1. 모든 구성 요소와 흐름 전지 시스템의 조립 조립 플로우 시스템이 포함됩니다 : autoclavable 튜브, 버블 트랩, 중간 / 폐기물 용기 및 그림 1에 표시된 흐름 세포를. 이러한 모든 부분이 실험 사이에 활용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 플로우 전지 시스템 설치 (설치의 필수 구성 요소). 중간 병, 연동 펌프, 버블 트랩, 흐름 전지, 폐기물 용기, 각종 커넥터의 상호 튜브의 다양한 섹션 : 흐름 전지 시스템은 여러 구성 요소로 구성되어 있습니다. 그림은 친절 런 Lyngklip에 의해 제공됩니다. 2. 흐름 전지의 조립 <ol><li> 흐름 세포 (그림 2A)은 주사기 (그림 3)를 사용하여 실리콘 접착제의 얇은 차선과 함께 처리됩니다. </li><li> 실리콘 라인 (그림 3)의 위에 커버 전표를 놓습니다. 유리 커버 풀렸는데은 P.위한 하층으로 사용됩니다 녹농균이라는 박테리아 PVC 커버 풀렸는데이 S. 신청하는 동안 cerevisiae의 biofilm. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 플로우 셀 및 거품 트랩 2 도식 그림. A) 흐름 세포 B) 버블 트랩, DTU 시스템 생물학의 생산에 사용되는 치수에 대한 상세한 설명입니다. 존 와일리 &amp; 아들 주식 회사 (DTU 시스템 생물은 이전과 같이 그림에 묘사된, Biocentrum 자격이되었다)의 허가 Reprinted <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 유리 하층의 첨부 파일에 대한 실리콘 접착제 응용 프로그램 라인의 일러스트. 표시된 커버 유리의 흐름 세포에 부착하는 실리콘 접착제 위에 배치됩니다. <ol start="3"><li> 흐름 세포 뒤집어 아래 커버 슬립 면을 평평한 표면에 놓으십시오. 흐름 세포의 기본에 커버 슬립을 밀어 흐름 세포의 뒷면에 가볍게 누릅니다. 흐름 세포 뒤집어 및 실리콘에 의해 봉인되지 않은 영역에 대한 검사. 주사기의 손잡이 (피스톤) 부분은 부드럽게 함께 유리와 흐름 세포를 눌러 도구로 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 중간 병 <ol><li> 중간 병 속에 들어있는 먹이의 실리콘 튜브 (2mm 내경)을 놓고 다른 끝에 스트레이트 커넥터를 삽입합니다. </li><li> (중간 내용에 대해 &quot;미디어&quot;단락을 참조) 병에 미디어를 추가 금속 호일과 커넥터와 병 커버하고 매체를 압력솥. autoclaving 때 공급 튜브의 끝 부분이 중간 병 또는 사이펀 효과의 액체 수준 이상의 고정되어 있는지 확인이 매체 병을 비어 있습니다. </li></ol> 4. 버블 트랩, 플로우 셀 및 펌프 연결 그림 1의 개요에 따라 모든 튜빙을 조립. Marprene 튜브가 적용되는 연동 펌프를 통해가는 부분을 제외하고 실리콘 튜브를 사용하십시오. <ol><li> 모든 개별적인 흐름 방으로 매체 병에서 튜브를 연결하기 위해서는, 실험에 적용 인레츠의 필요한 번호로 튜브를 분할. (그림 1, T - 커넥터를 참조) 펌프의 Marprene 튜브로 공급 튜브의 연결 튜브의 바람직한 숫자를 만들기 위해 T - 커넥터를 사용하십시오. 그것은 일반적으로 시스템의 결함의 경우에는 구성 요소의 식별을 촉진하기 위하여, 시스템 전반에 걸쳐 튜브 및 흐름 세포와 같은 순서 순서를 유지하는 것이 좋습니다. </li><li> 스트레이트 커넥터를 사용하여 펌프의 튜브를 Marprene 각 개별 먹이 튜브 (직경 2mm)을 연결합니다. 중간 실리콘 튜브 (직경 1 ㎜)를 통해 버블 트랩에 Marprene 튜브 (그림 2B)을 연결합니다. 펌프가 거품 트랩의 가장 높은 부분의 입구에 연결되어 있는지 확인합니다. </li><li> 흐름 세포 입구 (직경 1 ㎜)로 버블 트랩의 결과 콘센트에 튜브를 연결이 tubings의 길이가 흐름 세포가 공촛점 현미경 (일반적으로 1m)의 단계로 이동하실 수 있는지 확인하십시오. </li><li> 버블 트랩 위에 플레이스 5 ML의 주사기합니다. 적합한 모자와 함께 정상을 닫습니다. </li><li> 흐름 세포 콘센트에 짧은 약 40mm의 조각 (직경 1 ㎜), 튜브를 연결하고 필요한 길이 (직경 2mm) 폐기물 튜브를 연결하는 직선 커넥터를 &quot;감소&quot;를 사용합니다. 쓰레기 용기에 쓰레기 튜브를 놓습니다. </li><li> 중요한 것은, 폐기물 컨테이너는 항상 절대 흐름 세포 수준 아래의 흐름 세포와 같은 수준에 배치해야합니다. 