This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.

인간의 말초 혈액은 동의서에서 건강한 기증자로부터 얻을 수 있어야하며, 혈액 샘플의 사용은 개별 기관 생명 윤리위원회에 의해 설립 승인 가이드 라인을 준수해야합니다. 본 연구에서는 프로토콜은 국립 대만 대학 병원의 내부 검토위원회 (프로토콜 번호 201307019RINB)에 의해 승인되었다 유동 세포 계측법 (그림 1)과 ELISPOT 분석 (그림 3)의 결과의 데모 인간의 혈액을 사용합니다. 1. 분리 및 인간의 말초 혈액 B 세포의 정화 <ol><li> K 2 EDTA (1.5-2.0 ㎎ / ㎖의 혈액을)를 포함하는 15 ML의 튜브로 (팔꿈치에 cubital 포사 앞쪽에) 중간 cubital 정맥에서 혈액 ~ 10 ㎖를 그리고 즉시 튜브를 응고를 방지하기 위해 여러 번 반전 형성. </li><li> 적혈구가 (RBC)의 버퍼 (150 mM의 NH 4 CL, 10 mM의 KHCO 3, 1 mM의 EDTA를 용해 (121 ° C, 15 분) 오토 클레이브의 35 mL를 넣고, 페이지신선한 혈액 샘플 (≥ 3 함유 튜브 H 7.4) : 1 부피 / 부피)을 더 이상 5 분 동안 실온 (RT)에서 배양한다. 주 : 튜브를 통해 빛의 전송의 모양은 RBC 용해의 완료를 나타냅니다. </li><li> 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 펠렛 색 흰색 있는지 확인하십시오. </li><li> 10 멸균 된 인산 완충 식염수 mL로 펠렛을 재현 탁 (PBS, 137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 4.3 mM의 나 2 HPO 4, 1.47 mM의 KH 2 PO 4, 산도 7.4) 단계 1.3에서와 같이 원심 분리기. </li><li> 상등액을 버리고 ㎖의 RPMI 1640 배지 (첨가제 : 10 % 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신, 0.25 μg의 / ㎖의 암포 테리 신 B, 및 2 mM L- 글루타민) 10 펠렛을 재현 탁 다음과는 판형 10 cm 배양 접시에 세포 (접시 당 혈액 10 ㎖). 30 분 동안 5 % CO 2와 37 °의 C 배양기에서 접시를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 배양 접시를 몇 번 소용돌이 및 배치15 ML의 플라스틱 원뿔 튜브에 배지 (서스펜션 세포). 배양 접시에 부착 세포 (주로 대 식세포)를 폐기하십시오. </li><li> 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다. </li><li> RPMI 1640 배지 1 ㎖로 펠렛을 재현 탁. 혈구 또는 자동 셀 카운터 셀 수를 계산합니다. 주 : 절연 백혈구의 생존 정상적으로 트리 판 블루 배제에 의해 90 %보다 크다. </li><li> 단계 1.7에서와 같이 원심 분리기 (5)의 농도로 차가운 PBS 완충액 (0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 2 mM의 EDTA)의 ~ 200 μL의 세포를 재현 탁 - 10 × 106 세포 / ㎖. </li><li> 106 세포 당 (B 세포를 음성 선별 용) 혈액 세포에 특정 비오틴 화 항 - 인간 구간 칵테일 5 μL를 넣고, 30 분 21 얼음 위에서 배양한다. 참고 : 항 - 인간 Ab의 칵테일은 적어도 CD2 (또는 CD3), CD14 및 CD16 특정 애비를 포함해야합니다. </li><li> 10 배를 초과하는 볼륨 추가멸균 PBS의 세포를 5 분 동안 600 × g으로 원심 분리하고, 상등액을 폐기한다. </li><li> 동일 스트렙 타비 딘 - 복합 마이크로 비드의 양 펠릿에 (10 6 세포 당 5 μL)을 추가하고 철저하게 섞는다. </li><li> 15 ML의 플라스틱 원뿔 튜브에서 30 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 튜브에 PBS 버퍼 2 ML을 추가합니다. </li><li> 자기 스탠드에 튜브를 삽입하고 8 분 동안 실온에서 품어. 갈색 마이크로 비드 서서히 옆의 자석 (22)에 튜브 벽에 부착된다. </li><li> 자기 스탠드에 남아있는 관으로, 조심스럽게 새로운 멸균 15 ML의 튜브 (22)에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 반복 1.16-1.14 단계를하고, 손길이 닿지 않은 B 세포를 포함하는 두 개의 상층 액을 결합한다. 마이크로 비드를 폐기하십시오. </li><li> 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다. </li><li> 하류 실험 RPMI 1640 배지에 펠렛을 재현 탁. 