우리는 시설과 이온 채널의 연구에 대한 훌륭한 환경으로 우리를 제공 생리학 및 분리막 생물, 캘리포니아 데이비스 대학의학과에 감사하고 있습니다.

1. 휴식 인간의 T Lymphocytes의 준비 <ol><li> RosetteSep 인간 T 세포 농축 칵테일과 RosetteSep 밀도 매체를 사용하여, 제조 업체의 지시에 따라 인간의 혈액 샘플에서 T 세포를 정화. 그 결과 세포 인구는 95 % 인 경우에는 3 번 CD + 쉬고있는 T 세포를 포함해야합니다. 우리는 UC 데이비스 내부 검토위원회의 승인을 프로토콜에 따라 건강한 지원자에서 수집한 말초 혈액 샘플에서 인간의 T lymphocytes 정화. </li><li> 분리 후 10 % 태아 송아지 혈청, 2퍼센트 GlutaMAX - I, 1 % RPMI 1640과 보충, 글루타민과 HEPES와 RPMI - 1640 매체를 포함하는 세포 배양 매체에서 0.5 X 10 6 세포 / ML의 밀도에 쉬고 T 세포를 resuspend 비타민 용액, 1 % RPMI 1640 아미노산 용액, 1 %의 나트륨 pyruvate, 그리고 0.03 % β - 메르 캅 토 에탄올. </li><li> 플레이스 세포 세포 배양 flasks에 서스펜션과 ° humidified 인큐베이터에서 C 5 % CO 2와 함께 최대 24 H하기 전에 실험을 위해 37 유지합니다. </li></ol> 2. 기록 회의소의 준비 <ol><li> 다음은 녹화 회의소를 준비하는 데 필요한 :) B, A) 실리콘 O - 링을 회전, 70 % 에탄올과 증류수 H 2 O, C와 함께 청소를 25 mm coverslips)는 Sylgard184를 혼합 제조 업체의 지시에 따라 준비하고, D) 이 60 X 15mm 페트리 요리. </li><li> 플레이스 ~ 60x15 - mm 배양 접시에 혼합 Sylgard184 0.5 ML. </li><li> Sylgard184 사용 포셉에 O - 링의 하단 부분을 찍어. </li><li> 같은 다른 배양 접시로 깨끗한 표면에 O - 링을 배치하여 O - 링의 가장자리에서 초과 Sylgard184를 제거합니다. </li><li> coverslip에 반지를 놓고 그것을 아래로 누르십시오. </li><li> 85 ° 40-60 분 또는 Sylgard184까지 C가 polymerized입니다에서 실 가열하여 Sylgard184 치료. </li><li> 먼지없는 용기에 녹화 실에 보관하십시오. </li></ol> 3. 패치 Pipettes의 준비 <ol><li> 실험 당일, 유리 모세관 및 피펫 풀러를 사용하여 ~ 2 μm의 팁 직경 pipettes를 가져옵니다. 우리는 필라멘트 (1.5 mm 및 ID : 1.10 mm OD)와 borosilicate 튜빙을 사용합니다. 먼지없는 위치에 저장 pipettes. </li><li> 표준 절차에 따라 9 Sylgard184 또는 HIPEC R6101 반도체 보호용 코팅 코트 피펫은 팁. </li><li> 부드럽게 실험 전에 pipettes를 해고 - 폴란드어. </li></ol> 4. 패치 클램프 설치 준비 <ol><li> 여러분의 패치 - 클램프 앰프를 제어 소프트웨어의 gigaseal 형성에 대한 매크로를 구성하고 저장합니다. 우리는 Windows XP 및 데이터 수집을위한 펄스 소프트웨어에 의해 지원되는 EPC - 10 앰프를 사용합니다. 우리는 EPC - 10 사용 설명서에 따르면, &quot;에 셀 &#39;및&#39;전체 셀&quot;매크로 &quot;설정&quot;을 설정하고 모든 실험에 사용합니다. </li><li> 이전 실험 목욕 솔루션 및 표 1에 나와있는 피펫 솔루션을 준비하고 최대 일주 4 ° C에 그들을 저장할 수 있습니다. