우리는 섬유 기술뿐만 아니라 도움이 토론에 대한 실험실의 구성원과 관련하여 도움이 박사 T. Helleday 박사 E. Petermann 감사합니다. WN는 국제 암 연구 협회의 수석 국제 연구 활동에 의해 과학 연구 부여 (N301 165935)에 대한 폴란드 국가위원회에 의해 지원됩니다.

Schwab 외, EMBO J., 29 (4) :806 - 18 5. 방법은 다음과 같은 간행물에 사용되었습니다 여기에 설명되어 있습니다. 1. DT40 세포 배양 자료 : 태아 소 혈청 (FBS), 닭 혈청, 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 - 메르 캅 토 에탄올, RPMI <ol><li> 세포 배양 매체를 준비 : 7퍼센트 FBS를 추가 3% 닭 혈청, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 10 μm의 2 - 메르 캅 토 에탄올 RPMI 매체 있습니다. </li><li> DT40 세포가 38 세에 무균 세포 배양 flasks에서 재배 ° C, 5 % 나 humidified 인큐베이터에서 CO 2. 5 × 10 5 세포 / ML 6 밀도 매일 세포를 분할. </li></ol> 2. 생체내 라벨에서 자료 : 이두, CldU <ol><li> 뉴클레오 티드 analogues의 재고 솔루션을 준비 : 중간 2.5 MM 5 MM과 CldU에 이두를 해산. 간단히 60 두 솔루션을 열 ° C와 뉴클레오 티드 아날로그까지 소용돌이ues 완전히 녹아있다. </li><li> 기하 급수적으로 DT40 세포 성장을 25 μm의의 최종 농도 이두를 추가하고 잘 세포 현탁액을 섞는다. 38 ° C와 5% CO 2에서 20 분 동안 세포를 품어. </li><li> 첫 번째 레이블이있는 부화 후, 250 μm의의 최종 농도 CldU을 추가하고 이전 단계에서 설명한대로 세포를 처리합니다. </li><li> 얼음 차가운 PBS로 세포를 씻어 및 7.5 × 10 5 세포 / 차가운 PBS에서 ML의 농도에 그들을 resuspend. 얼음에 표시된 세포 보관하십시오. </li></ol> 설명 라벨 절차는 단순히 제안하고 구체적인 질문을 해결하기 위해 수정할 수 있습니다. 실험 설계에 대한 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오. 3. 확산 세포 용해와 DNA 재료 : 유리 슬라이드, 섬유 용해 용액 <ol><li> 200 MM 트리스 - HCL, pH를 7.5에서 50 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 0.5 % SDS : 섬유 용해 용액 준비 </li><li유리 슬라이드의 한쪽 끝을에 세포 현탁액의&gt; 스팟 2 μl. 5 분하거나 드롭의 볼륨까지 공기 건조가 크게 감소하지만, 건조하지 않습니다. </li><li> Pipet 7 μl 용해 세포 현탁액 위에 솔루션과 부드럽게 솔루션을 혼합하는 피펫 팁 함께 저어. 진행 세포 용해 2 분 동안 품어. </li><li> 섬유는 슬라이드를 따라 확산 수 있도록 15 °로 슬라이드를 기울. </li><li> 섬유 솔루션은 슬라이드의 하단에 도달되면, 공기 건조에 수평으로 그것을 놓으십시오. 건조 후, 얇은, 불투명한 라인은 슬라이드 따라 표시되어야합니다. 이 시점에서 뻗어 섬유의 시작은 라인이 더 이상 표시되지 않습니다 얼룩 이후로 연필로 표시한다. 