또한, 폐기물 튜브의 끝 부분은 흐름 세포를 다룰 때 플러시 - 다시 사이펀 효과로 인해을 피하기 위해 폐기물 액체의 기대 수준 이상의 고정되었는지 확인합니다. </li></ol> 5. 흐름 시스템을 살균 세탁 <ol><li> 버블 트랩 뚜껑을 제거하고 그들이 불임 유지하는 70 % 에탄올에서 그들을 놓으십시오. </li><li> 0.5 % (V / V) 물에 나트륨 차아 염소 산염을 사용하여 시스템을 채우기 위해 최고의 펌프 속도로 실행합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 다시 버블 트랩이 완전히 채워진 경우에 버블 트랩 모자를 놓습니다. </li><li> 흐름 챔버에서 거품을 제거하는 흐름 세포를 누릅니다. 연약한 커버 유리를 손상하지 않도록 조심 해요. </li><li> 시스템 3 ML / H / 채널 (0.2 mm / s의 선형 유량)의 유량에 3-4 H에 대한 소독 수 있습니다. </li><li> 시스템 모든 차아 염소 산염을 씻어 2-3 번 씻으십시오. 멸균 물 시스템을 작성하고 빈. 버블 트랩은 각 씻어 사이에 완전히납니다해야합니다. 이것은 거품 트랩납니다 때까지 공기 펌핑하여이 작업을 수행할 수 있습니다. 비우는 후, 시스템을 충진하기 전에 버블 트랩에서 뚜껑을 제거합니다. 버블 트랩이 완전히 액체로 가득 후에 마개를 교체하십시오. 필요한 경우 반복합니다. </li><li> 박 이상 낮은 유량 (1-3 ML / H / 채널)에서 시스템을 통해 멸균 물을 실행하거나 다음 단계로 진행합니다. </li><li> 입구에 매체 병을 연결하고 실험이 수행됩니다 온도 낮은 유속 (3 ML / H / 채널)에서 하룻밤을 통해 매체를 사용하여 시스템을 플러시. 참고 : 시스템이 매체를 가득 전에 버블 트랩이 물을납니다해야합니다. </li></ol> 6. 흐름 세포의 접종 <ol><li> 하룻밤 문화에서 원하는 광학 밀도로 희석을 (P.의 녹농균이라는 박테리아 예 : 0.001 OD 600nm와 S. cerevisiae에 대한의 0.1 OD 600nm)을합니다. </li><li> 챔버을 채우기 위해 충분한 inoculum를 로드할 수 27G 바늘로 0.5 ML의 주사기를 사용합니다. 250 μL (그림 2., X 4mm X 1mm 40mm)이 작업에 지정된 크기를 갖는 유량 실 충분합니다. </li><li> 연동 펌프를 중지합니다. </li><li> 시스템에 흐름을 다시 막기 위해 흐름 세포 이어지는 실리콘 튜브를 고정. </li><li> 70 % 에탄올로 닦아하여 실리콘 튜브에 접종 사이트를 소독. </li><li> 실리콘 튜브에 바늘을 삽입하여 흐름 세포의 입구에 팁을 소개합니다. 천천히 (기포를 주입하지 않도록주의) 챔버에 inoculum를 주입. </li><li> 바늘을 제거하고 주사 사이트를 통해 실리콘 접착제를 사용하여 구멍의 즉각적인 씰링 다음 70 % 에탄올로 주입 사이트를 닦으십시오. </li><li> 흐름 전지를 통해 전원을 켜고 흐름 전지를 통해 흐름을하지 않고 1 시간 동안 미생물은 하층을 준수하자. </li><li> , 흐름 전지 돌려 매체 펌프 (3 ML / H / 채널)를 시작하고 실리콘 튜브에서 클램프 가져가라. </li><li> 이 시스템은 37, 부화를 위해 배치됩니다 ° C를 P.의 경우 녹농균이라는 박테리아 30 ° C S.의 경우 cerevisiae. </li><li> 흐름 실에서 Biofilm 지금 CLSM에 의해 시각하실 수 있습니다. </li></ol> 7. 현미경에 대한 BIOFILM의 염색법 <ol><li> 적절한 얼룩의 희석 (예 : 1:1000 Syto 9 S. cerevisiae의 얼룩에 대한 라이브) 확인 </li><li> 연동 펌프를 중지합니다. </li><li> 흐름 세포 이어지는 실리콘 튜브의 클램프. </li><li> 70 % 에탄올로 닦아하여 실리콘 튜브에 접종 사이트를 소독. </li><li> 챔버를 채울 정도로 얼룩 솔루션을 로드할 수 27G 바늘로 0.5 ML의 주사기를 사용합니다. 250 μL는 여기에 사용되는 유량 실 충분합니다. </li><li> 실리콘 튜브에 바늘을 삽입하여 흐름 세포의 입구에 팁을 소개합니다. 천천히 챔버에 얼룩 솔루션을 (거품을 주입하지 않도록주의) 주입. </li><li> 바늘을 제거하고 사출 사이트의 즉각적인 씰링 다음 70 % 에탄올로 주입 사이트를 닦으십시오. </li><li> 15 분 유동하지 않고 흐름 전지를 남겨주세요. </li><li> 클램프를 벗어 (3 ML / H / 채널)의 흐름을 시작합니다 </li><li> CLSM 데이터를 수집 </li></ol>

