우리는이 모델을 개발 지침과 제안을 G. O 툴 감사하고 싶습니다. 이 작품은 낭성 섬유증 재단 (GGA, STANTO07RO 및 BAS에 STANTO08GA에 ANDERS06F0), 국립 보건원 (GGA 및 BAS에 R01 - HL074175에 T32A107363)에서 지원하고,되었다 바이오 메디컬 연구 우수 연구 자원 센터를위한 국립 센터 (꼬브르 BAS에 P20 - RR018787).

1. 정적 공동 문화 Biofilm 모델 <ol><li> 정적 공동 문화 Biofilm 모델 1 원래 ΔF508 - CFTR 돌연변이 2,3,4에 대한 CF의 homozygous와 개인의 발전 세포를 영원히 아르 CFBE41o - 세포 (CFBE 세포)를 사용합니다. CFBE 세포가 / 잘 6 잘 조직 배양 플레이트 또는 10% 태아 소 혈청과 보충 최소한의 필수적인 매체 24 잘 조직 배양 플레이트 (멤) 2 X 10 5 10 6 세포의 농도에 씨앗을해야합니다 2mM L - 글루타민, 50 U / ML 페니실린, 50 μg / ML의 스트렙토 마이신. 우리는 6 자 접시 24 - 잘 접시에 잘 당 0.5 ML 매체에서 잘 당 1.5 ML 매체를 사용합니다. </li><li> 세포가 37 성장해야 ° C, 5 %는 박테리아와 접종 전에 합류 monolayer를 형성 70~10일 2 -95 %의 공기를 CO. 매체 2-3일마다 변경해야합니다. 이러한 조건은 합류 monolayer과 꽉 분기점의 형성으로 이어질에 표시하고 있습니다. </li><li> 37 18 시간 동안 5 ML의 LB의 P.의 녹농균이라는 박테리아의 성장 ° C 200 rpm으로 보육 흔드는에. 이러한 조건에서, P. 녹농균이라는 박테리아의 문화는 일반적으로 5x10 9 CFU / ML의 밀도에 도달합니다. </li><li> 세균 접종 들어, CFBE 세포에서 매체를 제거하고 두 MM L - 글루타민 (현미경 매체)에 보충 페놀 레드없이 멤의 동일한 볼륨을 추가합니다. 콘플루앙 CFBE의 monolayers는 P.과 주사 아르 원래 씨앗 CFBE 세포의 수가 약 30:1 상대의 감염의 다중성에 녹농균이라는 박테리아. 이것은 X 1.5 ML 멤에서 10 7 CFU / ML / 음 6 잘 접시와 1.2 X 10 0.5 ML 멤 7 CFU / ML / 잘 24 - 잘 접시를위한 2 equates. </li><li> 37에서 1 시간 동안 접시를 품어 ° C, 5 % 2 -95 %의 공기를 CO. </li><li> 1 시간 부화 후, 뜨는은 0.4 %의 아르기닌과 보충 신선한 현미경 매체로 제거하고 교체해야합니다. </li><li> 37 품어 ° C, 5 %는 여러 시간 지점 (최대 약 8 시간) 2 -95 %의 공기를 CO와 위상 콘트라스트 현미경을 사용하여 CFBE의 monolayer의 무결성을 분석할 수 있습니다. 기도 세포가 아닌 합류있다면, P. 녹농균이라는 박테리아는 빠르게 (분 이내) 세포의 basolateral 표면에 액세스하고 세포 무결성을 파괴합니다. P.과 접종 constitutively epifluorescence 또는 공촛점 현미경에 의해 시각 수있는 형광 biofilm의 microcolonies에서 GFP의 결과를 표현하는 녹농균이라는 박테리아의 변종. </li><li> biofilm의 세균 CFU는 planktonic 박테리아를 제거하는 인산염 버퍼 호수 (PBS)와 공동 문화에게 2-3 번 세척하여 결정하실 수 있습니다. 세척 후, 트리톤은 10~15분을위한 PBS 또는 멤에서 X - 100 상피 세포를 lyse 및 biofilm을 해산하기 위해 0.1 %과 치료. </li><li> 3 분 소용돌이와 lysate 일련 dilutions을 준비합니다. 플레이트이 LB 한천에 dilutions 37에서 밤새 품어 ° C. CFU를 확인하려면 다음 날 식민지를 계산합니다. </li></ol> 2. 