강을 유지하는 것은 필수적이다 (1 단계와 2 단계). FBS와 슈나이더의 초파리 배지 RT로 가온 할 필요사용하기 전에. 하나는 계란 챔버 및 해부 도구 또는 피펫 팁 사이의 직접 접촉을 최소화해야한다. 난소는 탈수를 방지하기 위해 솔루션에서 모든 시간을 몰입해야한다. 조직이 쉽게 발생할 수 있습니다 잘못 취급하면 희미하거나 더 형광 신호합니다. 조직 마운팅 공정 중에 ovarioles들은 서로 분리되어야하며, 현미경 슬라이드에 퍼져. 계란 챔버가 서로 위에 쌓인 않았는지 확인하십시오. 우리는 단 14 이상으로 계란 챔버가 작은 듀 통합을 표시 것으로 나타났습니다. 또한, 때문에 큰 크기의 후반 단계 달걀 챔버는 종종 이웃 젊은 달걀 챔버의 초점이 맞지 원인. 따라서 후반 단계 달걀 챔버 폐기하는 것이 좋습니다. 여기에서 우리는 초파리 성인 난소에서 미토콘드리아 DNA를 복제 표시에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 다양한 유전 적 및 약리학 섭동하에 미토콘드리아 DNA 복제의 간단한 정량 허용발달 미토콘드리아 생물 및 미토콘드리아 DNA 상속을 기본 메커니즘을 해부하는 데 유용 할 것입니다.

