우리가 실험실에서 작업이 NIGMS - NIH의 국립 과학 재단 (National Science Foundation)와 지역 부여 R15GM86839에서 경력을 수상 MCB0551798에 의해 지원됩니다.

1. 성장과 자외선 조사. <ol><li> 0.4 % 포도당, 0.2 % casamino의 지방산 및 10 μg / ML의 thymine (DGCthy 매체) 및 100 μg / ML 암피실린와 보충 데이비스 중간 1 자란 플라스미드 pBR322를 포함하는 새로운 숙박 문화의 200μl가 pelleted입니다. 세포 펠렛은 다음 암피실린을 부족한 200μl DGCthy 매체에 resuspended 및 DGCthy 매체 20 ML을 예방하는 데 사용됩니다. </li><li> 문화는 0.5의 OD 600 (~ 5 X 10 8 셀 / ML)를 37 떨고 인큐베이터에서 암피실린 선택 ° C 않고 재배하고 있습니다. 암피실린없는 성장은 어떤 돌연변이에서 발생할 수 비정상적인 또는 비생산적인 복제 중간체에 대한 선택을 방지합니다. 손상을 유발하는 자외선을 사용하는 경우는 자외선의 효과적인 복용량을 줄이고, 이러한 파장과 보호막 세포에서 강하게 흡수하기 때문에 또한, 미디어에서 암피실린의 제거가 필요합니다. </li><li> 노란 불빛 아래에서 일하는 문화가 교반을위한 회전 플랫폼에서 15cm 직경 페트리 접시에 배치됩니다. 우리의 문화는 UVC 광도계를 사용하여 측정됩니다 ~ 1 J/m2/sec의 노출 율을 생산하는 15 와트 살균 램프에서 거리에서 배치됩니다. 문화 50 J/m2와 조사 후 다시에 즉시 배치하는 실험 기간 동안 37 ° C 배양기를 흔들어. 이 약을 평균 1 cyclobutane pyrimidine 이합체 ssDNA의 모든 4.5 킬로바이트에서 생산하고 있습니다. 노란색 조명 photolyase로 cyclobutane의 pyrimidine의 dimers의 photoreactivati​​on - 반전을 방지할 수 있습니다. </li></ol> 2. DNA 격리. <ol><li> 복제 중간체가 검사 예정이다 때때로, 문화의 0.75 ML의 나누어지는는 0.75 ML 얼음 차가운 NET30 버퍼 (100 MM NaCl, 10 MM 트리스, 산도 8.0, 30 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))로 배치하고이 끝날 때까지 얼음에 위치 시간 코스입니다. 우리는 일반적으로 0 조사 샘플, 15, 30, 45, 60, 90 분, 90 분 시간 코스를 실행합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 차가운 온도를 효과적으로 복제 및 뉴클레오 티드 절단 수리를 중지 제공하고 있습니다. </li><li> 각 예제 1.5 MG / ML 라이 소 자임하고 TE 0.2 MG / ML RNaseA (10 MM 트리스, 산도 8.0, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 150 μl에 resuspended, 20 분 ° C 37 lysed 다음 pelleted입니다. 이 시점에서, 20 % sarkosyl의 proteinase K (10mg/ml)와 10μl의 10μl가 추가되며 부화는 1 시간을 위해 계속 허용됩니다. Proteinase K와 sarkosyl는 페놀 추출이 발생하기 전에 멤브레인 또는 단백질과 관련된 수의 DNA 조각을 출시하는 데 도움이됩니다. 적극적으로 복제 DNA가 흔히 단백질이나 막 단지에 바인딩되어 있기 때문에, 이것은 회복 아르 복제 조각의 수율을 높일 수 있습니다. </li><li> 샘플은 다음 각 샘플에 페놀 2 볼륨을 추가하고 튜브가 부드럽게 5 분 거꾸로 의해 압축이 풀립니다. 다음 클로로포름 / isoamyl 알콜 (24 / 1) 2 볼륨이 추가되고 튜브가 부드럽게 5 분 다시 반전됩니다. </li><li> 샘플 5 분, 각 샘플의 맨 수성 단계에 대한 microcentrifuge에서 14,000 rpm으로 centrifuged 아르 것은 제거하고, 새로운 튜브에 배치됩니다. 다음 클로로포름 / isoamyl 알콜 (24 / 1) 4 권이 추가되는 튜브는 부드럽게 5 분 거꾸로하고 있으며, 5 분 14,000 rpm으로 다시 centrifuged. </li><li> 각 예제에서 상단, 수성 단계는 다음 비이커에 0.1X TE 250 ML에 수레 47mm 왓먼 0.025 μm의 기공 디스크에 각 시료의 100μl을 찾는하여 1 시간 동안 dialyzed입니다. 단일 스트랜드 지역 또는 지점 지점과 복제 구조 전단에 더 취약하기 때문에, 우리는 일반적으로 입을 넓게하고 전단 세력을 최소화하기 위해 면도날과 함께 피펫 팁을 잘라. DNA는 제한 효소로 소화되기 전에는 일반적으로, pipetting이 최소로 보관해야합니다. </li><li> 각 샘플은 다음 복제의 기원에서 단 하류 플라스미드를 linearizes PvuII (뉴잉글랜드 Biolabs)으로 소화됩니다. </li><li> 전에 아가로 오스 겔, 100μl 클로로포름 및 Bromophenol 블루와 크실렌 Cyanol를 포함 배의 로딩 염료 20μl에 로딩하기 위해 각 샘플에 추가 혼합하고 있습니다. 그런 다음, 로딩 염료를 포함하는 수성 단계의 40μl가 젤로로드됩니다. 구조적 편견, 구조 유물, 그리고 DNA의 전단을 최소화하기 위해,이 절연 절차는 세포 용해 다음과 같은 단일 스트랜드 지역, 침전물, 또는 DNA 샘플을 집중을위한 풍부하게 어떤 단계를 포함하지 않습니다. </li></ol> 3. 2D 젤 및 남부 분석. <ol><li> 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석 3 수정됩니다. 1 차원은 제한된 DNA 샘플은 1V/cm에서 1X TBE의 0.4 % 아가로 오스 겔을 통해 실행됩니다. 10X TBE 주식 솔루션 중 하나 리터가 포함되어 있습니다 : <ul><li> 108g 트리스베이스 </li><li> 55g 붕소의 소산 </li><li> 40 ML 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 8.0) </li></ul></li><li> 람다 힌드 III 크기 마커가 처음 차선에 로드된 다음 샘플은 다른 모든 차선에로드됩니다. 