참고 : 일반적으로 1-5 × 10 5 B 세포의 지혜HA 말초 혈액 10 mL의 95 % 이상의 순도가 23을 분리 할 수있다. </li></ol> 격리 된 B 세포 2. 정제 및 메모리의 분리 및 나이브 B 세포 <ol><li> 단계 1에서 정제 된 세포를 사용하여 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 결정한다. </li><li> 5 분 동안 600 × g으로 원심 분리 및 RT 후 차가운 PBS 완충액 100 μL의 세포를 재현 탁. </li><li> 추가 1 - 10 6 세포 당 바이오틴 CD27 단클론 항체 μg의 2를 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다. </li><li> 5 분 동안 600 XG에 튜브와 원심 분리기에 PBS 버퍼의 10 ML을 추가합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 PBS 버퍼 50 μL의 세포를 재현 탁. </li><li> 15 ML의 플라스틱 원뿔 튜브에 세포 - (2 μg의 / 10 6 세포 1) 스트렙 타비 딘 자기 마이크로 비즈의 동일한 금액을 추가합니다. </li><li> 부드럽게 잘 혼합하고, 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다. </li><li> 튜브에 PBS 버퍼의 3 mL의 - (2)를 추가합니다. </li><li> 놓고자기 스탠드에 관하고 갈색 마이크로 비드를 자석에 가까운 측에 부착 할 수 있도록 8 분 동안 RT에서 배양한다. </li><li> 자기 받침대의 관을 조심스럽게 새로운 멸균 튜브로 상청액 분획을 전송. 순진한 B 세포 -이 부분은 풍부한 CD27가 포함되어 있습니다. </li><li> 마이크로 비드를 포함하는 튜브에 5 mL를 추가하고 부드럽게 마이크로 비드를 재현 탁 (즉, CD27 + 메모리 B 세포의 농축 비율) 24 ~ 25. </li><li> 5 분 동안 실온에서 600 XG에 원심 분리기. 하류 실험 RPMI 1640 배지와 펠렛을 재현 탁. 주 : 일반적으로, ~ 30 - B 세포의 60 %는 건강한 공여체 (7), 25-26의 한 PBMC로부터의 CD27 + 메모리 셀들로 정제 할 수있다. </li></ol> 나이브 B 세포, 메모리 B 세포 및 PB들 /의 PC의 컬렉션에 대한 정렬 3. 셀 <ol><li> 단계 1에서 정제 된 세포를 사용하는 hemocytome를 이용하여 세포 수를 결정터 또는 자동 세포 계수기. </li><li> 5 mL의 폴리스티렌 튜브에서 107 mL 당 농도에 차가운 PBS 완충액으로 세포를 재현 탁. </li><li> 1 추가 - 10 6 셀 당 인간 IgG의 2 μg의 및은 FC 블록 10 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 1 μg의 각 추가 항 CD19를-APC (클론 : HIB19), 항 CD27-eFluor450 (클론 : O323), 및 항 CD38-PE (클론 : HIT2) 10 6 세포 당; 잘 혼합하고 30 분 4, 27 얼음에 품어. </li><li> 단계 3.4의 마지막 5 분에서, 상업 7 aminoactinomycin의 D (7-AAD)의 5 μL를 추가합니다. </li><li> 5 분 동안 600 XG에 튜브, 소용돌이, 그리고 원심 분리기에 PBS의 2 ML을 추가합니다. </li><li> 15 ㎖의 튜브 용액 당 5 × 107 세포 - 1의 농도 (2 % BSA, 2 mM의 EDTA로 멸균 PBS) 정렬 버퍼에 세포를 재현 탁. </li><li> 세포 덩어리를 제거하기 위해 나일론 메쉬 셀 스트레이너 (40 ㎛의 공극 크기)를 통해 세포를 필터. </li><li> 유동 세포 계측 정렬하여 세포를 분리바이올렛 (405 ㎚), 청색 (488 nm의)과 빨간색 (640 ㎚) : 어 세 가지 레이저를 장착. 참고 : 3 색이 세포 계측법 27-28 흐름을 위해 혼자 블루 레이저 충분하다. </li><li> 정렬 세 나이브 B 세포의 동시 수집을 위해 (5 ㎖ RPMI 매질 포함) 15-㎖의 튜브 (CD19 + CD27 -)로 세포, 기억 세포 (CD19 + CD27 +) 및 PB들 / PC를 (CD19 + CD27 + / 하이 CD38의 +) 3-4, 28. 