1. 셋업

버퍼 및 시약

1. 칼슘이나 마그네슘이 없는 멸균 인산염 완충식염(PBS)
2. 코팅 버퍼- 멸균 PBS 또는 탄산완충제
3. PBS의 분석 희석제- 10% 태아 소 혈청 (FBS)
4. 세포 배양 배지-RPMI 1640 와 10% FBS, 페니실린/연쇄 절제술, 및 L-글루타민
5. 워시 버퍼- PBS 포함 0.05% Tween20
6. 이중 증류수(ddH₂O)
7. 검출 기판- 100 mg AEC (3-아미노-9-에틸 카르바졸) 10 mL DMF (N,N, 디메틸포르미드).

설비

8. 라미나르 플로우 후드
9. 가습 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO_2로설정)
10. 자동 ELISPOT 리더 또는 해부 현미경

자료

11. 엘리스팟 플레이트
12. 멸균 및 비멸 저수지
13. 파이프토르 와 팁
14. 멸균 세로지컬 파이펫
15. 멸균, 원식 폴리 프로필렌 튜브
16. 플레이트 세척을 위한 스퀴즈 병 2개

분석 특정 시약

17. 세포-1차 세포 또는 세포주(여기, C57BL/6 마우스로부터 의 비장구가 사용됨)
18. 각성제-미토겐 또는 항원(여기, phorbol 12-myristate 13-아세테이트(PMA, 50 ng/mL) 및 이오노마이신(1 μM)이 사용되었습니다.
19. 1차 항체-생체분해된 항세포카인 검출 항체(분석 희석제에서 2 μg/mL로 희석)
20. 이차 항체- 연쇄상구당-고추냉이 과산화제 (SAv-HRP)

2. 절차

코팅

1. 조건멸 및 라미나르 유동 후드 내부에 보관하고, 정제된 항 사이토카인 포획 항체를 멸균 코팅 버퍼에서 0.5-4.0 μg/mL의 최종 농도로 희석한다. (참고: IFN-γ 및 IL-6의 경우 5 μg/mL을 사용합니다.)
2. 캡처 항체 용액, 100 μL/웰, ELISPOT 플레이트로 전송합니다.
3. 플레이트 커버로 접시를 덮고 밀봉하여 증발을 방지합니다.
4. 접시를 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

블로킹

5. 다음 날, 라미나르 플로우 후드에 ELISPOT 플레이트를 발견합니다. 플레이트를 멸균 물티슈에 빠르게 반전하여 각 우물에서 캡처 항체 용액을 제거합니다.
6. 그런 다음 각 웰에 세포 배양 배지의 200 μL을 추가합니다. 이 단계는 분석 중에 비특이적 바인딩을 차단합니다.
7. 플레이트 커버를 교체하고 37°C에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다.

도금 및 활성화 셀

8. 플레이트가 배양하는 동안 세포 배양 배지에서 50 ng/mL PMA 및 1 μM 이오노마이신을 함유한 2X 미토겐 용액을 준비한다.
9. 이어서, 표적 세포 현탁액을 2 x 10⁶ 셀/mL의 육수 농도로 준비한다.
10. 인큐베이션이 완료된 후, 라미나르 플로우 후드 내부의 멸균 물티슈에 플레이트를 빠르게 반전시켜 각 우물에서 세포 배양 배지를 제거한다.
11. 다음으로, 스톡 셀 서스펜션 용액의 2X 직렬 희석을 생성한다. 이렇게 하려면 먼저 준비된 셀룰러 서스펜션 스톡 용액의 200 μL을 ELISPOT 플레이트의 맨 위 줄의 우물에 넣습니다.
12. 그런 다음, 세포 스톡 용액을 포함하는 행 아래 플레이트의 다음 5행에 일반 세포 배양 배지 100 μL을 추가한다.
13. 그 후, 맨 위 행에서 바로 아래 행으로 셀룰러 서스펜션의 100 μL을 파이프하여 2X 직렬 희석을 수행합니다. 이 솔루션을 위아래로 부드럽게 파이프하여 세포를 분포할 수 있도록 적절한 혼합을 보장합니다.
14. 나머지 네 행에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
15. 문화 매체만으로 여섯 번째 행을 둡니다. 그것은 실험 적인 제어 역할을 할 것입니다.
16. 다음으로, 준비된 미토겐 용액의 100μL을 플레이트의 처음 5열의 실험적 우물에 추가한다. 대조군 우물과 여섯 번째 행에서 미토겐없이 세포 배양 배지의 100 μL을 추가합니다.
17. 플레이트 커버를 교체하고 플레이트를 37°C로 교체하고, 인큐베이터에서 5% CO_2를 20-48시간 동안 교체합니다. (참고: 20-24시간은 일반적으로 IL-2 및 TNF-α 검출하기에 충분하지만 IL-4 및 IFN-γ 48시간이 최적입니다.