플로우 셀 공동 문화 Biofilm 모델 <ol><li> 흐름 전지 공동 문화 Biofilm 모델 (흐름 분석)는 CFBE 세포에게 5 수용할 수있는 표준 biofilm 흐름 셀 장치의 변경을 포함한다. </li><li> 깨끗한 100 ML 비커에 여러 개의 40 mm 직경의 유리 coverslips를 놓습니다. 20 분 건조 사이클에 알루미늄 호일과 압력솥 2 레이어로 단단히 커버. </li><li> 세포 배양 후드에서 근무, 살균 60 mm 직경의 플라스틱 그릇에 에탄올 씻어 포셉과 장소를 사용하여 비이커에서 하나 살균 coverslip 잡아. </li><li> 아래에 갇혀있는 모든 거품을 제거하고 플라스틱 접시의 바닥에 coverslip을 강제로 피펫의 끝에있는 coverslip에 누르면, 미리 예열 세포 성장 매체 3 ML을 추가합니다. </li><li> 시드 2x10 6 접시 당 세포 및 앞뒤로 부드럽게 요리를 흔들. 접시의 측면에 대한 세포를 centrifuging 방지하기 위해 소용돌이 치는 마십시오. </li><li> 37 ° C에서 5 % CO 2 -95 % 공기 인큐베이터에있는 접시를 놓고 8-10일 3 ML 신선한 성장 매체와 매일 세포를 피드. 세포는 유리 coverslip에 합류 monolayer를 형성합니다. </li><li> P. 그로 37 18 시간 동안 5 ML의 LB에 녹농균이라는 박테리아 ° 200 rpm으로 보육 쉐이크에 C. 이러한 조건에서, P. 녹농균이라는 박테리아의 문화는 일반적으로 5x10 9 CFU / ML의 밀도에 도달합니다. 우리는 P.을 사용 녹농균이라는 박테리아 스트레인 PAO1는 GFP 6 제정 표현 pSMC21 플라스미드를 들고. </li><li> 멸균 microcentrifuge 관에 세균성 문화 1 ML을 추가합니다. 3 분위한 6,000 rpm으로 원심 분리기와 현미경 매체 1 ML에 두 박테리아 펠렛을 씻으십시오. </li><li> ~ 5x10 8 CFU / ML의 농도를 달성하기 4.5 ML 현미경 매체로 세탁 및 resuspended 박테리아의 0.5 ML를 희석. </li><li> 라이브 세포의 관찰실시간으로 연동 펌프 (시간 연장 길이에 대한 영양소의 흐름을 보장하기 위해)와 온도 컨트롤러에 결합 이미징 챔버가 필요합니다. 우리는 Bioptechs FCS2 (폭트 라이브 셀) 적절한 길이로 16분의 1과 낮은 흐름 마이크로 관류 펌프로 일 C - 플렉스 튜빙 인하를 연결하고 불임에 대한 autoclaved 챔버 및 FCS2 챔버 컨트롤러를 통해 온도 규제를 사용합니다. 우리는 현미경 바로 옆에 위치한 37 ° C의 물을 욕조에있는 입력 소스 매체 보관하십시오. </li><li> 흐름 챔버를 조립. FCS2 챔버는 자동 잠금 자료 (이미징 동안 무대 어댑터에 앉아있는)과 재관류 튜브와 챔버 컨트롤러에 연결된 상반신을 포함합니다. 챔버가 넘는 이성을 상실되기 전에 거꾸로 조립 무대 어댑터에 배치됩니다. 거꾸로 그래서 재관류 튜브가 표시되는 것을 챔버의 위쪽 절반을 보유하고 재관류 튜브에 0.75 - mm 두께 고무 가스켓의 통관 구멍을 맞춥니다. 홈 붙이 사이드가 있는지 확인하고, 고무 가스켓 위에 챔버와 함께 제공된 microaqueduct 슬라이드를 스택, 그리고 슬라이드 상단에있는 다른 고무 가스켓을 넣으십시오. 두께와이 두 번째 가스켓의 내부 형상은 챔버의 볼륨을 결정합니다. 우리는 일반적으로 30 mm 원형 내부 기하학과 0.75 - mm 두께의 고무 가스켓과 함께 작동합니다. </li><li> 1 ML 추가 사전 예열 (37 ° C) 슬라이드의 중앙에 현미경 매체. </li><li> 세포 문화 인큐베이터에서 60 mm 요리를 검색, 지출 매체를 제거하고 미리 예열 현미경 매체 3 ML과 함께 한 번 세포를 씻으십시오. 이 단계는 세포 성장 매체에있는 페놀 빨간색과 항생제의 제거를 보장합니다. 항생제는 P.을 근절 할 수있는 동안 페놀 레드는 약간 형광이고 이미지를 방해할 수 녹농균이라는 박테리아 세균들이 biofilms을 확립하기 전에. </li><li> 에탄올 세탁 집게를 사용하여 음식의 coverslip을 검색하고 챔버에 배치 현미경 매체의 구슬​​에 거꾸로 그것을 낮추십시오. coverslip 이제 두 번째 고무 가스켓에 휴식하고기도 세포의 monolayer 아래로 직면하고 있습니다. </li><li> 한손에 조립 부품을 개최하면, 스택의 상단에있는 챔버의 기본을 배치하고, 그래서 모든 오른쪽 위로있다 신속히 통해 챔버를 켜십시오. 