이 마크는 나중에 현미경으로 섬유를 찾습니다 도움이 될 것입니다. </li></ol> 4. Immunofluorescence 염색법 자료 : 메탄올, 초산, HCL, PBS에서 5 % BSA, 얼룩 병, 안티 - BrdU (마우스) 항체,안티 BrdU (쥐) 항체, 양 반 마우스 Cy3 항체, 염소 안티 쥐 알렉사 형석 488 항체, Vectashield 장착 매체, coverslips, 매니큐어 <ol><li> 메탄올 / 10 분 얼룩 병 및 부화에 초산 (3시 1분)에 빠져 슬라이드. </li><li> 80분 2.5 M HCL에 다음 젖어 소주 H 2 O에서 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 워시는 5 분 동안 PBS로 세 번 슬라이드. </li><li> 얼룩의 항아리에서 슬라이드를 제거하고 종이 타월로 여분의 PBS를 수집합니다. 수평 슬라이드를 놓고 각 슬라이드의 상단에 pipet 5 % BSA. 슬라이드 위에 균일하게 BSA를 확산하고 20 분 동안 부화 coverslip와 함께 부드럽게 슬라이드를 커버. </li><li> 1시 25분 안티 BrdU (마우스)와 1:400 안티 BrdU (쥐) : 다음과 같은 농도에서 5 % BSA의 기본 항체를 희석. </li><li> 그것을 제거하는 유리 슬라이드 아래로 부드럽게 coverslip를 이동합니다. 커버 슬립이 슬라이드 경우엔 힘을 적용하지 마십시오. coverslip 줄을 될 때까지 슬라이드는 PBS에 rehydrated 수 있습니다D는 쉽게 제거할 수 있습니다. 종이 타월로 여분의 BSA를 수집하고 가로 슬라이드를 삽입합니다. 각 슬라이드에 기본 항체 솔루션의 Pipet 50 μl. 슬라이드 위에 균일하게 항체 솔루션을 확산하고 2 시간 동안 humidified 챔버에서 부화 coverslip로 다시 커버. </li><li> coverslips을 제거한 후 5 분 슬라이드에게 PBS로 세 번 씻어 </li><li> 1:500 양 반 마우스 Cy3와 1:400 염소 안티 쥐 알렉사 형석 488 다음 농도에서 5 % BSA의 보조 항체를 희석. </li><li> 로 기본 항체에 대한 설명 보조 항체 용액 50 μl를 적용합니다. 1 시간 동안 조명과 부화에서 슬라이드를 보호합니다. </li><li> coverslips을 제거한 후 5 분 슬라이드에게 PBS로 세 번 씻는다. </li><li> 각 슬라이드에 Vectashield 장착 매체의 한 방울을 추가하고 coverslip을 적용합니다. 부드럽게 coverslips을 누르면 종이 타월로 여분의 주위에 액체를 제거합니다. 투명 손톱 polis과 인감 coverslips그들이 건조 H 및하자. -20 ° C.에있는 슬라이드를 저장 </li></ol> 5. 이미지 수집 재료 : 형광 현미경, 카메라 연필 표시에 가​​까운 슬라이드에 침지 기름 한 방울을 장소와 섬유를 찾기 시작합니다. 일반적으로, 그곳에서 주요 섬유 번들이지만,이 섬유가 너무 얽혀 버린하고 나중에 분석할 수 없습니다. 섬유가 명확하게 (그림 2) 서로 분리 영역을 찾기 위해 멀리 기본 번들에서 이동합니다. 우리는 편견을 피하기 위해 한 색상 채널을 사용하여 사진을 선택합니다. 그렇다면, 우리는 매번 포인트, 집중력 또는 셀 라인의 약 10 사진을 찍는 것입니다. 그러나 사진의 숫자는 각 사진에 계산 수있는 얼마나 많은 섬유에 따라 달라집니다. 슬라이드 중 하나가 지역 대표 섬유 길이 또는 복제 구조를 제공하지 수 있으므로, 다른 사진을 찍을 수있는 슬라이드를 따라 이동합니다. 6. 