주의 : 단계 4에 기재된 바와 같이 분류 및 나이브 기억 B 세포를 배양 할 수있다. </li></ol> 나이브 B 세포 - 고립 된 인간의 CD19 + B 세포, CD19 + CD27 + 메모리 B 세포와 CD19 + CD27의 체외 분화 4. <ol><li> 단계 1.19, 2.10, 2.11 및 3.10로 정제하여 세포를 이용하여 혈구 또는 자동 세포 계수기로 세포 수를 결정한다. </li><li> RPMI 1640 배지로 세포를 재현 탁1의 농도에서 -는 ml 당 10 × 105은 12 웰 플레이트로 나누어지는. </li><li> / mL의 18, 29 5 μg의 / 10 6 세포에서의 CpG (ODN 2006)를 추가합니다. </li><li> 배양 5 일간 5 % CO 2, 37 ° C의 배양기에서 세포. </li><li> 물론 각각의 세포를 수확 15 ML의 튜브에 개별적으로 배치, 각 튜브에 PBS의 5 mL를 넣어 5 분 동안 600 XG와 RT에서 그들을 원심 분리기. </li><li> 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 카운트. RPMI 1640 배지로 용액에 10 × 105 - (1)의 농도로 세포를 재현 탁. </li></ol> 5. ELISPOT 분석 <ol><li> 30 초 동안 ELISPOT 플레이트의 각 웰에 증류수 35 % 에탄올의 30 μL를 추가한다. 참고 : 피펫 팅 할 때, 항상 우물에서 막를 만지지 마십시오. </li><li> 에탄올을 제거하기 위해 ELISPOT 판을 반전. </li><li> 각 웰에 150 μL 멸균 DDH 2 O의 넣고 배양5 분간 RT에서 그들을 잔류 에탄올을 세척하는 단계; 3 분 동안 실온에서 멸균 PBS의 세척에 따릅니다. 참고 : 5.3-5.1이 판의 제조에 따라 선택 될 수있다 단계. </li><li> 넣어 5 μg의 / mL의 클론 F (AB &#39;) 항 - 인간 IG (IgG의 + IgM의 +의 IgA)의 2 조각 50 μL 4 ° C에서 하룻밤을 품어 (PBS로) ELISPOT 플레이트의 각 웰에와 (선호) 또는 2 시간 11 37 ° C를. 참고 : 사용할 때까지 파라 필름과 판의 가장자리를 밀봉합니다. </li><li> 3 분마다 RT에서 두 번, 언 바운드 복근을 제거 각 웰에 PBS 200 μL를 추가하고,이를 배양 접시를 반전. </li><li> 잘 차단 각각 5 % BSA (또는 RPMI 1640 배지)를 PBS 200 μL를 추가하고, 실온에서 2 시간 동안 이들을 배양한다. </li><li> 차단 버퍼를 제거하기 위해 번호판을 반전. 단계 5.5에서와 같이 PBS의 200 μL와 각 웰에 두 번 씻으십시오. </li><li> 각 웰에 RPMI 1640 배지 100 μL를 추가하고 37 ° C에서 그들을 품어. </li><li> 준비된 세포를 시드하는 경우, RPMI 1640 배지를 제거하기 위해 반전 플레이트. </li><li> 종자 100 μL (5 × 104) 50 μL (2.5 × 104)과의 웰에 25 μL의 셀 (1.25 × 104) (단계 1.19, 2.10, 2.11, 3.10에서 4.6) ELISPOT 판. RPMI 1640 배지로, / 잘 150 μL에 볼륨을 가지고. 참고 : 세포를 도금 하나 또는 두 개의 2 배 연속 희석의 최소 권장합니다. </li><li> 14 시간 18-8 5 % CO 2와 37 ° C를 인큐베이터에서 접시를 품어. 배양 중에 플레이트를 이동하지 마십시오. </li><li> 세포 및 RPMI 1640 배지를 제거하는 번호판을 반전. </li><li> 3 분 동안 실온에서 때마다 5 회 (0.05 % 트윈 20과 PBS) 200 μL / 잘 PBS-T의를 추가하고 그들에게 품어. 5 회 세척 각 사이의 세척 완충액을 제거하기 위해 판을 전환. </li><li> 염소 항 - 인간 IgG-알칼리성 포스파타제 (AP), Fcγ 특정 애비를 추가 (IgG를 감지, 1 : 5,000 PBS-T에서) 또는 염소 항 - 인간 IgM의-AP, Fcμ 단편 특정 애비 (IgM의 검출, 1 : PBS-T 5,000) 지정된 우물에와 어둠 속에서 실온에서 2 시간 동안 배양한다. </li><li> 단계 5.5에서와 같이 PBS의 200 μL와 각 웰에 두 번 씻으십시오. </li><li> 50 μL / 웰의 bromochloroindolyl 인산 니트로 블루 테트라 졸륨 (BCIP / NBT) 기질 용액을 추가합니다. 15 분 - 퍼플 색의 반점은 보통 5에 나타납니다. </li><li> 관광 명소의 과도한 개발을 방지하기 위해 100 μL / 잘 DDH 2 O를 추가합니다. </li><li> 모든 지점의 전체 개발 후 수돗물을 실행하는 접시를 씻어. </li><li> 판의 암거를 제거하고 어둠 속에서 공기 건조 할 수 있습니다. </li><li> 이미지 획득 / 분석 부 (예를 들면, 자동 또는 수동으로 스캐너 해부 현미경을 통해)로 자동 플레이트 판독기를 사용하여 스폿을 카운트. 주 : 플레이트를 어두운 곳에서 실온에서 저장하고 나중에 분석 될 수있다. </li></ol>