반지를 돌려하여 장소에 기지를 잠금. </li><li> 마이크로 관류 펌프 낮은 흐름에 입구 튜브를 연결 20 ML / H의 속도로 흐름을 시작,이 유량은 P.의 수영 속도 능력 안에 녹농균이라는 박테리아. 튜브 링크의 두 번째 부분 37에 배치 현미경 매체의 플라스크에 펌프 현미경을 바로 옆에 위치한 ° C의 물 목욕. </li><li> , 챔버의 입구와 출구의 재관류 튜브에 살균 사전 컷 16분의 1 일 C - 플렉스 튜빙을 부착 온도 컨트롤러를 연결 후, 거꾸로 형광 현미경의 현미경 단계에 조립 챔버를 놓습니다. </li><li> 1 - ML 일회용 주사기를 사용하여 펌프와 챔버 사이의 라인에 배치 양방향 밸브를 사용하여 챔버로 이전 준비 세균 현탁액을 주입. 우리가 특히 설정에서, 그것은 챔버에 도달하는 세균 현탁액의 0.6 ML 볼륨을 소요됩니다. 특정 튜브 길이에 따라이 볼륨을 조정합니다. 우리는 또한 펌프와 상류 수영 입력 술병을 오염으로부터 세균을 방지하기 위해 두 방향 밸브 사이에 필터 인라인 일회용 0.22 μm의 배치하는 것이 유용할. </li><li> 박테리아가기도 세포에 첨부할 수 있도록하려면, 2 시간을 위해 펌프를 중지합니다. 흐름은 다음 실험의 나머지 부분에 대해 다시 가동 20 ML / H 유지하실 수 있습니다. </li><li> monolayer 손상의 흔적을 확인하는 실험을 통해 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경에 의해기도 세포의 무결성을 모니터링합니다. 동시에, GFP - 레이블 P.의 발전을 따르십시오 거꾸로 공촛점 또는 넓은 필드 형광 현미경으로 이미지를 획득하여기도 세포의 꼭대기의 표면에 녹농균이라는 박테리아의 biofilms. </li></ol> 3. 대표 결과 우리는 P.의 변형을 사용하여 GFP 6 제정 표현을 허용하는 pSMC21 플라스미드를 포함하는 녹농균이라는 박테리아. 이러한 이유로 들어, CFBE monolayer에서 성장 GFP - 라벨 biofilms는 epifluorescence 현미경에 의해 시각하실 수 있습니다. 또는 biofilm의 시각화는 레이블이 지정되지 않은 P.을 얼룩에 의해 얻을 수 37 ° C 1에서 1 시간 동안 1 %의 calcofluor 화이트 솔루션 녹농균이라는 박테리아. 흐름 분석에 CFBE 세포에 이미징 biofilm 형성을 위해, 우리는 사용자 정의 만든 무대 어댑터를 사용하지만, 몇몇 기업들은 이제 특별히 장착 무대 어댑터를 제공할 수 있습니다. 우리는 오카 - AG 깊은 냉각 CCD 카메라 및 x60 오일 침지 목표 (수치 구경 1.40)을 갖춘 올림푸스 IX70 거꾸로 현미경으로 작동합니다. 필터 w뒤꿈치는 40분의 480 NM 밴드 패스 필터 및 여기 30분의 535 NM 밴드 패스 방출 필터를 갖추고 있습니다. 디지털 이미지는 OpenLab 4.0.3 소프트웨어 패키지 (순발력)에 인수되었고 볼륨 Volocity 3.5.1 소프트웨어 (순발력)를 사용하여 복원을 반복하여 deconvolved되었습니다. 3D biofilm 구조의 정량 분석은 COMSTAT 이미지 분석 소프트웨어 패키지 7,8와 함께 달성했습니다. 고려하는 공동의 문화 모델, 하나는 모델의 구성 요소 간의 개발 세포 독성에 특히주의하셔야합니다. 정적 및 유동 세포 assays 모두에서, 우리는 CFBE의 monolayer 피의 존재를 견딜 수 있다고 발견 최대 접종 후 8 시간 변경의 흔적없이위한 녹농균이라는 박테리아. 상피 monolayer 무결성은 거꾸로 현미경 1 (그림 1A)를 사용하여 위상 대조 현미경이나 실험에 걸쳐 5 차동 간섭 대비 (DIC) 현미경에 의해 평가하실 수 있습니다. 시간이지나면서, P. 녹농균이라는 박테리아는 독소와 축적 및 상피 세포 monolayer 완전히 또는 부분에서 (그림 1B - 1C)를 손상시킬 수 독성 요소를 생성합니다. 세포 독성은 양적 상피 세포에서 락트 산 탈수소 효소 (LDH)의 출시를 측정하기 위해 다양한 키트를 사용하여 평가하실 수 있습니다. LDH는 세포 용해 또는 세포 사망시 세포외 환경에 출시 안정 cytosolic 효소이다. 기도 monolayer의 무결성이 손상되지 않습니다 (일반적으로 ~ 8 H 다음 접종에 대한), P. 