우리는 일반적으로 최초의 D를 실행imension는 12-15 시간을 ~. 차선을 건너뛰는 것은 쉽게 두 번째 차원의 캐스팅으로 차선을 슬라이스 수 있습니다. 낮은 전압과 낮은 %의 아가로 오스 겔은 주로 크기에 따라 DNA 조각을 분리하는 역할을합니다. </li><li> 두 번째 차원 들어, 겔 차선은 큰 백정의 칼을 사용하여 첫 번째 차원 젤 밖으로 슬라이스하고 있습니다. 람다 힌드 III 마커를 포함하는 첫 번째 차선은 ethidium의 브로마이드 물들일 수 있습니다. 가이드, 농작물로 람다 힌드 III 마커를 사용하여 선형 플라스미드이 실행 것으로 예상됩니다 어디 아래 젤의 영역을 폐기. 이러한 조건에서 우리는 선형의 pBR322 약간 크실렌 cyanol가 얼룩 위에 실행 찾습니다. </li><li> 두 번째 차원을 캐스팅하기 위해 각 레인은 빈 젤 캐스터의 상단에 수평으로 배치됩니다. 1X TBE의 1.0 % 아가로 오스의 솔루션은 55 ° C. 준비 및 냉각 이때 젤 솔루션은 완전히 겔 조각 커버해야하고, 두 번째 차원을 캐스팅에 부어있다. 젤 설정되면, 그것은 버퍼가 recirculate 수있는 전기 장치에 6.5V/cm에서 실행됩니다. 우리는 일반적으로 두 번째 차원 ~ 5.5-7 시간을 실행합니다. 높은 전압과 높은 %의 아가로 오스 겔 효과적으로 DNA 그들의 형태에 따라 조각뿐만 아니라 크기를 분리합니다. 비선형 모양 두 번째 차원을 통해 더 느리게 실행됩니다. </li><li> 다음 전기는 젤은 다음 H 2 O에 씻어서이며, H 2 O와 씻어서 15 분 대한 0.25M 염산 400ml에 두 번 씻어, 다음 30 분 동안 두 번 400 ML 0.4M NaOH로 세탁. 산은보다 효율적으로 전송 작은 조각으로 부분적으로 닉에 DNA 분자를 제공 씻는다. 이 단계는 인해 큰 크기와 DNA 복제 중간체의 특이한 형태가 필요합니다. </li><li> 젤의 DNA는 다음 Hybond N로 전송됩니다 + 나일론 막 4. 우리는 0.4M NaOH와 아래 알칼리성 전송 시스템을 사용합니다. 간단히, 0.4M NaOH에 배어 압지 두 개의 시트는 종이 타올의 대형 스택에 배치됩니다. 나일론 막 또한 0.4M NaOH에 배어 및 압지 위에 위치합니다. 젤 그런 다음 조심스럽게 NaOH 용액에 침수 압지의 다른 조각에 의해 다음이 위에 계층입니다. 마지막으로, 침수 압지의 긴 부분은 상단에 계층이며이 끝나는이 심지 역할을 0.4M NaOH 용액 1 L를 포함하는 요리에 게재됩니다. 우리는 일반적으로 6-12 시간의 DNA 전달하자. </li><li> 나일론 막 제거, 배 SSC 버퍼에 20-30 초 씻어하고, 10.5ml Prehybridization 솔루션을 포함하는 하이브 리다이 제이션 롤러 병에 배치. 그런 다음 막은 ° C 회전 이상 6hrs에 대한 42 incubated입니다. Prehybridization 솔루션 : <ul><li> 5.0 ML 포름 아미드 </li><li> 0.5 ML 20% SDS </li><li> 2.5 ML 20X SSC의 * </li><li> 2.0 ML 50X Denhardt의 * </li><li> 0.5 ML 살몽 정자 DNA (10mg/ml) SSC와 Denhardt의에 대한 * 조리법은 5에서 찾을 수 있습니다 </li></ul></li><li> prehybridization 기간 동안, 플라스미드 pBR322 1 μg는 [32 P] - dCTP 분류 로체 사용 알파가 제공하는 프로토콜에 따라 닉 번역하여 32P로 표시됩니다. radiolabeled 프로브 (100μl)는 98에서 잠복기에 의해 변성됩니다 ° 다음 스크류 캡 microcentrifuge 관에서 10 분 C, 그리고 얼음에 즉시 배치. </li><li> 변성 프로브가 포함된 5.9 ML의 하이브 리다이 제이션 솔루션에 추가됩니다 : <ul><li> 3.0 ML 포름 아미드 </li><li> 1.5 ML SSC </li><li> 1.0 ML H 2 O </li><li> 0.15 ML 50X Denhardt의 </li><li> 0.10 ML 20% SDS </li><li> 0.15 ML 10mg/ml 살몽 정자 DNA </li></ul></li><li> prehybridization 솔루션은 롤러 병 밖으로 부어 있으며 하이브 리다이 제이션 솔루션은 롤러 병이 다음 12hrs 이상 42 ° C 배양기와 회전에 반환됩니다 인치 부어 있습니다. </li><li> 하이브 리다이 제이션 솔루션은 롤러 병 부어있다. 그런 다음, 얼룩이 회전 0.5X SSC, 42에서 0.1 % SDS ° C를 포함하는 세차 솔루션 ~ 150 ML와 롤러 병에 20 분 4 번 씻어입니다. </li><li> 액체가 가시 사라진 때까지 마지막 세척 후, 멤브레인는 종이 타월에 배치됩니다. 막 그런 다음 폴리비닐 염화물 - 플라스틱 포장에 싸여 phosphorimager 화면에 노출됩니다. 우리는 스톰 840과 관련 ImageQuant 소프트웨어를 사용하여 방사능을 시각화하고 계량. </li></ol> 4. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2220/2220fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 플라스미드 복제 중간체는 UV - 유도된 DNA 손상의 존재와 부재에 보여집니다. PvuII의 마이 그 레이션 패턴이 2D - 아가로 오스 겔 - ​​분석에 의해 관찰된 플라스미드 pBR322를 소화 diagrammed입니다. 비 - 복제 선형 plasmids은 선형 4.4 - KB 조각으로 실행됩니다. 복제 plasmids 그들의 큰 크기로 인해 아닌 복제 조각보다 느리게 어떠한 마이 그 레이션되지 Y 모양의 구조를 형성nlinear 모양. 이 마이 그 레이션 패턴은 잘쪽으로 선형 영역에서 밖으로 뻗어 아크를 형성한다. 다음 UV - 조사를 두 번 Y 또는 X - 모양의 분자가 Y 모양의 분자의 아크보다 느리게 마이 그 레이션 원추 지역에서 관찰됩니다. 2D 젤 남부 분석 예제 32P - 라벨 pBR322와 탐지 즉시 UV 조사 및 UV 조사 (발행인의 허가를 재현) 후 15 분 후에 세포에 대해 표시됩니다.