핵 게놈 외에도, 각 진핵 세포는 미토콘드리아 매트릭스에서 작은 원형 DNA의 사본의 수천을 포함하고 있습니다. 미토콘드리아 DNA (미토콘드리아)은 전자 전달계의 필수 서브 유니트를 인코딩하는 동안, 복제 및 미토콘드리아 DNA의 전사에 대한 모든 요소를 ​​포함하는 미토콘드리아 프로테옴의 대부분은 핵 유전자에 의해 코딩된다. 상속 멘델 법칙을 따른다 핵 게놈 달리, 동물 미토콘드리아 게놈은 모계를 통하여 독점적으로 상속된다. 따라서 미토콘드리아 DNA가 증식과 여성의 난자를 통해 한 세대에서 다음 세대로 전달하는 방법을 이해하는 것이 근본적으로 중요하다. 그러나, 미토콘드리아 DNA 복제가 여성 생식계에서 조절되는 방식을 계속 논의가있다. 또한, 미토콘드리아 전송을 위해 널리 미토콘드리아 병목 이론 원시 생식 세포에서 미토콘드리아의 인구가 비교적 적은 수 두린으로 서브 샘플링되는 것을 제안g 개발 1 2. 또한, 미토콘드리아 DNA 복제 시간적 및 공간적 oogenesis시 규제 것을 의미한다. 따라서, 배아 발달 동안 미토콘드리아 DNA 복제의 시츄 검출 미토콘드리아 유전 메카니즘의 이해를 용이하게한다. 초파리 oogenesis은 미토콘드리아 DNA의 복제 및 전송을 연구하는 유전자 다루기 쉬운 시스템을 제공한다. 두 초파리 난소 각각, 산란율의 기능적 단위 ovarioles 3이라고 달걀 챔버 16-20 독립적 문자열 (도 1a 참조)가있다. 각 ovariole은 앞쪽 끝이 germarium라는 구조로 구성되어있다 oogenesis의 진보적 인 선형 조직이 포함되어 있습니다. germarium 더 뚜렷한 발달 단계에서 배아 세포를 포함하는 4 개의 영역으로 구분된다. 제 1 지역에서, 배아 줄기 세포로 알려진 C 딸 세포를 생성하는 비대칭 분할 통과ystoblasts. 영역 (2a)는 최종 분할을 완료 한 cystoblasts이 포함되어 있습니다. Cystoblasts는 부문 생산 16 셀 그룹의 네 라운드를 받아야. 16 세포는 링 운하라는 세포질 다리로 서로 연결된 상태로 유지됩니다. 다른 15 배수체 간호사 세포로서 개발 중에 만 셀들 중 하나는 난자와 같은 분화 얻어. fusome라고도 필수적인 세포질 구조는, 링 수로의 형성을 촉진 낭종 극성 간호사 난자 세포 상호 작용 4,5-를 결정하는 것이 제안되어있다. 낭종이 영역 (2b)를 향해 이동함에 따라, 낭종 구조는 germarium의 전체 폭에 걸쳐,보다 모낭 세포와 관련된다. germarium 구조는 제 신진 달걀 챔버를 포함하는 영역 (3)으로 끝난다. 그 후, 달걀 챔버 (14) 형태 학적으로 서로 다른 단계에서 ovariole을 통해 진행 germarium의 뒤쪽 끝에서 조립된다. 모세포의 성장 WH 간호사 세포에 의존무형 문화 유산 수송 단백질의 mRNA와 난자에 링 운하를 통해 endomembrane 구조 (예를 들어, 골지). 초파리 oogenesis 동안, 각 16 세포 낭종 내의 미토콘드리아의 일부가 fusome과 관련이 있음을 발견, 링 운하를 통해 이동 Balbiani 바디 (6)라는 큰 질량에 하나의 난자에 전달했다. 이 현상은 여성의 난소 통하여 미토콘드리아 상속의 품질 관리에 기여하는 것이 제안되었다. 미토콘드리아 DNA 합성의 검출은 세포의 DNA에 표지 된 DNA의 전구 물질의 결합에 의존한다. 전통적으로, 티미 딘, 5- 브로 모 -2&#39;- 데 옥시 우리 딘의 뉴 클레오 사이드 유사체 (BrdU의)은 조직 배양 세포에서 미토콘드리아 7,8 복제 라벨을 사용 하였다. 그러나, 항체 - 기초의 BrdU 라벨링 특히 전체 마운트 조직 염색을 위해, 몇 가지 제한을 나타낸다. BrdU의 라벨의 하나의 주요 단점은 노출 DNA 변성을 필요로한다는 것이다BrdU 양성 에피토프이를 방지 BrdU의 항체에 의해 검출 될 수 있도록. 시편은, 시편의 구조를 중단하고 다음 염색 절차 9 복잡 수 화학 물질 (예를 들면, 염산 또는 메탄올과 아세트산의 혼합물)의 DNase로, 열, 또는 분해 등의 가혹한 변성 조건 하에서 처리되어야 10. 여기서, 대안 티미 딘 유사체 5-에 티닐 -2&#39;- 데 옥시 우리 딘 (EDU)은 초파리 성인 난소의 미토콘드리아 DNA 복제에 라벨을 사용한다. 이 방법은 빠르고 매우 민감하다. EDU는 쉽게 DNA 복제시 세포 DNA에 통합됩니다. 다음 검출은 &quot;클릭&quot;반응에 기초하는 구리 (I)은 단말기 알킨 기 및 형광 지드 (10) 사이의 공유 결합 반응을 촉매 반응. 반응이 시험편의 변성이 필요하지 않기 때문에 양호한 구조적 보존을 허용한다. 염료 (A)의 또 사이즈zide는 1/500 전체 실장 조직 빠르고 효과적인 침투를 가능하게하는 항체 분자 (10)의 그 것이다. 우리는 초파리 oogenesis 동안 미토콘드리아 DNA 복제를 감지하는이 방법을 사용하고 복제에 의존하는 미토콘드리아 DNA 선택적 상속 메커니즘을 제안하는 우리를 인도 초파리의 난소 (11)의 germarium 지역에서 눈에 띄는 공간 패턴을 발견했다. 우리는 여기에서 초파리의 난소에서 미토콘드리아 DNA 복제의 듀 표시에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. (: 너도 알면서 T300I 산) (11)뿐만 아니라 잠재적 인 미토콘드리아 막을 분산하고 잠재적으로 미토콘드리아 DNA 복제를 방해 미토콘드리아 uncouplers, 다양한 치료 프로토콜의 응용 프로그램을 설명하기 위해, 우리는 또한 미토콘드리아 DNA a를 미토콘드리아 DNA 돌연변이 초파리에서 복제를 테스트했다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10100-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pair of Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aphidicolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0781</td>
			<td>Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGF-3190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10337</td>
			<td>EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ATP synthase subunit &#945; antibody, (15H4C4)</td>
			<td>MitoSciences</td>
			<td>Ab14748</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Hts antibody (clone RC)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>hts RC</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11004</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-038-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Elf</td>
			<td></td>
			<td>Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ labeling of mitochondrial dna replication in drosophila adult ovaries by edu staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