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	<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+a+common+cause+of+persistent+infections.">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li><li>Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+analyzing+biofilms+in+flow+cells.">Growing and analyzing biofilms in flow cells.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, 2-2 (2006).</li><li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+reproducibility+in+flow-chamber+biofilms.">Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms.</a> Microbiology. 146, 2409-2415 (2000).</li><li>Pamp, S. J., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+biosurfactants+in+structural+biofilm+development+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Multiple roles of biosurfactants in structural biofilm development by Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 189, 2531-2539 (2007).</li><li>Haagensen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+distribution+of+colistin-+and+sodium+dodecyl+sulfate-tolerant+cells+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Differentiation and distribution of colistin- and sodium dodecyl sulfate-tolerant cells in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J Bacteriol. 189, 28-37 (2007).</li><li>Klausen, M., Aaes-Jorgensen, A., Molin, S., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+bacterial+migration+in+the+development+of+complex+multicellular+structures+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Involvement of bacterial migration in the development of complex multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Mol Microbiol. 50, 61-68 (2003).</li><li>Pamp, S. J., Gjermansen, M., Johansen, H. K., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+to+the+antimicrobial+peptide+colistin+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+is+linked+to+metabolically+active+cells,+and+depends+on+the+pmr+and+mexAB-oprM+genes.">Tolerance to the antimicrobial peptide colistin in Pseudomonas aeruginosa biofilms is linked to metabolically active cells, and depends on the pmr and mexAB-oprM genes.</a> Mol Microbiol. 68, 223-240 (2008).</li><li>Pamp, S. J., Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+microbial+multicellular+lifestyle+via+flow-cell+technology+and+confocal+microscopy.">Insight into the microbial multicellular lifestyle via flow-cell technology and confocal microscopy.</a> Cytometry Part A. 75A, 90-103 (2009).</li><li>Barken, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+type+IV+pili,+flagellum-mediated+motility+and+extracellular+DNA+in+the+formation+of+mature+multicellular+structures+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Environ Microbiol. 10, 2331-2343 (2008).</li><li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autolysin-mediated+DNA+release+in+biofilm+formation+of+Staphylococcus+epidermidis.">Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis.</a> Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).</li><li>Allesen-Holm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+characterization+of+DNA+release+in+Pseudomonas+aeruginosa+cultures+and+biofilms.">A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms.</a> Mol Microbiol. 59, 1114-1128 (2006).</li><li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).</li><li>Palmer, R. J., Haagensen, J. A., Neu, T. R., Sternberg, C., Palmer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 882-900 (2006).</li><li>Haagensen, J. A., Regenberg, B., Sternberg, C., M&#252;ller, S., Bley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High Resolution Microbial Single Cell Analytics Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology. , (2010).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 biofilm 조사에서 강력한 도구를 나타내는 플로우 전지 시스템를 증명하고있다. 공촛점 현미경의 3D 이미지와 결합 시스템은보다 전통적인 현미경 기술에 의해 미생물 biofilms를 분석의 다른 방법에 비해 장점 범위 있습니다. 이 시스템은 지역 사회의 방해없이 미생물 biofilm 커뮤니티를 생활의 3D 시각화 수 있습니다. 가벼운 현미경은 biofilm의 틈새에 대한 자세한 정보를 제공하지 않습니다과 전자 현미경의 biofilm의 nanoscale 해상도를 제공하는 동안, 그것은 라이브 셀 이미징을 허용하지 않습니다. 우리가 이전에 여러 항생제 5-8 (그림 4A)에 민감한 박테리아 세포, 세포 성분의 분포의 공간적 분포를 elucidated있는 설명 유동 채널 시스템을 사용하여, 예를 들어 DNA 9-11와의 운동성이있는가 아닌 운동성이있는 세포의 분포 박테리아 커뮤니티 4,6,9 (그림 4C)에서 동일한 종. 우리는 흐름 전지 시스템은 효모 biofilms의 측면을 연구하는 데 사용할 수있는 것을 다할. 이것은 fungicides뿐만 아니라 효모 biofilm 개발에 관여 유전자의 식별과 같은 환경 요인에 대한 응답으로 효모 biofilm의 spatio 시간적 분포 수 있습니다. 효모는 운동성이있는과 비 운동성이있는 세포로 구별하는 것으로 알려져 아니지만, biofilm의 다변화의 다른 측면은 효모에서 pseudohyphal 세포에 대한 형태학의 변화와 haploid에서 diploid 세포로의 전환으로 공부를 할 수 있습니다. 우리는 여러 미생물 종의 준수와 여러 얼룩 기술과 함께 사용할 수있는 시스템을 보여주었다. 같은 GFP 등 다양한 얼룩 프로브 및 형광 단백질의 다양한, 개발 biofilm의 특정 틈새 조사를 활성화하고 항균 대리인 또는 기타 환경 요인의 효과를 분석 효율적인 도구입니다. 얻은 수있는 정보는 매우 상세한있다 (그림 4)와 biofilm의 기능은 같은 COMSTAT 12,13와 같은 컴퓨터 프로그램과 계량 수 있습니다. 전체 프로토콜의 가장 중요한 측면은 그것이 시간이 많이 걸리는 과정이라는 사실이다. 또한 세포가 아닌 형광등, 투명 표면에 성장 수 있어야한다는 제한 사항입니다. . 시스템이 경험 연구원으로 높은 처리량 검사에 적합하지 않습니다 : 형성된 biofilm이 공촛점 현미경, 몇 백 micrometres 14 제한됩니다 조사 수있는 깊이를 사용하여 분석하기 때문에 디자인에 고유의 추가 기술 한계가 있습니다 차례 준비하는 데 몇 일이 소요될 수 있습니다 실험마다 대부분의 약 15 개 채널에서 처리할 수 있습니다. 그러나, biofilm 연구 관련 간주되는 항생제 또는 돌연변이가 처음에는 가장 흥미로운 후보가 흐름 전지 시스템으로 전송되기 전에 이러한 크리스탈 바이올렛 얼룩 같은 다른 방법으로 검사를 대량 수 있습니다. 커버 유리 시트는 매우 얇은하고 쉽게 휴식, 그리고 시스템을 다룰 때주의한다. 또한 튜브는 실험의 실행 기간 동안 매일 검사해야한다 단지 상류 흐름 세포의 유입 튜브에 상당한 &quot;다시 성장은&quot;발생할 수있는. 이러한 오염 물질은 멸균 기술을 사용하여 흐름 세포의 입구 측면에서 실리콘 튜브의 여러 센티미터를 제거하여 해결하실 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4) 사일 오래된 PAO1 -. 죽은 얼룩 (붉은 얼룩) B)는 3 일의 3D 프레 젠 테이션을 이전 P. 대한 Colistin 및 Propidium 요오드화물과 24 시간의 치료를 GFP의 biofilm 녹농균이라는 박테리아 PAO1 (P.의 녹농균이라는 박테리아 야생 타입) - GFP biofilm 6 C) PAO1의 3D 사진 프레 젠 테이션 - PAO1 야생 유형 YFP (노란색) D와 CFP 필라 돌연변이 (블루)) 오일 오래된 PAO1 - GFP biofilm은 3D로 표시 그림 E) 26 H S. cerevisiae (CEN.PK 배경으로 PTR3 돌연변이) biofilm은 Syto - 9 15 물들다.