탐지

1차 항체

18. 분석 희석제에서 2 μg/mL의 농도로 항체를 검출하는 생체 개화 된 항 사이토카인을 준비합니다.
19. PBS에서 0.05% Tween-20을 혼합하여 이 시점에서 20-25mL의 워시 버퍼를 준비하십시오.
20. 인큐베이션이 완료되면 접시를 풀고 싱크대에 빠르게 반전하여 우물에서 모든 액체를 제거합니다. (참고:이 시점 이후에는 플레이트를 더 이상 멸균 상태로 보관할 필요가 없습니다).
21. 그런 다음 각 웰에 ~200 μL 세척 버퍼를 추가하여 접시를 씻으시고 씻어 주세요. 이 액체를 재빨리 반전시키고 싱크대 위로 판을 쓸어 넘깁니다. 총 5개의 세시에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
22. 다음으로, 각 웰에 항체 용액을 검출하는 희석된 바이오티니징 항 세포카인의 100 μL을 추가한다. 실온에서 2시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.

이차 항체

23. 인큐베이션이 완료된 후 싱크대 위로 플레이트를 반전시키고 쓸어 넘기면 검출 항체를 추방합니다.
24. 이전과 마찬가지로, ~ 200 μL 세척 버퍼로 접시를 5 번 세척하여 각 세척 사이에 액체를 배출하십시오.
25. 다음으로 각 우물에 희석 된 스트렙타비딘 고추냉이 과로시다제 용액 100 μL을 추가합니다 (분석 희석제에서 미리 결정된 최적의 농도로 희석).
26. 플레이트 커버를 교체하고 37°C에서 1.5-2시간 동안 실온에서 배양합니다.

기판

27. 인큐베이션 후, 사용하기 15분 전에 제조업체의 지침에 따라 AEC 기판 용액을 먼저 활성화합니다.
28. 다음으로, 우물의 내용물들을 버리고 이전과 마찬가지로 워시 버퍼로 접시를 5번 씻는다.
29. 그런 다음 준비된 AEC 기판 용액 100 μL을 각 웰에 즉시 추가합니다.
30. 스팟 개발을 모니터링하면서 - 10-20 분 동안 실온에서 플레이트를 배양하십시오.
31. 접시를 물로 헹구고 접시를 싱크대 위로 쓸어 넘기면 반응을 멈춥시다.
32. 종이 타월에 접시를 부수고 접시가 밤새 또는 완전히 건조 될 때까지 공기 건조할 수 있도록합니다. 접시 아래에 플라스틱 트레이를 제거하면 건조가 용이합니다.

3. 데이터 수집 및 분석

1. 건조 후, 반점은 자동화 된 플레이트 리더로 계산 할 준비가되어 있습니다. 여기서 CTL Immunospot 판독기가 사용되지만 이 프로토콜은 모든 판독기에게 적용될 수 있습니다.
2. 먼저 계측기를 켜고 컴퓨터를 켭니다. 그런 다음 CTL 프로그램을 열고 "스캔 수"를 클릭합니다.
3. 트레이가 기기에서 확장하려면 "배출"을 푸시합니다. 그런 다음, 플라스틱 어댑터를 제거하고 ELISPOT 플레이트 및 어댑터에 행 "A"를 정렬합니다.
4. 파일을 저장할 파일 이름과 위치를 선택하고 접시를 트레이에 로드합니다.
5. 그런 다음 소프트웨어의 "로드"를 클릭하고 컴퓨터 측면의 문을 닫습니다.
6. "계산 후 시작"을 누릅니다. 파일이 저장되었는지 확인하고 품질 관리 "QC" 소프트웨어를 열어 데이터를 분석하고 반점 수를 계산합니다.

노트:

1. 최소 셀 수는 예비 실험에서 결정되어야 합니다. 최적의 반점 수는 ~50/well입니다. 너무 많은 세포가 로드되면 뚜렷한 반점을 감지하기가 어려울 것입니다. 추가적으로, 세포는 중첩되고 막에 단층을 형성하지 않을 수 있습니다, 따라서 검출의 수준이 감소될 수 있습니다.
2. 실험을 최적화할 때, 표적 단백질의 예상 발현 수준을 고려한다. 발현이 낮을수록 웰당 필요한 셀 수가 높아집니다.
3. ELISA와 는 달리 플레이트 세탁기를 사용하기보다는 접시를 손으로 씻는 것이 좋습니다. ELISPOT 플레이트는 더 섬세하며 PVDF 멤브레인에 구멍을 뚫는 것을 피해야합니다.
4. 하나는 얼룩을 일으킬 수 있으므로 잠복 기 동안 플레이트의 움직임을 제한해야합니다.
5. 직접 광에 노출되면 반점이 사라지기 때문에 플레이트는 어둠 속에서 저장되어야 합니다.