녹농균이라는 박테리아의 biofilms 성공적으로 형태와 설명 공동 문화 모델 (그림 2A - 2B) 모두에서기도 세포의 꼭대기의 표면에서 개발할 수 있습니다. 3D 재건 (그림 2C)와 부량 다음, 바이오 매스 축적 정확하게 확인할 수 있습니다. 우리는 또한 여러 phenotypic assays 이러한 공동 문화 biofilms를 사용했습니다. 예를 들어, 위에서 언급한 바와 같이, biofilm CFU 쉽게 순차적으로 한천 플레이트에 lysate, 그리고 도금을 diluting, 상피 세포를 lysing에 의해 결정하실 수 있습니다. 우리는 항생제 치료를 다른 변종의 저항을 결정하는이 기법은 유리 나타났습니다. 또한 상피 세포쪽으로 biofilm의 독성은 상용 LDH​​ 탐지 키트를 사용하여 측정할 수 있습니다. 이러한 방법으로 biofilms의 독성에 독성 요소의 역할은 평가하실 수 있습니다. 이러한 모델 시스템은 또한 모터의 융합 연구, RT - PCR과 microarray 분석 1,5,9를 포함한 유전자 발현 응용 프로그램의 번호를 지원합니다. <img src="/files/ftp_upload/2186/2186fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 의 CFBE 세포와 대표 이미지 Monolayer는 P.에 의해기도 세포 monolayers을 훼손하고 손상 녹농균이라는 박테리아의 biofilm 성장. (A) 조직 배양 플레이트 재배 CFBE 세포의 합류 monolayer 대표 이미지, 위상 대조 현미경에 의해 평가. 스케일 바, 120 μm의. 손상된 CFBE의 monolayer의 (B) 예. monolayer 아직 손상의 명백한 보이는 징후를 표시하지 않는다하더라도, P. 녹농균이라는 박테리아 박테리아는 상피 세포와 basolateral 세포막에 얻는 접근 꽉 분기점 사이에 확산 볼 수 있습니다. Biofilm 형성은 일반적으로 악화 monolayer로 인해 이러한 조건 하에서 달성되지 않습니다. 스케일 바, 20 μm의. 자란 P.의 (C) 예 녹농균이라는 박테리아의 biofilm 24 H 후 접종을 관찰했다. 성공적으로 biofilm 형성을 지원하면, CFBE의 monolayer는 복구할 수 없게 손상된 지금 거의 결석했다. 박테리아의 평면 레이어로 성장 잔류 biofilm은, 유리 coverslip에 연결 표시됩니다. 스케일 바, 20 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2186/2186fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. P. GFP - 표현 P.의 정적 공동 문화 Biofilm 모델 및 흐름 전지 공동 문화 Biofilm 모델을 사용하여 합류 CFBE 세포의 꼭대기의 표면에서 성장 녹농균이라는 박테리아의 biofilms가. (A) 대표 이미지 녹농균이라는 박테리아의 biofilm은 epifluorescence 현미경에 의해 평가 정적 공동 문화 Biofilm 모델을 사용 CFBE 세포의 합류 monolayer에서 성장. 이미지 위상 콘트라스트 채널의 오버레이 및 형광 채널입니다. 스케일 바, 35 μm의. GFP - 라벨 P.의 (B) 대표 이미지 녹농균이라는 박테리아의 biofilm은 흐름 셀 공동 문화 Biofilm 모델을 사용하여 CFBE 세포의 합류 monolayer 6 H에 대한 성장. 기도 monolayer의 시각화를 촉진하기 위해, 핵은 P.과 함께 접종하기 전에 30 분 10 μg / ML Hoechst 33342 (분자 프로브)와 스테인드되었습니다 녹농균이라는 박테리아. 합병과 pseudocolored 이미지가 차등 간섭 대비 (DIC)에 의해 볼되었고, 해당 형광 이미지가 표시됩니다. CFBE 세포의 꼭대기의 표면에 부착된 녹색 대단히 짧은 시간으로 발표 Biofilms은,기도 세포에 걸쳐 분산됩니다. 스케일 바, 20 μm의. (C) 입체 reconstruc6 H 된 P.의 전형적인 버섯 모양의 구조를 보여주는 Z - 시리즈 이미지 스택의 기 녹농균이라는 박테리아의 biofilms은 CFBE 세포 monolayer를 형성. 스케일 바, 10 μm의.