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분리 및 인간의 말초 혈액 B 세포의 정화 일반적으로 적혈구 효율적으로 파열 및 용해 버퍼 (단계 1.2)에 의해 삭제 될 수 있습니다. 세포 생존율은 염화 암모늄에 의해 영향을받을 수 있습니다로는 5 분 이상 더 이상 RBC 용해 버퍼 PBMC를 품어하지 않는 것이 중요합니다. 대안 적으로, 적혈구 및 혈소판 동시에 다음의 프로토콜에 의해 제거 될 수있다. 산 스트...

B 세포는 체액 면역의 발달에서 중요한 역할을한다. 그들은 초기 골수에서 개발 발전 용 나이브 비장으로서 림프 조직으로 이전 할 수 B 세포, 림프절, 및 편도로 혈류를 입력한다. 의 Ag 조우되면 어떤 나이브 B 세포는 배 중심 B 세포는 기억 B 세포 plasmablasts (PBS) / 혈장 세포 (PCS)로 분화 할 수 림프 여포로 이동한다. 대부분 PB들 / PC는 혈류로 송신하는 동안 거의 결국 장수의 PC (1)로 단말 분화를 거치도록 골수에 존재. 순환 B 세포는 이종이며, 정상 상태에서, PB들 / PC는 말초 혈액 2 드물다. 계통 특정 표면 마커의 사용 가능성의 결과로, 유동 세포 계측법 말초 혈액 내의 B 세포의 서브 세트의 식별 및 특성화를위한 대중적인 방법이되었다. 흐름 cytometr의 확장 응용 프로그램Y는 고순도의 분리 및 B 세포의 서브 세트 각각의 분리를 허용하는 셀 소터 기능의 추가이다. 인간 순환 B 세포는 일반적으로 세 가지 주요 부분 집단으로 분류 다양한 발달 단계에있는 특정 표면 수용체의 발현에 근거 : 기억 세포 (CD19 + CD27 + CD38 -) 나이브 B 세포 (- - CD38 CD19 + CD27) 및 PB들 / PC를 (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (그림 1). 본래 순진한 B 세포는 Ag로 발생하지 않았습니다. 그러나, 그들은 + CD27 + IgM의 기억 세포로 분화 될 수있다. 나이브 B 세포는 B 세포 항원 수용체 (BCR) -associated 분자 (예를 들어, CD19, CD20 및 CD22) 그들의 면역 레퍼토리 5 이질적 표현에서 균일하지만. CD27 + 기억 세포의 대부분은 CD27로 분화 될 수있다+ / 하이 CD38 + PB들 / PC를 6. 또한, 기억 세포 PBS를 / PC는 폴리 클로 날이고 발달 및 기능 4-7 이질성을 나타낸다. 순환 PB들 / PC는 일반적으로 수명이 짧은하고 CD138을 표현하지 않지만, 골수에 정착 만든 사람들은 말기 차별화하고 수명이 긴 될 것입니다. 말기 차별화 된 PC는 CD138을 표현하고 그 표면 8 CD27 분자를 하향 조절한다. PB들과 PC 모두 복근을 분비 할 수 있기 때문에, 많은 경우에 그들은 집합의 ASC로 표시된다. 대조적으로, 항원에 노출 된 적이없는 B 세포 나 기억 세포도 복근 9-10의 상당한 양을 생산할 수있다. 적절한 배양 조건 (6), 11-15에 위치 할 때 십일 - 절연 경우 역시, 양쪽 나이브 메모리 B 세포는 3의 ASC로 분화 될 수있다. 사실,의 ASC는 그 직접 고립 된 프랑스와 CD27과 CD38의 체외 분화 공유 유사한 표면 표현에서 파생 된톰 말초 혈액 (6). 또한, 시험관 내에서 분화의 ASC는 PB들 / 6 PC의 순환 유사한 표면 CD20의 낮은 레벨을 표현한다. 문화 유래의 ASC 모든 수명이 짧은 있지만, 그들은 기능적 능력과 체액 성 면역에 기여 할 수 있음을 나타냅니다 복근을 분비 할 수 있습니다. 지금까지와 가장 일반적으로 적용되는 방법은 체액 성 면역 반응에 대한 기능 정보를 획득하여 ELISA 및 ELISPOT 모두이다. ELISA 96 웰 플레이트 기반 분석이며, 자주 혈청 AG-특정 복근 및 기타 분석 (예, 사이토 카인)의 역가를 측정하는데 사용된다. 그것은 편리하고 확장 가능합니다. ELISA는 액체 시료 (16)에, 절대치 또는 혈청과 같은 다른 물질의 존재를 검출하기 위해 고상 효소 분석을 사용하도록 설계된다. 혈청의 ELISA를 판독 널리 신체의 면역 반응을 나타내는 데 사용되었다. 재 취득에 필요한 도구ELISA 분석에서 adouts는 분광 마이크로 플레이트 리더입니다. 독자는 일반적으로 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) - 컨쥬 게이트 검출 복근 특정 기판 (17)의 반응으로부터 생성 된 최종 생성물의 광학 밀도 (OD)를 결정할 수있다. 체액 성 면역 반응을보고와 관련하여, ELISA에 의해 결정 혈청 구간 레벨은 본문에서의 ASC의 집단했지만 개별없는 성능을 나타낸다. 또한, ELISA 계정으로 복근을 분비하지 않는 메모리 B 세포에 의해 참여를 취할 수 없습니다. ELISA와 마찬가지로, ELISPOT은 검출 및 말초 혈액 샘플 17 ~ 18에서 면역 반응을 모니터링하는 데 널리 사용되는 방법이다. ELISPOT는 샌드위치 ELISA에 관한 기술이다. 그것에서, 세포는 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 (PVDF) 단기 배양 용 96 웰 마이크로 플레이트의 막 역행 웰에 배치된다. ELISPOT 분석은 마이크로 및 developin에 웨스턴 블로 팅을 수행하는 유사g 각 웰의 PVDF 막에있는 관광 명소입니다. 자동화 ELISPOT 리더 시스템 또는 수동 계산을위한 실체 현미경이 필요합니다. 면역 반응을 검출 ELISPOT에서의 가장 큰 장점의 ASC 및 사이토 카인을 분비하는 세포의 정량화는 뛰어난 감도이다. 그것은 각각 체액 성 및 세포 성 면역에 기능적 활동을보고합니다. 체액 성 면역 기능의 측정에는, ELISA 및 ELISPOT 열거의 ASC의 수에 의해 결정 혈청 구간 레벨들은 상관되어 있지만, 이들 두 분석으로부터의 데이터 판독 기능은 영향 19-20에서 약간의 차이가있다. ELISPOT의 가장 큰 장점은 방법의 감도입니다. 복근의 적절한 이소 타입의 알려진 양이 참조 용으로 포함되고 ELISA에 의해보고 된 혈청 구간 역가 수준 농도 판독으로 더 정량적으로 상대 구간 레벨을 나타내는, OD 판독으로 반 정량적으로 제시하거나한다. 반대로, ELISPOT의 결과이다 presente관심의 세포 풀의 ASC의 절대 수와 D (예를 들어, 분획 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 한 PBMC로부터 정제 된 B 세포). ELISPOT은 하나의 ASC를 감지 할 수 있지만, ELISA 전에 측정에 최적화 된 분석에 의존하는 농도에 도달의 ASC에서 Ab의 금액이 필요합니다. 따라서, ELISPOT은 정량 감도 ELISA에 분명 우수하다. 또한, ELISPOT은 활성화 기억 세포의 체외 분화의 ASC 정량화에 적합하다. 메모리 B 세포는 복근을 분비하지 않지만 활성화시의 ASC로 분화 할 수 있습니다; 그들은 따라서 ELISA에 의해 검출 된 혈청 복근에 기여가 없습니다. 따라서, ELISPOT 배양에서 활성화 후 기억 세포 순환의 면역 반응의 측정에있어서 선택의 방법이다. 이는 장기 체액 면역의 유지의 모니터링을 허용한다.