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 화학 제품 </td><td colspan="3"> 바스 솔루션 (㎜) </td><td> 피펫 솔루션 (㎜) </td></tr><tr><td></td><td> # 1 </td><td> # 2 </td><td> # 3 </td><td></td></tr></tbody><tbody><tr><td> CH 3 SO 3 나 </td><td> 130 </td><td> 110 </td><td> 125 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> - </td></tr><tr><td> CA (OH) 2 </td><td> - </td><td> 20 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> HEDTA </td><td> - </td><td></td><td> 10 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> CS -spartate </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 125 </td></tr><tr><td> BAPTA </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> - </td></tr></tbody></table> 표 1. 전체 셀 CARC 현재 레코딩을위한 솔루션을 제공합니다. 모든 화학 물질은 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO에서 구입한했다. <ol start="3"><li> 패치 피펫 솔루션과 각 목욕 솔루션 10 ~ 액상 접합 잠재력 (LJ)를 결정합니다. 당신의 수집 소프트웨어를 사용하여 적절한 장소에 LJ 값을 저장합니다. 예를 들어, 펄스 프로그램의 &quot;앰프&quot;창에서 &quot;LJ&quot;컨트롤에 LJ 값을 삽입합니다. </li><li> 실험 전에 수집 소프트웨어의 적절한 장소에서 그림 1에 표시된 자극 프로토콜, 구성 및 저장합니다. 펄스 프로그램에서 우리는 &quot;펄스 생성&quot;창에서 수집 프로토콜을 설정합니다. <img src="/files/ftp_upload/2346/2364fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. . 자극 프로토콜 -120에서 기간 50 MS의 백 뮤직 비디오에 전압 램프마다 0.2를 적용 - 2 s을 (5-0.5 Hz에서). 구불 구 사이의 개최 가능성 (V H)는 30 MV에서 관리하고 있습니다. </li></ol> 5. 현미경 스테이지에 장착 셀 <ol><li> 세포를 도금하기 전에 다음 ~ 20 분 및 세척 H 2 O와 행크의 균형 소금 용액 (HBSS)에 대한 폴리 - L - 라이신과 코트 녹화 실 있습니다. </li><li> 37 20 분 챔버 및 부화에 0.2-0.5 X10 6 셀을 포함하는 세포 현탁액의 플레이트 500 μL ° C. </li><li> 챔버 홀더에 부착된 세포로 녹음 챔버를 고정합니다. 우리는 맞춤 제작 챔버베이스 coverslip의 바닥을 지원 홀더, coverslip의 상단으로부터 상단 부분은 부드럽게 프레스 동안.를 사용하여 </li><li> 거꾸로 현미경의 무대에 챔버 홀더를 놓습니다. </li><li> 전송 빛의 세포에 초점. 우리는 40X 기름 침지 목표를 사용합니다. </li><li> 욕조에 자세 / AgCl 기준 전극을 삽입합니다. </li><li> multibarrel 중력 기반의 재관류 시스템을 맞춥니다. 