<ol>
	<li>Davis, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Isolation+of+Biochemically+Deficient+Mutants+of+Bacteria+by+Means+of+Penicillin.">The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).</li><li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage-Induced+Replication+Fork+Regression+and+Processing+in+Escherichia+coli.">DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli.</a> Science. 299, 1064-1067 (2003).</li><li>Friedman, K. L., Brewer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+replication+intermediates+by+two-dimensional+agarose+gel+electrophoresis.">Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis.</a> Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).</li><li>Spivak, G., Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+damage+and+repair+in+specific+DNA+sequences.">Determination of damage and repair in specific DNA sequences.</a> METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning - A laboratory manual. , (2001).</li><li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuvABC+is+required+to+resolve+holliday+junctions+that+accumulate+following+replication+on+damaged+templates+in+Escherichia+coli.">RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).</li><li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuvAB+and+RecG+Are+Not+Essential+for+the+Recovery+of+DNA+Synthesis+Following+UV-Induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli.">RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> Genetics. 166, 1631-1640 (2004).</li><li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecO+Acts+with+RecF+and+RecR+to+Protect+and+Maintain+Replication+Forks+Blocked+by+UV-induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli.">RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).</li><li>Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+DnaB+helicase+leads+to+the+collapse+and+degradation+of+the+replication+fork:+a+comparison+to+UV-induced+arrest.">Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest.</a> J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).</li><li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecBCD+and+RecJ/RecQ+initiate+DNA+degradation+on+distinct+substrates+in+UV-irradiated+Escherichia+coli.">RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Radiat Res. 168, 499-506 (2007).</li><li>Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA433+cells+are+defective+in+recF-mediated+processing+of+disrupted+replication+forks+but+retain+recBCD-mediated+functions.">RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions.</a> Mutat Res. 645, 19-26 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