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer K2E</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td>10 mL tube</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>endotoxin-free</td></tr><tr><td>Trypan blue 0.5% solution</td><td>Biological Industries</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>IMag Human B lymphocyte enrichment set</td><td>BD Biosciences</td><td>558007</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated CD27 mAb</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>Streptavidin magnetic microbeads</td><td>BD Biosciences</td><td>9000810</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Blue nylon mesh cell strainer, 40 &amp;mu;m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD19-APC</td><td>Biolegend</td><td>302212</td><td>clone HIB19</td></tr><tr><td>Anti-human CD27-eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0279-42</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>Anti-human CD38-PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>303516</td><td>clone HIT2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-human CD38-PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>560677</td><td>clone HIT2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-human CD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>304006</td><td>clone HI30</td></tr><tr><td>Anti-human CD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td>clone HI30</td></tr><tr><td>Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>124213</td><td>clone LG.3A10</td></tr><tr><td>Anti-human CD27-PerCP Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>65429</td><td>clone L128</td></tr><tr><td>Anti-human CD19-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-064</td><td>clone LT19</td></tr><tr><td>Anti-human CD19-FITC</td><td>GeneTex</td><td>GTX75599</td><td>clone LT19</td></tr><tr><td>Anti-human CD20-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555622</td><td>clone 2H7</td></tr><tr><td>biotinylated anti-human CD27</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>biotinylated anti-human CD27</td><td>eBioscience</td><td>13-0279-80</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>CpG (ODN 2006)&amp;nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-2006</td><td>type B CpG</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-10</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-21</td><td>PeproTech</td><td>200-21</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human sCD40L</td><td>PeproTech</td><td>310-02</td><td></td></tr><tr><td>Protein A of &lt;em&gt;S. aureus &lt;/em&gt;Cowan (SAC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>82526</td><td></td></tr><tr><td>Pokeweed mitogen (PWM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9379</td><td></td></tr><tr><td>MultiScreen filter plates, 0.45 &amp;micro;m pore size</td><td>Merck Millipore</td><td>MSIPS4510</td><td>sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane</td></tr><tr><td>BCIP/NBT solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6404</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate</td><td>Merck Millipore</td><td>ES006</td><td></td></tr><tr><td>Human IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Human IgG, Fc fragment</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>F(ab&#039;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; fragment of goat anti-human Ig (IgG + IgM + IgA)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-127</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fc&amp;gamma; fragment specific</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fc&amp;micro; fragment specific</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-043</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-human IgG-peroxidase, Fc&amp;gamma; fragment specific</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-008</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-human IgM-peroxidase, Fc&amp;micro; fragment specific</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-095</td><td></td></tr><tr><td>BD ELISPOT AEC substrate kit</td><td>BD Biosciences</td><td>551951</td><td></td></tr><tr><td>C.T.L. ImmunoSpot analyzer</td><td>C.T.L.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the isolation, differentiation, and quantification of human antibody-secreting b cells from blood: elispot as a functional readout of humoral immunity