유입 튜브의 끝은보기의 필드에 coverslip 가까이에 45 ° 각도로 배치해야합니다. </li><li> 유입 튜브 끝에 반대 흡입 튜브를 놓습니다. </li><li> 와 챔버 Perfuse 인산염 버퍼 호수 (PBS) 또는 HBSS은 세포 배양 매체와 느슨하게 연결된 세포를 멀리 세척하십시오. </li></ol> 6. CRAC 채널 해류 녹음 <ol><li> 단단히 coverslip에 연결된 세포를 찾아보십시오. 우리는 일반적으로 부드러운 외부 표면과 평균 크기, 원형 셀을 선택합니다. </li><li> + - 무료, 3 MM MG 2 + 함유 목욕 솔루션 SERCA 펌프를 차단하기 위해 80-10 분 0.5-1 μm의의 thapsigargin를 포함하는 # 1 (표 1) 칼슘 2 녹음 챔버를 Perfuse. 우리는 이전 gigaseal 형성하기 위해 저장소를 고갈이 단계를 수행합니다. </li><li> Eppendorf microloader와 P - 20 변위 피펫을 사용하여, 피펫 솔루션 (표 1)과 함께이 패치 피펫을 기입하여 증폭기 headstage에 피펫 홀더에 패치 피펫를 삽입합니다. 칼슘 2 + chelator BAPTA는 수동적으로 저장을 고갈하고 + 종속 CRAC 채널 불활 성화 칼슘 2 줄이기 위해 피펫 솔루션에 포함되어 있습니다. </li><li> 패치 피펫 내부 욕조에 들어가기 전에 긍정적인 압력 (H 2 O 중 ~ 3 인치)의 작은 금액을 적용합니다. 우리는 가압 공기와 패치 피펫 내부 긍정적이거나 부정적인 압력을 만들 진공 라인에 연결된 사용자 정의 - 만든 압력 흡입 장치를 사용합니다. </li><li> 현미경을 통해 시각적인 통제 욕조에 패치 피펫을 낮추십시오. &quot;오실로 스코프&quot;창에서, 당신은 피펫을 통해 흐르는 전류를 볼 수 있습니다. 현재 진폭의 단계와 같은 변경 사항이 미리 매크로에 의해 적용되는 작은 진폭 전압 펄스 (시험 펄스)에 의해 유도해야합니다. 이 시점에서, 당신은 피펫 저항의 가치를 확인할 수 있어야합니다. 우리 pipettes의 저항은 일반적으로 5-6 MΩ입니다. </li><li> 피펫 및 참조 전극 사이에 생성된 &quot;오프셋&quot;잠재력을 수정합니다. </li><li> 그것은 세포막을 만지는 때까지 현미경을 통해 시각적인 통제, 가까이 세포에 피펫 팁을 가지고. </li><li> 패치 피펫 내부 부정적인 압력 (H 2 O의 20~40인치)을 적용합니다. </li><li> &quot;오실로 스코프&quot;창에서 gigaseal 형성을 모니터링합니다. 당신은 시험 펄스, 감소 및&gt; 5 GΩ에 피펫 저항 증가의 가치에 의해 유도 전류의 진폭을 볼 수 있습니다. 철 이내 gigaseal 형태w 초,하지만 그것은 안정 gigaseal을 달성하기 1-2 분 정도 걸릴 수 있습니다. </li><li> 피펫 커패시턴스 ( &quot;C - 빠른&quot;)에 대한 보상. </li><li> 20 CC 주사기를 사용하여 추가 부정적인 압력을 적용하여 패치 막 브레이크. </li><li> 30 MV에 보관 잠재력을 설정합니다. 긍정적인 지주 잠재 칼슘 의존 CRAC 채널 불활 성화를 방지하는 데 도움이됩니다. </li><li> 세포의 막 커패시턴스 ( &quot;C - 느린&quot;)에 대한 보상, C - 느린의 가치를 저장하거나 기록합니다. </li><li> 액세스 저항 &quot;R S&quot;의 가치를 확인합니다. 우리의 실험에서는 R S는 일반적으로 MΩ 70-20 있습니다. </li><li> + 무료 3 MM MG 2 + 함유 목욕 솔루션 # 1 칼슘 2 0.5 Hz의 주파수 (그림 1)과 전압 구불 구 일련의 사항을 적용하려면 시작합니다. MG 2 +에 대한 CRAC 채널의 가난한 투자율에 의한 &quot;누설&quot;현재와 비교하여 본 솔루션에서는 CRAC의 전류 negligibly 작습니다. 저장하고 &quot;누출&quot;조류로서 향후 분석에서 목욕 솔루션 # 1에 기록된 현재 추적을 사용합니다. -100 MV에있는 &quot;누설&quot;현재의 절대 진폭 미만 또는 5 PA 동일해야합니다. 