위의 프로토콜은 초파리 oogenesis 동안 미토콘드리아 DNA 복제를 나타내는 미토콘드리아 (그림 1B-C)과 관련된 반점 구조의 시각화 할 수 있습니다. ATP 합성 효소 알파 서브 유닛 (그림 2)에 대한 염색하여 표시 미토콘드리아와 지역화 듀 puncta에. 관찰 된 신호는 검증, 에티 디움 브로마이드 (11), 미토콘드리아 DNA 복제 (14)에 대한 억제제로 치료 난소에 존재했다 이들 puncta의 mtDNA.Aphidicolin는 미토콘드리아 DNA 복제 (그림 2)에 영향을주지 않고 핵 DNA 염색을 억제하는 데 사용 된 복제 참으로 레이블입니다. aphidicolin 치료하지 않으면, 강렬한 에듀 신호는 핵 라벨 및 미토콘드리아 DNA의 puncta의 거의 (그림 3) 검출되었다. 그러나 aphidicolin의 존재하에 핵의 혼입을 대폭 감소시키고, 미토콘드리아와 관련된 많은 puncta에 관찰되었다. (그림 1B)의 미토콘드리아 DNA 복제의 높은 수준이 있습니다. 그러나, 특히, 미토콘드리아 DNA 복제는 germarium의 공간 패턴을 표시. 듀 puncta의의 숫자로 나타낸 바와 같이, 거기에 germarium의 영역 (1)의 미토콘드리아 DNA 복제의 중간 수준이지만, 거의 영역 (2a)에서 더 듀 통합 (그림 1C). 낭종이 germarium에서 영역 (2b)까지 아래로 이동함에 따라, 미토콘드리아 DNA 복제를 재개 영역 (2b)의 후방 낭종에 듀 puncta의 개수는 영역 (2a) (도 1C)에서보다 훨씬 높았다. 후 리 타이 샤오 (HTS) 단백질에 의해 스테인드 구체적으로, 집중적 인 듀 통합은 링 운하와 fusome 구조 주위에 집중했다. 미토콘드리아는 germarium의 영역 (3)에 높은 수준으로 복제 보관하고 (도 1C) 과 특이의 관계를 설명하기 위해IC 유전자 또는 미토콘드리아 증식 치료는 초파리 난소 유전자 조작 또는 약품 처리를 실시 할 수있다. 우리는 FCCP, 미토콘드리아 막 잠재력을 발산 고전 미토콘드리아 protonophore, 서로 다른 농도의 난소를 처리 하였다. 대조군으로서, DMSO는 미토콘드리아 DNA의 복제 (도 4a)에 아무런 영향을 미치지 않았다. FCCP의 높은 용량 (10 μM)는 거의 완전히 germarium (그림 4D)를 통해 미토콘드리아 DNA 복제를 고갈. 그럼에도 불구하고, FCCP (2 또는 5 μM)의 낮은 농도는 지역 2B, 3 미토콘드리아 중단에 더 민감 제안, 영역 (b) 및 (3) (그림 4B-C)의 영역 1에서 미토콘드리아 DNA 복제에 약간의 영향 만 억제 복제를 가지고, 또는 그들은 상대적으로 느린 복제 속도론을 유지한다. 상기 결과는 미토콘드리아 DNA의 복제 미토콘드리아 활성과 관련된 것으로 나타났다. 특히, germarium의 다른 지역은 미토콘드리아 꼬마 도깨비에 다르게 반응airment. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig1.jpg" /> 그림 1. 미토콘드리아 DNA의 초파리 oogenesis 동안 복제. 초파리 ovariole의 (A) 다이어그램 및 germarium의 확대 전망. 계란 챔버의 연속적인 발달 단계를 후부, 오른쪽, 앞쪽 왼쪽에서 ovariole을 보여줍니다. germarium에서 fusome (적색), 배아 줄기 세포 (파란색), 미토콘드리아 (녹색), (위치, fusome 구조 미토콘드리아 클러스터 인식 파선) 미래 난자, 낭종 (복숭아) 네 발달 영역 현상은 도시 . (B) HTS-RC, 링 운하와 fusome 마커에 대한 야생형 듀에 의해 표시 ovariole과 항체의 대표 Z - 스택 투영합니다. aphidicolin의 존재에서, EDU는 미토콘드리아 DNA (화살촉) 및 핵 (화살표)로 통합되었다. 스케일 바, 10 μm의.(C) B의 박스 영역에 설명 germaria의 확대 전망. 네 가지 발달 영역이 표시됩니다. 스케일 바, 5 μm의 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig2.jpg" /> aphidicolin 치료와 듀 통합 시각화 초파리 germarium 그림 2. 