체액 면역의 특징은 합성과 같은 병원체 항원은 (Ag), 특정 복근을 분비하고, 숙주 방어를 위해 사용되는 기능의 ASC를 생성하는 것이다. 개별의 체액 성 면역 반응의 기능적 상태의 정량, 혈청 복근 순환의 ASC는 모두 공통 기능 판독으로서 측정된다. 인간 말초 혈액 호스트 B 세포에 의해 유도 체액 성 면역 반응의 측정에 사용할 수있는 가장 편리하고 용이하게 접근 샘플이다. 의 ASC를 포함하여 고유 한 B 세포 하위 집합은, 유동 세포 계측법으로 정렬 혈통 특정 AB-접합 마이크로 비드 또는 셀을 통해 선택을 통해 말초 혈액에서 직접 분리 할 수있다. 또한, 정제 순진한 및 메모리 B 세포 활성화와 문화의 ASC로 분화 될 수있다. 구간 분비에 기여할의 ASC의 기능적 활동을 집광 효소 분석법 인 ELISPOT에 의해 정량화 될 수있다-linked immunoabsorbance 분석 (ELISA)과 웨스턴 블로 팅 기술은 단일 세포 수준에서 개인의 ASC의 열거를 활성화합니다. 실제로, ELISPOT 분석 점점 때문에 혈액 샘플을 다수의 취급 용이성 백신의 효능을 평가하기 위해 사용되었다. 말초 혈에서 인간 B 세포를 분리하는 방법은 시험관 내에서의 ASC로 B 세포의 분화, 총 IgM-과의 IgG-의 ASC의 정량 ELISPOT 고용 여기에 설명 될 것이다.