<ol>
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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Biofilms 환경 자극에 대한 응답으로 양식 박테리아의 커뮤니티입니다. 이러한 환경 신호 표면, 집합, exopolysaccharides 생산, 그리고 증가 항생 저항 10 다른 phenotypes에 바인딩에서 발생하는 각 세균 내에 세계적인 규제 변화로 이어집니다. 수십년 지난 몇 동안 많은 증거가 biofilms는 만성 감염의 pathogenesis에 큰 역할을한다는 가설을 지원하고 있습니다. 예를 들어, 그것은 잘 접수되었는지 P. ?...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FCS2 (Focht Live-Cell) chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>060319131616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FCS2 chamber controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>060319-2-0303</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>40 mm glass coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bioptechs, Butler, PA</td>
<td>PH 40-1313-0319</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>#10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM without phenol red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>Mediatech, Manassass, VA</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

co-culture models of pseudomonas aeruginosa biofilms grown on live human airway cells

세균성 biofilms는 다양한 인간 질병의 숫자와 관련되어 있지만, biofilm 개발은 일반적으로 비 - 생활 표면에 연구되었습니다. 본 논문에서는, 우리는 문화의 성장 인간기도 상피 세포 (CFBE 세포)에 형성 녹농균의 biofilms에 대한 프로토콜을 설명합니다. 첫 번째 방법에서는 (정적 공동 문화 Biofilm 모델을 칭했다), P. 녹농균이라는 박테리아가 표준 조직 문화 접시에 합류 monolayers로 성장 CFBE 전지 incubated입니다. 박테리아가 상피 세포에 매우 독성이지만, 아르기닌 지연 monolayer의 파괴 또한 충분히 biofilms에 대한 CFBE 세포에서 만들어집니다. 두 번째 방법은 (흐름 전지 공동 문화 Biofilm 모델을 칭했다), 종종 CFBE 세포의 합류 monolayer를 지원하는 유리 coverslip을 수용하기 위해 biofilm 연구에 사용되는 biofilm 흐름 전지 장치의 적응을 포함한다. 이 monolayer는 P.과 주사입니다 녹농균이라는 박테리아와 연동 펌프 다음 세포에 걸쳐 신선한 매체를 흐르고 있습니다. 두 시스템에서 세균성 biofilms는 접종 후 6-8시간 이내에 양식. biofilm의 시각화는 P.의 사용에 의해 향상됩니다 녹농균이라는 박테리아의 변종은 녹색 형광 단백질 constitutively (GFP)을 표현. 정적 및 흐름 세포 공동 문화 Biofilm의 assays 일찍 P.을위한 모델 시스템 아르 낭성 섬유증 (CF) 폐, 이러한 기술의 녹농균이라는 박테리아 감염은 P.의 다양한 측면을 허용 녹농균이라는 박테리아의 biofilm 형성과 독성이 biofilm의 세포 독성, biofilm CFU 측정 및 biofilm을 얼룩과 시각화를 포함하여 공부 할 수 있습니다.