데이터 분석 재료 : 그림 분석 프로그램, 예를 들어 ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) 사진 분석 프로그램에 사진을 가져옵니다. 섬유 책자 및 / 길이를 측정하거나 (그림 3) 서로 다른 복제 구조를 계산합니다. 단지 그림의 가장자리를 통해 연장하지 명확하게 표시하고있는 아르 섬유를 계산합니다. 우리는 일반적으로 약 100 섬유의 길이를 측정하고 150-200 복제 구조를 계산하고 우리는 각각의 실험에 적어도 세 번 반복합니다. 7. 대표 결과 : 새로 복제된 DNA는 항체 - 레이블 염기 analogues의 라인으로 시각하실 수 있습니다. 우리의 실험에서 지속적인 분기점이 인접 빨간색과 초록색 신호 (그림 3)로 표현된다. 이중 레이블 프로토콜은 또한 우리가 복제 구조의 네 개의 주요 클래스를 정의할 수 있습니다 : 1) 새로운 초기화 이벤트가 divid 수 있습니다<html> 세포가 처음으로 라벨과 두 번째 레이블 인큐베이션 기간 동안 해고 기원 incubated 동안 해고 기원에 에드. 전자 인근 녹색 빨강 - 녹색 신호와 녹색 라인만을 후기 구성되어 있습니다. 2) 종료 이벤트는 인접한 빨강 - 녹색 - 빨간색 신호로 명단. 3) interspersed 기원이 붙어 기원과 게놈의 사이트입니다. 이러한 사이트는 연속 기원과 종료 신호로 구성됩니다. 4) 지연 / 붕괴 포크는 하나만을 빨간 신호를 7 또는 짧은 녹색 넓이 8,9 다음 붉은 선으로 정의 될 수 실험 설계에 따라 다릅니다. 조건을 사용하면 야생 유형 DT40 세포가 0.4 μm의 / 분 평균 포크 속도를 가지고, 여기에 설명되어 있습니다. 우리는 약 63%에게 지속적인 포크, 10 % 기원, 16% 지연 포크 (적색 전용 책자), 8 % 종단 3 % interspersed 섬유를 검색할 수 있습니다. <html> ure 1 &quot;/&gt; . 그림 1 (A) 만화의 왼쪽은 DNA 라벨 절차의 첫 단계를 묘사 : 기하 급수적으로 증가하고 DT40 세포 이두를 추가하면 즉시 새로 합성 선도와 DNA의 긴 보온에 통합될 수있는 뉴클레오 티드 아날로그을 주도하고 있습니다. 이것은 특정 항체를 사용하여 시각 수 있으며, 현미경으로 볼 때 붉은 선으로 나타납니다. 그림의 오른쪽에있는 그림과 같이 그 후, 동일한 절차 CldU로 반복됩니다. 두 번째 뉴클레오 티드 아날로그와 부화 후, 적극적인 포크 인접한 빨강 - 녹색 넓이로 표시됩니다. 평균 섬유 길이는 염기 analogues의 배양 시간에 비례합니다. (B) lysed DT40 세포에서 DNA는 현미경 슬라이드에 중력에 의해 늘어 및 법인 염기 analogues은 특정 항체 및 형광 현미경을 사용하여 시각 점입니다. igure 2 &quot;/&gt; 그림 2. 대표 형광 이미지는 이후 이십분 각 이두와 CldU으로 표시 야생 유형 DT40 세포에서 섬유를 보여줍니다. 섬유의 대부분은 잘 서로 구분하기 때문에 쉽게 분석할 수 있습니다. 하얀 막대는 10 μm의를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="그림 3" /> . 그림 3 이중 라벨 섬유 기술은 하나가 다른 복제 구조를 구분할 수 있도록, 1 - 적극적으로 복제 포크, 2 - DNA 복제 (새 기원의 발포), 3의 새로운 사이트 - 포크 종단 (두 수렴 포크), 4 - interspersed 섬유 (붙어있는 기원의 장소) 및 5 - 지연 포크 (적색 신호 전용).