<ul><li> 버블 트랩, 폴리에틸렌 (DTU 시스템 생물학, 덴마크 기술 대학 %의 20Center/Resources/Biofilm % 인 20Setup.aspx을 http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument) </li><li> 지우기 폴리 프로필렌 플라스틱 커넥터 및 T - 커넥터 (콜 파머, 인치 8분의 1 (3.175 mm)와 인치 16분의 1 (1.588 mm)) </li><li> 클램프 </li><li> 공촛점 현미경 (자이스 혈구, 메타 LSM510) </li><li> Coverslips, 유리 (Knittel 글레이저) 50 X 24mm </li><li> Coverslips, PVC coverslips (Rinzl) 50 X 24mm </li><li> 흐름 세포, 폴리에틸렌 (DTU 시스템 생물학, 덴마크 기술 대학 %의 20Center/Resources/Biofilm % 인 20Setup.aspx을 http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument </li><li> 중간 병 (쇼트) </li><li> 연동 펌프 (왓슨 - 말로, 205S) </li><li> 흐름 시스템 및 펌프를위한 카트 롤링 </li><li> 실리콘 접착제 (3M 슈퍼 실리콘 밀봉제 지우기) </li><li> 주사기 5 ML (Terumo) </li><li> Syto 9 (분자 프로브) </li><li> 바늘과 주사기 0.5 ML (27G, Terumo LU - 100) </li><li> 폐기물 컨테이너 </li></ul> 관 : <ul><li> 실리콘, 3mm 외경, 내경 1mm (올 Dich) </li><li> 실리콘, 4mm 외경, 2mm 내경 (올 Dich) </li><li> Marprene, 3mm 외경, 내경 1mm (왓슨 - 말로) </li></ul> 미디어 <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> P.의 녹농균이라는 박테리아 매체 </td></tr><tr><td> A10 </td><td> G / L </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO4 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> 나 2 HPO 4 X 2 시간 2 O </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> 압력솥 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> 일박 삼식제 </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 0.20 </td></tr><tr><td> 1 ML 1 M CaCl 2 </td><td> 0.01 </td></tr><tr><td colspan="2"> 100 μL / L 추적 금속 (P. 녹농균이라는 박테리아 - biofilms를위한) 4 </td></tr><tr><td colspan="2"> 압력솥 </td></tr><tr><td colspan="2"> 1시 10분의 비율 A10 및 FB를 섞는다. </td></tr><tr><td colspan="2"> 원하는 농도에 탄소 소스를 추가합니다. </td></tr></tbody></table> <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> S. cerevisiae의 합성 전체 (SC) 매체 </td></tr><tr><td></td><td> G / L </td></tr><tr><td> 아데닌 황산염 </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L - 트립토판 </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L - 히스티딘 - HCL </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L - 아르기닌 - HCL </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L - 메티오닌 </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L - 티로신 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L - 류신 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> L - 이소 류신 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> L - 라이신 - HCL </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L - 페닐알라닌 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L - aspartic 수 소산 </td><td> 0.10 </td></tr><tr><td> L - 글루탐산 </td><td> 0.10 </td></tr><tr><td> L - 발린 </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> L - 트레오닌 </td><td> 0.20 </td></tr><tr><td> L - 세린 </td><td> 0.40 </td></tr><tr><td> 효모 내셔널로겐 기지 W / O 아미노산과 암모니아 (Bacto) </td><td> 1.6 </td></tr><tr><td> 유안 </td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> Succinic 산성 </td><td> 10.0 </td></tr><tr><td> 압력솥 </td><td></td></tr><tr><td> 포도당 (별도 autoclaved) </td><td> 0.20 </td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa and saccharomyces cerevisiae biofilm in flow cells