미토콘드리아 DNA 복제 (A) -. (D) 에듀의 결합을 나타내는 야생형 germarium 대표 공 촛점 섹션 (녹색, B), 미토콘드리아, ATP 합성 효소 알파 서브 유닛 염색으로 표시 DNA 중합 효소-α 억제제 aphidicolin와 사전 배양과 DAPI 염색 (파란색, D)으로 표시 (적색, C) 및 핵. (A &amp;# 39 ;-D &#39;)의 박스 영역의 확대 된 이미지 (A) 듀 통합 (B을 보여주는&#39;), 미토콘드리아 (C &#39;) 및 핵 (D&#39;). aphidicolin의 존재하에 핵 도입 (화살표)은 감소되고, 많은 puncta의 미토콘드리아 (화살촉) 내에 국부적 하였다. 스케일 바, 10 μm의. 그림 (11)에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig3.jpg" /> 도 3 미토콘드리아 DNA 복제는 거의 aphidicolin 처리없이 초파리 germarium에서 검출 (A) -. (D) 듀 혼입 (녹색)에 나타낸 야생형 germarium 대표 촛점 부는 미토콘드리아는로 표시DNA를 중합 효소-α 억제제 aphidicolin의 부재 DAPI 염색 (청색)로 표지 ATP 합성 효소 알파 서브 유닛 염색 (적색) 및 핵. (A&#39;-D &#39;) 확대 된 (A)의 박스 영역의 이미지 듀 통합 (B을 보여주는&#39;), 미토콘드리아 (C &#39;) 및 핵 (D&#39;). aphidicolin없이 강렬한 에듀 신호 라벨 핵 (화살표)과 미토콘드리아 DNA의 puncta의 거의 검출되었다. 스케일 바, 10 μm의. 그림 (11)에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig4.jpg" /> 도 4 미토콘드리아 uncoupler는 미토콘드리아 DNA의 복제를 저해. 야생형 germarium를 나타내는 대표 Z 스택 프로젝트 DMSO 처리(A) 또는 제 2 μM (B), 5 μM (C), 듀 혼입 중에 10 μM (D)의 농도에서 미토콘드리아 uncoupler FCCP. 2 μM FCCP (B)로 처리 영역 (b)의 손상 에듀 라벨을 참고하고, 지역 2B, 5 μM의 FCCP 치료 (3) 모두 (상자에 설명). 네 가지 발달 영역이 표시됩니다. 화살표, 핵 DNA; 화살촉, 미토콘드리아 DNA. 스케일 바, 10 μm의. 그림 (11)에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

에듀 염색에 의한 초파리 성인 난소에서 미토콘드리아 DNA 복제의 제자리 라벨에

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

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Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

DNA 콘텐츠 측정에 의한 포유 동물 복제 타이밍의 게놈 전체의 결정

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

연구

유전학

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

보온재 가닥 DNA 합성의 속도론<em&gt; 체외</em&gt;는 박테리오파지 T7 복제 단백질에 의해

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

DNA 복제 타이밍 Zebrafish Vivo에서 모델 시스템으로 사용 하 여 프로 파일링

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Here, we present a protocol to spatially and temporally assess the presence of viable microbiota in tick guts using a modified whole-mount in situ hybridization approach.

제자리에 전체 산 교 잡에 의해 틱 용기에 Microbiota의 시각화

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

Drosophila를 사용하여 질병 관련 희소한 인간 이체의 생체 내 기능적인 연구

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...