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	<li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40.">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li><li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA.">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li><li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner's+syndrome+cells.">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells.">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li><li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+cell+culture+conditions.">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li><li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint:+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses.">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li><li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair.">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li><li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40.">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 단일 분자 수준에서 S - 단계 동안 DNA 합성에 영향을 미치는 매개 변수의 정량 분석​​을 위해 허용하는 방법을 설명합니다. 지난 10 년 동안, DNA 섬유 fluorography 기술의 여러 버전은 살아있는 세포 내의 개별 복제 포크의 움직임을 시각화하기 위해 개발되었습니다. 이러한 모든 기술에 중요한 매개 변수는 잘 분리된 DNA 섬유를 제공하는 유리 표면에 DNA의 스트레칭 최상을 달성하는 데 사용되는 절차입니다. 이것을 달성하기위한 중요한 단계는 현미경 슬라이드뿐만 아니라 용해 시간에 세포 현탁액의 배양 시간입니다. 이러한 매개 변수는 특정 실험실에서 온도와 공기에 의존하고 경험적으로 결정되어야합니다. DNA 섬유 실험 실용적인 부분은 일반적으로 하루 만에 수행됩니다. 그러나, 이후의 그림 수집과 분석은 더 많은 시간이 소요됩니다 실천이 필요합니다. 라벨의 프로토콜은 광고 수다양한 과학 문제에 답변을 apted : 두 번째 펄스 라벨 동안 복제와 방해 에이전트를 사용하면 포크 신장 / replicative 스트레스에 대응 연기를 모니터합니다. 이 시나리오에서는 첫 번째 레이블이 두 번째 뉴클레오 티드로 씻겨 나간 할 필요가 없다는 초과에 추가됩니다. 또는 복제를 방해 약물은 조합 또는 첫 번째 레이블 외에 후 사용할 수 있습니다. 이것은 첫 번째 레이블을 필요로하고 두 번째 뉴클레오 티드 아날로그 전에 제거할 수있는 약물이 적용됩니다. 이 절차는 하나 replicative 스트레스의 조건 (예 : 포크가 연기 및 / 또는 붕괴) 아래 replicative 포크의 안정성 / 복구에 다양한 DNA 수리 요인의 중요성을 확인할 수 있습니다. 주목할만한, DNA 복제 프로그램의 세부 사항에 대한 자세한 분석은 현장 하이브 리다이 제이션에 빗질 DNA와 형광 결합 대체 접근법의 사용을 수행할 수 있습니다. 이것은 그러나, 기술적으로 더 도전하고 expen 필요sive 장비. 질적 및 양적 DNA 복제의 세부 사항을 분석할 수있는 능력은 DNA 복제 자체에 결함뿐만 아니라 복제 포크와 관련된 게놈 불안정성을 억제 경로를 조사를위한 필수적인 도구를 제공합니다. 의심의 여지가없이,이 분석은 더 이상 정상적인 세포가 반응 /뿐만 아니라 암 세포가 복제 포크를 대상으로 약물의 독성에 저항 이러한 메커니즘을 활용하는 방법으로 환경 변화에 적응할 수 있도록 복제 - 중재의 DNA 수리 메커니즘에 빛을 창고에 도움이 될 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 태아 소 혈청 금색 (FBS) </td><td> PAA </td><td> A15 - 151 </td><td></td></tr><tr><td> 닭 혈청 </td><td> 시그마 </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> PAA </td><td> P11 - 010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 21,875 </td><td></td></tr><tr><td> 5 Iodo - 2&#39; - deoxyuridine (이두) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> I7125 </td><td></td></tr><tr><td> 5 - 클로로 - 2&#39; - 데옥시 - 유리딘 (CldU) </td><td> 시그마 </td><td> C6891 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 SuperFrost을 슬라이드 </td><td> VWR </td><td> 631-0910 </td><td></td></tr><tr><td> 커버는 No1을 미끄러져 </td><td> 과학 실험실의 suppplies </td><td> MIC3234 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield 장착 매체 </td><td> H - 1000 벡터 실험실 </td><td> H - 1000 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 BrdU 항체 (마우스) </td><td> BD Biosciences </td><td> 347,580 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 BrdU 항체 (쥐) </td><td> Abcam </td><td> ab6326 </td><td></td></tr><tr><td> 양 반 마우스 Cy3 </td><td> 시그마 </td><td> C2181 </td><td></td></tr><tr><td> 염소 안티 쥐 알렉사 형석 488 항체 </td><td> Invitrogen </td><td> A110060 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of dna replication in the vertebrate model system dt40 using the dna fiber technique