UV - 유도된 손상의 존재와 부재의 야생 타입 세포에서 얻은 전형적인 결과는 그림 1에 표시됩니다. 세포가 급속하게 기하 급수적으로 성장 단계에있을 때 손상이없는 경우, 전체 플라스미드 DNA의 ~ 1 %가 Y 아크에서 찾을 수 있습니다. 차단 복제 포크가 손상 사이트에서 축적으로 조사에 따라, Y 모양 분자의 일시적 증가가 관찰됩니다. X - 모양의 복제 중간체는 또한 transiently 병변이 수리하는 경우?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>An example of the Southern analysis of the 2D gel probed</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE</td>
<td>G15T8</td>
<td>Yellow Lighting</td>
</tr>
<tr>
<td>15 &mu;watt germicidal lamp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sylvania</td>
<td>F20T12/GO</td>
<td>UV Lamp</td>
</tr>
<tr>
<td>Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Daigger</td>
<td>EF28195T</td>
<td>UVC photometer</td>
</tr>
<tr>
<td>0.025 &mu;m pore disks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>VSWP04700</td>
<td>Floating dialysis disks</td>
</tr>
<tr>
<td>PvuII</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fermentas</td>
<td>ER0632</td>
<td>Restriction Endonuclease</td>
</tr>
<tr>
<td>Nick-translation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>976776</td>
<td>To make 32P-labeled probe</td>
</tr>
<tr>
<td>Blotting Paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>3030-704</td>
<td>For Southern transfer</td>
</tr>
<tr>
<td>Nylon membrane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>RPN203S</td>
<td>For Southern transfer</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualization of uv-induced replication intermediates in e. coli using two-dimensional agarose-gel analysis