대부분의 미생물 세포는 무료 생활 미생물에 비해 생리와 병리 학적 특성을 변경하지 biofilms로 정의 고착의 미생물 커뮤니티를 형성하는 능력이 있습니다. 자연 Biofilms 종종 제대로 정의된 조건 1 아래 조사하고 거주하기가 어렵습니다. 투명 하층을 사용하면 그것은 장치에 간단한 biofilms가 실시간으로 비파괴 방식으로 검사 수있는 시스템이 가능합니다 : 여기 우리는 미생물 biofilms의 체외 3D 연구에 대해, 플로우 셀 모델 시스템의 조립 및 작동을 보여주 잘 정의된 조건 하에서 높은 재현성 2,3 생성. 시스템은 biofilm에 대한 성장 챔버 역할 흐름 세포로 구성되어 있습니다. 흐름 세포는 연동 펌프를 통해 매체를 플라스크에서 영양분과 산소와 함께 제공하고 소비 매체는 폐기물 용기에 수집됩니다. 흐름 시스템의 건설 흐름 챔버에서 자란 세포의 최소한의 방해와 예, 항생제의 영양분과 행정의 지속적인 공급이 가능합니다. 또한, 흐름 세포 내에서 유동 조건 전단 응력에 노출 biofilm의 연구를 수 있습니다. 풍선 달리 흐름 세포의 biofilm 구조를 방해 할 수있는 튜브에서 장치 경계 공기 방울을 트래핑. 흐름 전지 시스템은 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)와 호환되며 따라서 미생물 biofilms을 개발하는 방법에 대해 매우 상세한 3 차원 정보를 제공할 수 있습니다. biofilm의 세포는 형광 프로브 또는 CLSM 분석과 호환 단백질이 표시하실 수 있습니다. 이것은 온라인 시각화를 가능하게하고 개발 biofilm의 틈새 시장의 조사를 허용합니다. 미생물 상호 관계, 항균 대리인 또는 특정 유전자의 표현의 조사는 흐름 전지 시스템의 조사 수있는 많은 실험 설정을합니다.