PBMC를이 적혈구 및 부착 세포 (1.7-1.2 단계)의 고갈되었다. 세포의 분취 량 (2 × 106)의 말초 혈 (도 1)의 B 나이브 세포, 메모리 B 세포, PBS를 / PC를 모집단을 설명하기 위해 유세포 분석을 행 하였다. 이 공여자의 PBMC를, 상기 림프구의 약 10 %가 CD19 + B 세포이다. ㄴ 세포 구획에서 CD19 + CD27의 비율 - 나이브 B 세포는 약 50 %였다. 한편, ...

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The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

the-isolation-differentiation-quantification-human-antibody-secreting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.1K 조회수.  National Taiwan University. Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

비디오: The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

효소 링크된 Immunospot 분석 (ELISPOT) : 미생물 항원 반대 예뻐 - 1 세포 면역 반응의 부량

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

연구

면역학 및 감염병학

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

인간 Papillomavirus의 소설 T-세포 Epitopes를 특성화하기 위해 인터페론-γ 효소 연결된 Immunospot 분석의 이용

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, antiherpetic prophylaxis is administrated systematically to pediatric UCBT recipients to prevent complications associated with VZV infection, but there is no strong, evidence based consensus that defines its optimal duration. Because T cell mediated immunity is responsible for the control of VZV infection, assessing the reconstitution of VZV specific T cell responses following UCBT could provide indications as to whether prophylaxis should be maintained or can be discontinued. To this end, a VZV specific gamma interferon (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay was developed to characterize IFN-&#947; production by T lymphocytes in response to in vitro stimulation with irradiated live attenuated VZV vaccine. This assay provides a rapid, reproducible and sensitive measurement of VZV specific cell mediated immunity suitable for monitoring the reconstitution of VZV specific immunity in a clinical setting and assessing immune responsiveness to VZV antigens. &#160;

Novel generations of functional assays such as gamma interferon (IFN-&#947;) ELISpot, which detect cytokine production at the single cell level and provide both quantitative and qualitative characterization of T cell responses can be used to assess cell-mediated immune responses directed against varicella zoster virus (VZV).

제대혈 이식을 다음과 IFN-γ 평가하기 ELISPOT 분석을 수두 - 대상 포진 바이러스 - 특정 세포 성 면역의 개발

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational methods, such as next generation sequencing (NGS), yield enormous sets of data on the antibody repertoire at the sequence level, functional data is required to identify which sequences are relevant for a particular antigen or set of antigens. Here, we describe a method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from a human blood donor. This method utilizes an initial enrichment of mature B cells and requires a combination of phenotypic cell markers and fluorescently-labeled protein to isolate IgG memory B cells via flow cytometry. The heavy and light chain variable regions are then cloned and re-screened. Although limited to the memory B cell compartment, this method takes advantage of flow cytometry to interrogate millions of B cells and returns paired heavy and light chain sequences from a single cell in a format ready for expression and confirmation of specificity. Antibodies recovered with this method can be considered for therapeutic potential, but can also link specificity and function with bioinformatic approaches to assess the B cell repertoire within individuals.

The BSelex method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from human peripheral blood mononuclear cells combines flow cytometry with single cell PCR and cloning.

농축 된 인간 기억 B 세포 집단에서 원하는 특이성을 가진 항체의 선택 및 회복을위한 단세포 스크리닝 방법

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...