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

본 논문은 성장의 다른 방법을 설명합니다<em&gt; 녹농균</em&gt; 교양 인간기도 상피 세포에서 biofilms. 이러한 프로토콜은 biofilm 단위 (CFU)를 형성 식민지를 측정, biofilm의 얼룩 및 biofilm의 세포 독성을 공부, biofilm의 시각화를 포함한 biofilm 형성의 다양한 측면을 연구 적용할 수 있습니다.

공동 문화 모델 녹농균 Biofilms는 라이브 인간 에어웨이 세포에 들어라

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

22.1K 조회수.  Dartmouth College. 본 논문은 성장의 다른 방법을 설명합니다 녹농균 교양 인간기도 상피 세포에서 biofilms. 이러한 프로토콜은 biofilm 단위 (CFU)를 형성 식민지를 측정, biofilm의 얼룩 및 biofilm의 세포 독성을 공부, biofilm의 시각화를 포함한 biofilm 형성의 다양한 측면을 연구 적용할 수 있습니다.

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Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

연구

면역학 및 감염병학

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

의 RNA 격리 녹농균 Murine 위장관을 Colonizing

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

녹농균 유발 폐 손상 모델

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

방법 감지 세포 독성 Amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

슈도모나스 녹농균의 작은 식민지 변형의 문화와 알긴산의 정량화

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

만성 슈도모나스 녹농증 상처 감염의 지연 접종 모델

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.