DNA 손상의 존재에 정확 복제는 모든 세포 유형에서 관찰 널리 바로 인간 암의 개발과 관련된 것으로 세포 rearrangements 및 돌연변이 유발의 대부분을 담당하고 있습니다. 이러한 UV 방사선에 의해 유도되는 등 DNA의 손상, 심한 정확하게 게놈 템플릿을 복제 복제의 능력을 impairs. 유전자 제품의 숫자는 복제 템플릿에 DNA의 병변 생기면 필요한 것을 발견되었습니다. 그러나, 남은 과제는 복제하는 동안 어떻게 이러한 단백질 프로세스 병변을 확인할 수있다<em&gt; 생체내에</em&gt;. 모델 시스템으로 대장균을 사용하여, 우리는 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석 복제 plasmids에 발생하는 구조 중간체를 식별하는 데 사용할 수있는 절차를 설명<em&gt; 생체내에</em&gt; UV - 유도된 DNA 손상에 따라. 이 절차는 UV - 유발 손상에 의해 차단 복제 포크가 RecA와 RecF 경로와 관련된 여러 유전자 제품에 의해 안정화되는 과도 반전을 받다는 것을 입증하는 데 사용되었습니다. 기술이 복제 중간체는 뉴클레오 티드 절단 수리 및 복제 다시 시작하여 병변의 제거와 상호 때까지 유지됩니다 보여줍니다.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis at JoVE.com

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

우리는 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석 UV 방사선 다음 발생하는 복제 중간체의 구조를 식별하는 데 사용될 수있는 절차를 제시한다.

에서 UV - 유도 복제 중간체의 시각화 E. 대장균 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석을 사용하여

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

visualization-uv-induced-replication-intermediates-e-coli-using-two

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

10.6K 조회수.  Portland State University. 우리는 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석 UV 방사선 다음 발생하는 복제 중간체의 구조를 식별하는 데 사용될 수있는 절차를 제시한다.

비디오: Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

열 충격 방법을 사용 E. 대장균에 플라스미드 DNA의 변화

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

연구

생물학

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

아가로 오스 겔 기반 Microfluidic 장치를 사용 신경 줄기 세포의 운동성 평가

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

세미 Denaturing 세제 - 아가로 오스 젤 전기 영동에 의해 아밀로이드 집계에 대한 심사

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.

DT40, a model vertebrate genetic system, provides a powerful tool to analyze protein function. Here we describe a simple method that allows qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase in DT40 cells at the single molecule level.