ELISPOT Assay: Detection of IFN-&#947; Secreting Splenocytes

Source: Tonya J. Webb1 
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine and the Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, Baltimore, Maryland 21201
ELISPOT is a standardized, reproducible assay used to detect cellular immune responses. The assay utilizes an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)- based method to detect single-cell immune responses which can be visualized by spots, hence the name ELISPOT. ELISPOT was first described in 1983, by Czerkinsky, as a method of enumerating the number of B cell hybridomas producing antigen-specific immunoglobulins (1). The same group further developed the assay to measure the frequency of cytokine producing T lymphocytes. Now ELISPOT has become a gold standard for measuring antigen-specific T cell immunity in clinical trials and vaccine candidates. For example, after vaccination or during an infection, plasma cells and memory B cells secrete antibodies that provide protection. Typically, these B cell responses are assessed by measuring serum titers of antigen-specific antibodies. However, this type of analysis, typically measured by ELISA, may not include memory B cells, which can be present even in the absence of detectable serum antibody levels. Furthermore, it has been well-established that circulating memory B cells are important for the rapid and protective antibody response observed following pathogen re-exposure, thus it is critical to be able to detect these cells. Therefore, to clearly assess antigen-specific memory B-cell responses, both ELISA and ELISPOT should be used (2).
ELISPOT assay uses a plate containing membrane-lined wells that are coated with antibodies in order to capture secreted proteins of interest. Then, the plate is loaded with cells and stimuli to induce protein production. The secreted proteins are captured by the antibodies coated on the surface. After appropriate incubation time, cells are removed and the secreted molecule is detected by using a biotinylated antibody that is specific for a different epitope, as compared to the capture antibody. Next, streptavidin peroxidase is added, followed by the addition of a substrate that allows the detection of the spots (Figure 1). The strength of this assay is that it allows one to quantitate the number of cells producing the protein of interest. Importantly, one can assess if there are changes in the total number of cells producing a specific protein or if individual cells within a population are producing more protein. Moreover, it can provide information regarding kinetics and can be used to assess overall immune activation (mitogen stimulation) relative to antigen-specific responses (antigen simulation). The ELISPOT assay will permit the detection one activated cell amongst 300,000 cells following mitogenic or antigen-specific activation.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10497/10497fig1.jpg" /> 
Figure 1: ELISPOT protocol overview.
The major advantages of this assay are its- a. Simplicity- the protocol is relatively simple and straightforward. It does not require technical expertise, b. Sensitivity- it permits the detection of immune cells at the single cell level and requires very few cells compared to other methods such as flow cytometry, c. Functionality- it provides quantitative data regarding immune function.
This lab exercise demonstrates the ELISPOT protocol for detection of IFN-&#947; secreting-splenocytes, but as mentioned above this assay can also be used to assess antibody secretion by B cells (3).

ELISPOT Assay: Detection of IFN-&amp;#947; Secreting Splenocytes

ELISPOT 분석: IFN-γ 분비 비장세포 검출

Source: Tonya J. Webb1
1 Department of Microbiology and Immunology, University of Maryland School of Medicine and the Marlene and Stewart Greenebaum ...

교육

JoVE Science Education

심화생물학

면역학

Flow Cytometry-Based Cell Sorting for Different Circulatory B Cell Populations

Source: Tzeng, S. J. <a href="https://app.jove.com/v/54582">The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity.</a> J. Vis. Exp. (2016).
In this video, we describe a protocol for the flow cytometry-based sorting of na&#239;ve B cell, memory B cell, and plasmablast plasma cell subpopulations from human peripheral blood B cells. The different B cell subpopulations can be distinguished based on fluorophore-based antibody binding to the CD19, CD27, and CD38 receptors expressed on the B cell surfaces, followed by cell sorting.

다양한 순환 B 세포 집단에 대한 유세포 분석 기반 세포 분류

Source: Tzeng, S. J. The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immune Systems and Components

Assays and Functional Profiling

Functional Assessment of Antibody-Secreting B Cells Using ELISpot Assay

Source: Tzeng, S. J. <a href="https://app.jove.com/v/54582">The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the use of the ELISpot assay to assess the function of antibody-secreting B cells, ASCs. The antibodies secreted by the ASCs interact with the membrane-bound polyclonal antibody fragments, which are detected by the enzyme-conjugated IgG or IgM antibodies. The colored spot produced in each well indicates the presence of the specific antibody&#39;s isotype, which correlates with the B cells&#39; secretory activity.

ELISpot Assay를 사용한 항체 분비 B 세포의 기능 평가

Isolation and Purification of B Cells from Human Peripheral Blood

Source: Tzeng, S. J. <a href="https://app.jove.com/v/54582">The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity.</a> J. Vis. Exp. (2016)
In this video, we demonstrate the isolation of B cells from human peripheral blood using biotinylated antibodies specific for non-B cells and streptavidin-conjugated magnetic microbeads.