복제 포크 안정성의 유지 보수 가능성을 유지하고 질병을 방지하기 위해 세포를 분리를위한 최고 중요성이다. 관련된 프로세스는 내생 및 외인성 DNA 손상의 얼굴에 충실한 게놈 복제를 보장뿐만 아니라 게놈 불안정성, 종양 개발에 인정 원인이되는 요인을 방지하지 않습니다. 여기, 우리는 간단하고 비용 효율적인 형광 현미경 기반의 조류 B - 세포주 DT40의 DNA 복제를 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 세포 라인 척추 세포 1 리버스 유전학에 의해 생체내 단백질의 기능을 조사하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 특정 유전자를 부족한 DT40 세포의 DNA 섬유 fluorography 하나가 DNA 복제와 게놈 안정성이 유전자 산물의 기능을 명료하게하다 수 있습니다. 척추 세포 복제 포크 역학을 분석하는 전통적인 방법은 펄스 표시된 세포의 인구의 DNA 합성의 전반적인 속도를 측정에 의존. 이것은 양적 접근이며 DNA 합성에 영향을 미치는 매개 변수의 정성 분석을 위해 허용하지 않습니다. DNA 섬유 기술 2-4 사용하면 대조적으로, 적극적인 포크의 움직임의 속도는 바로 다음 수 있습니다. 이 방법에서는, 초기 DNA는 할로겐화 세포핵의 결합 (그림 1A)에 의해 생체내에 표시됩니다. 그 후, 각각의 섬유는 현미경 슬라이드에 뻗어 있으며, 레이블이 붙은 DNA 복제 책자는 특정 항체 물들일 및 형광 현미경 (그림의 1B)에 의해 시각입니다. 복제뿐만 아니라 포크 방향의 개시 두 다르게 수정 analogues의 연속 사용에 의해 결정됩니다. 또한, 이중 라벨 부착 방식은 S - 단계에서 DNA 합성에 영향을 미치는 매개 변수의 정량 분석​​을 허용 등 지속 및 지연 포크, 복제 원산지 밀도뿐만 아니라 포크 종단과 같은 즉, 복제 구조. 마지막으로, 실험 절차는 수행할 수 있습니다하루 이내에 에드, 그리고는 일반적인 실험실 장비 및 형광 현미경이 필요합니다.

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Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

DT40, 모델 척추 유전 시스템은 단백질 기능을 분석하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 여기서 우리는 단일 분자 수준에서 DT40 세포에있는 S - 단계에서 DNA 합성에 영향을 미치는 매개 변수의 정성 분석을 수있는 간단한 방법을 설명합니다.

DNA 복제의 시각화는 척추 모델 시스템 DT40의 DNA 섬유 기술을 사용하여

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

형광 현미경과 함께 머릿속으로 단일 분자의 DNA 복제

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

연구

생물학

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

인간의 DNA 수리 단백질의 유전자 연구는 모델 시스템으로 효모를 사용하여

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

의 시각화 Caenorhabditis Elegans</emLipophilic 바이탈 염료, DiI를 사용하기> 표피 구조

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

펩타이드를 결합 형광 단백질 DNA와 표면 닿는 큰 DNA 분자의 시각화

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.