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Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

프로토콜 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)에 대한 미생물 biofilms 성장 분석을위한 플로우 전지 시스템의 응용 프로그램을 설명합니다.

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

36.5K 조회수.  Danish Technical University. 프로토콜 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)에 대한 미생물 biofilms 성장 분석을위한 플로우 전지 시스템의 응용 프로그램을 설명합니다.

비디오: Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

공동 문화 모델 녹농균 Biofilms는 라이브 인간 에어웨이 세포에 들어라

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

연구

면역학 및 감염병학

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

의 RNA 격리 녹농균 Murine 위장관을 Colonizing

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용<em&gt; 녹농균</em&gt; 낭성 섬유증의 폐 관련성이 높은 조건에서

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen which establishes chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis (CF). The overproduction of a capsular polysaccharide called alginate, also known as mucoidy, promotes the formation of mucoid biofilms which are more resistant than planktonic cells to antibiotic chemotherapy and host defenses. Additionally, the conversion from the nonmucoid to mucoid phenotype is a clinical marker for the onset of chronic infection in CF. Alginate overproduction by P. aeruginosa is an endergonic process which heavily taxes cellular energy. Therefore, alginate production is highly regulated in P. aeruginosa. To better understand alginate regulation, we describe a protocol using the mini-himar1 transposon mutagenesis for the identification of novel alginate regulators in a prototypic strain PAO1. The procedure consists of two basic steps. First, we transferred the mini-himar1 transposon (pFAC) from host E. coli SM10/&#955;pir into recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugation to create a high-density insertion mutant library, which were selected on Pseudomonas isolation agar plates supplemented with gentamycin. Secondly, we screened and isolated the mucoid colonies to map the insertion site through inverse PCR using DNA primers pointing outward from the gentamycin cassette and DNA sequencing. Using this protocol, we have identified two novel alginate regulators, mucE (PA4033) and kinB (PA5484), in strain PAO1 with a wild-type mucA encoding the anti-sigma factor MucA for the master alginate regulator AlgU (AlgT, &#963;22). This high-throughput mutagenesis protocol can be modified for the identification of other virulence-related genes causing change in colony morphology.

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Here we describe a protocol using the mini-himar1 mariner transposon-mediated mutagenesis for generating a high-density insertion mutant library to screen, isolate and identify novel alginate regulators in the prototypic Pseudomonas aeruginosa strain PAO1.

에 알긴산 생산과 관련된 새로운 유전자의 식별<em&gt; 녹농균</em&gt; 사용 미니<em&gt; himar1</em&gt; 마리너 트랜스포존 매개 돌연변이 유발

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

녹농균 유발 폐 손상 모델

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

라이트 사이드에와 서: Vivo에서 당뇨병 털 Murine 모델에 만성 상처에서 녹 농 균 Biofilm 감염의 모니터링

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

주문, 녹 농 균 스트레인 PA14 Transposon 삽입 돌연변이의 비중복 라이브러리의 복제

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

방법 감지 세포 독성 Amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

감염의 간단한 마우스 모델에서 녹농균 및 독성 감쇠에 대한 테스트에서 프레임 내 유전자 삭제 돌연변이의 생성

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...