DNA 복제의 시각화는 척추 모델 시스템 DT40의 DNA 섬유 기술을 사용하여

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

의 DNA 조각의 분리를위한 아가로 오스 젤 전기 영동

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be synthesized with any sequence and designed to complement any gene targeted for silencing. Because sRNA constructs can be introduced to many cell types directly or using a variety of vectors, gene expression can be repressed in living cells without laborious genetic modification. The most common RNA knockdown technology, RNA interference (RNAi), makes use of the endogenous RNA-induced silencing complex (RISC) to mediate sequence recognition and cleavage of the target mRNA. Applications of this technique are therefore limited to RISC-expressing organisms, primarily eukaryotes. Recently, a new generation of RNA biotechnologists have developed alternative mechanisms for controlling gene expression through RNA, and so made possible RNA-mediated gene knockdowns in bacteria. Here we describe a method for silencing gene expression in E. coli that functionally resembles RNAi. In this system a synthetic phagemid is designed to express sRNA, which may designed to target any sequence. The expression construct is delivered to a population of E. coli cells with non-lytic M13 phage, after which it is able to stably replicate as a plasmid. Antisense recognition and silencing of the target mRNA is mediated by the Hfq protein, endogenous to E. coli. This protocol includes methods for designing the antisense sRNA, constructing the phagemid vector, packaging the phagemid into M13 bacteriophage, preparing a live cell population for infection, and performing the infection itself. The fluorescent protein mKate2 and the antibiotic resistance gene chloramphenicol acetyltransferase (CAT) are targeted to generate representative data and to quantify knockdown effectiveness.

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

표적 스르나의 파지 매개 배달에 유전자 발현을 허물고 구축<em&gt; E. 대장균</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. The S domain forms a contiguous scaffold around the viral RNA, whereas the P domain forms viral spikes on the S domain and contains determinants for antigenicity and host-cell interactions. The P domain binds carbohydrate structures, i.e., histo-blood group antigens, which are thought to be important for norovirus infections. In this protocol, we describe a method for producing high quality norovirus P domains in high yields. These proteins can then be used for X-ray crystallography and ELISA in order to study antigenicity and host-cell interactions.
The P domain is firstly cloned into an expression vector and then expressed in bacteria. The protein is purified using three steps that involve immobilized metal-ion affinity chromatography and size exclusion chromatography. In principle, it is possible to clone, express, purify, and crystallize proteins in less than four weeks, which makes this protocol a rapid system for analyzing newly emerging norovirus strains.

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Here, we describe a method to express and purify high quality norovirus protruding (P) domains in E. coli for use in X-ray crystallography studies. This method can be applied to other calicivirus P domains, as well as non-structural proteins, i.e., viral protein genome-linked (VPg), protease, and RNA dependent RNA polymerase (RdRp).

인간의 노로 바이러스 돌출 도메인의 생산에<em&gt; E. 대장균</em&gt; X 선 결정학에 대한

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against invading pathogens. The main role of these macromolecules is to facilitate particle trapping and clearance while promoting lubrication of the mucosa. During protein synthesis, mucins undergo intense O-glycosylation and multimerization, which dramatically increase the mass and size of these molecules. These post-translational modifications are critical for the viscoelastic properties of mucus. As a result of the complex biochemical and biophysical nature of these molecules, working with mucins provides many challenges that cannot be overcome by conventional protein analysis methods. For instance, their high-molecular-weight prevents electrophoretic migration via regular polyacrylamide gels and their sticky nature causes adhesion to experimental tubing. However, investigating the role of mucins in health (e.g., maintaining mucosal integrity) and disease (e.g., hyperconcentration, mucostasis, cancer) has recently gained interest and mucins are being investigated as a therapeutic target. A better understanding of the production and function of mucin macromolecules may lead to novel pharmaceutical approaches, e.g., inhibitors of mucin granule exocytosis and/or mucolytic agents. Therefore, consistent and reliable protocols to investigate mucin biology are critical for scientific advancement. Here, we describe conventional methods to separate mucin macromolecules by electrophoresis using an agarose gel, transfer protein into nitrocellulose membrane, and detect signal with mucin-specific antibodies as well as infrared fluorescent gel reader. These techniques are widely applicable to determine mucin quantitation, multimerization and to test the effects of pharmacological compounds on mucins.

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

점액 아가로 오스 겔 전기 영동 : 높은 분자량 당 단백질에 대한 웨스턴 블로 팅


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...