과거에기니피그 모델에서 면역치료제의 특성화는 유머 면역을 측정하는 것으로 제한되었다. ELISpot 분석은 이러한 한계를 극복하고 연구자들이 해당 동물 모델에서 더 의미 있는 데이터를 생성하는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 세포가 말초 혈액에서 얻어진다는 것입니다.
부검이 필요하지 않습니다. 이것은 자연 감염 도중 또는 백신 식이요법을 통하여 개별 기니 피그에서 단지 크기 뿐 아니라 T 세포 반응의 운동학의 측정을 허용합니다. 절차를 시연하는 것은 홀리 푸가 될 것입니다.
그녀는 이노비오의 전임상 R 및 D 부서의 연구 동료입니다. ELISpot 분석 플레이트의 각 웰에 35%에탄올의 15 마이크로리터를 추가하기 시작합니다. 60초 후 각 웰에 150마이크로리터의 PBS를 추가합니다.
그리고 에탄올 전처리를 중지 플레이트를 반전. 오염이나 멤브레인을 손상시키지 않도록 ELISpot 분석 플레이트를 취급할 때도 세심한 주의를 기울여야 합니다. 접시를 세척하려면 각 우물에 PBS 250 마이크로 리터를 추가합니다.
세척을 두 번 더 반복한 후, 각 웰에 포획 항기니피페동 감마 항체 VE4의 100 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 적어도 12 시간 동안 접시를 배양합니다. 인큐베이션 기간 후에 는 접시를 세 번 씻습니다.
각 웰에 200 마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가합니다. 2 시간 동안 실온에서 접시를 배양. 그런 다음 접시를 세 번 더 씻으시면 됩니다.
4.5 ml의 실온 밀도 그라데이션 매체로 원식 튜브를 준비합니다. 그런 다음 행크스균형 소금 용액의 동일한 양을 혈액과 혼합합니다. 희석된 혈액을 밀도 그라데이션 배지 위에 서서히 겹쳐서 인터페이스를 방해하지 않도록 주의하십시오.
그 후, 실온에서 브레이크없이 30 분 동안 800 x g의 튜브원심분리하십시오. 원심분리기에서 튜브를 제거하여 층을 방해하지 않도록 주의하십시오. 레이어를 올바르게 식별한 후 완전한 버피 코트 레이어를 흡인하여 PBMC를 수확합니다.
HBSS희석혈액을 밀도 그라데이션 배지에 천천히 층으로 내세이시다. 튜브의 교란을 피하고 원심 분리제 브레이크를 끕니다. 세포를 새로운 15ml 튜브로 옮기십시오.
그런 다음 R10 배지의 세포를 총 부피 15 ml로 희석시 희석시다. 세포를 펠릿한 후, 상체를 버리고 R10 배지의 15 ml에서 세포를 다시 중단한다. 70 마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 새로운 튜브로 전달합니다.
세포를 계산하고 Trypan 블루 제외 테스트로 살아있는 세포의 수를 결정합니다. 그런 다음 R10 배지로 세포를 희석시. 먼저 차단 버퍼를 제거하고 판을 씻으라.
각 PBMC 샘플에 대해 양극, 음수 제어 및 각 실험 별 자극제의 세쌍둥이를 나타낸다. R10 배지에서 단백질 펩타이드 풀을 원하는 최종 농도의 3배까지 희석시. 이 후 펩티드 R10 배지 혼합물의 50 마이크로리터를 플레이트의 각성제 테스트 웰에 첨가하였다.
그런 다음 플레이트의 음의 제어 우물에 R10 배지에 MT 펩티드 제형 50 마이크로리터를 첨가한다. R10 배지에 ConA를 플레이트의 양수 제어 웰에 추가한 다음 모든 웰에 PBMC 서스펜션의 100 마이크로리터를 추가합니다. ELISpot 플레이트를 인큐베이터의 균일한 표면에 놓고 인큐베이션 기간 동안 플레이트를 방해하지 마십시오.
인큐베이터에서 플레이트를 조심스럽게 제거한 후 플레이트를 뒤집어 서퍼나탄을 제거합니다. 그런 다음 접시를 세 번 씻으시면 됩니다. 희석된 바이오티니화 검출 100마이크로리터를 첨가하여 각 웰에 항기니피인터페론 감마 항체 N-G3를 포획한다.
그런 다음 2 시간 동안 실온에서 접시를 배양합니다. 플레이트를 반전하여 항체 용액을 제거하고 세 번 세척을 반복합니다. 플레이트에서 PBS를 제거한 후, 각 우물에 버퍼를 차단하는 데 희석된 ALP 스렙타비딘의 100마이크로리터를 추가한다.
그런 다음 1 시간 동안 실온에서 접시를 배양합니다. 플레이트를 뒤집어 ALP 스트렙타비딘 용액을 버리고 접시를 두 번 세척하십시오. 접시를 반전하고 여분의 PBS를 제거하기 위해 깨끗한 종이 타월에 얼룩.
이 후 잘 당 울트라 퓨어 디 워터의 250 마이크로 리터로 접시를 세척합니다. 접시를 반전하고 깨끗한 종이 타월로 여분의 물을 제거합니다. 다음으로 각 웰에 BCIP/NBT 기판 용액 100마이크로리터를 추가합니다.
실내 온도에서 20분 동안 플레이트를 배양하여 빛으로부터 보호합니다. DI 물로 접시를 네 번 헹구습니다. 그런 다음 반전하고 여분의 물을 제거하기 위해 접시를 누릅니다.
마지막으로, 플레이트 의 바닥에서 플라스틱 배수를 제거하고 멤브레인이 완전히 건조 할 수 있습니다. 이전에 입증된 바와 같이 성공적인 밀도 그라데이션 원심분리 후, 튜브 의 바닥에 있는 적점성 액체는 대부분의 적혈구를 포함해야 한다. 버피 코트 층은 플라즈마 층과 밀도 그라데이션 매체 사이에 있습니다.
포획 항체를 첨가하기 전에 우물을 전처리하여, 분석은 음의 대조군 우물에서 특이하지 않은 반점의 수의 감소와 함께 향상된 정의를 표시했다. 반점은 PBMC 인구 내에서 T 세포를 생산하는 인터페론 감마를 나타냅니다. 이 기술을 시도 할 때, 신중하지만 신속하게 혈액을 처리하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이것은 세포 생존력을 향상시키고, 반점 형성을 향상시키고, 비특이적 반점의 형성을 감소시킵니다. 혈액 및 BCIP/NBT 기판으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 적절한 PPE 착용과 같은 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 합니다. 나는 이 프로토콜이 연구원이 결핵, 에볼라 및 HSV와 같은 중요한 T 세포 분대를 가진 질병을 공부할 수 있다는 것을 믿습니다.
중요한 것은, 기니피그 모델에서 백신 프로토콜의 개발을 구체화하고 덜 관련성이 있는 동물 모델의 사용을 감소시킬 것이다.