세포는 &quot;새는&quot;있다면, 새로운 패치 피펫하고 새로운 세포를 사용을 통해 실험 시작을 중지합니다. </li><li> CRAC 채널 (I CA - CRAC)를 통해 칼슘 2 + 전류를 기록하려면 재관류 밸브 전환 20 MM 칼슘 2 + 함유 목욕 솔루션 # 2 (표 1)과 칼슘 2 + 무료 3 MM MG 2 + 함유 목욕 솔루션 # 1을 대체합니다. 이것은 칼슘 2 + CRAC 채널을 통해 흐름에 가능하며 내향 전류를 생산하고 있습니다. &quot;오실로 스코프&quot;창에서, 당신은 내심 I CA - CRAC (그림 2) 정류의 개발을 볼 수 있습니다. 부정적인 전압에서 전류 진폭은 칼슘 2 CRAC 전류의 + 종속 potentiation로 인해 약 1 분 계속 증가할 것입니다. </li><li> CRAC 채널을 통해 과도 나 + 전류를 기록하는 데 필요한 5 Hz에서, 전압 경사로와 함께 자극의 빈도를 늘리십시오. </li><li> 20 MM를 교체 칼슘 2 + 함유 재관류 밸브를 전환하여 나 + 함유 이가의 양이온 무료 솔루션 # 3 (표 1) 욕조 솔루션 # 2. &quot;오실로 스코프&quot;창에서, 당신은 안쪽으로 나를 정류 큰 진폭의 과도 발전을 볼 수 + ​​현재 CRAC 채널 (I 나 - CRAC, 그림 2)를 통해. </li><li> 하나는 20 MM 칼슘 2 &quot;누설&quot;현재를 기록하는 실험의 끝에 1-5 μm의 라 3 +를 포함하는 + 함유 목욕 솔루션 # 2를 적용할 수 있습니다. 그러나, 우리는 시간이 지남에 &quot;누출&quot;현재 변경하기 때문에이 방법은 유용하지 않았고 그것은 실험의 끝에 크거나 작게 될 수 있습니다. 우리는 칼슘이에 기록된 현재 + 무료 3 MM MG 2 &quot;누설&quot;현재와 같은 실험의 시작 부분에 + 함유 목욕 솔루션 # 1.을하는 것을 선호 </li><li> 자세한 분석을 위해 기록된 현재의 흔적을 저장합니다. </li></ol> 7. 데이터 분석 <ol><li> 분석 소프트웨어에 저장된 현재 레코드를 검색할 수 있습니다. 우리는 분석을위한 펄스 프로그램을 사용합니다. </li><li> 처음에과 전압 경사로의 끝부분에 현재 amplitudes를 측정. 우리는 일반적으로 -100 뮤직 비디오에서와 펄스 프로그램의 &quot;오실로 스코프&quot;창에서 커서의 쌍을 사용하여 100 뮤직 비디오에서 현재 amplitudes를 측정합니다. </li><li> 자세한 분석 및 그래픽 프레 젠 테이션 그래픽 프로그램으로 현재 amplitudes의 가치를 내보냅니다. 우리는 기원 과학 그래프 및 분석 소프트웨어, 버전 7을 사용합니다. </li></ol> 8. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2346/2346fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 쉬고 인간 T 세포의 CRAC 전류. (A), -100 MV (채워진 원)과 100 MV (오픈 원)에서 전체 셀 전압 클램프 구성에 기록된 CRAC 전류의 시간 코스. gigaseal 형성하기 전에, 세포는 칼슘 2 ~ 10 분 preincubated했습니다 + 무료 3 MM MG 2 + 함유 목욕 솔루션 0.5 μm의의 thapsigargin을 포함하는 # 1. 침입 후, 목욕 솔루션은 순차적으로 다음과 같이 적용되었습니다 칼슘 2 + 무료 3 MM MG 2 칼슘 2 + 함유 목욕 솔루션 # 2 20 MM 다음 + 함유 목욕 솔루션 # 1 (0 칼슘 + 3 MG) (20 CA), 목욕 솔루션 # 2 (20 CA) 뒤에 이가의 양이온 무료 목욕 솔루션 # 3 (DVF)로 따라갔다. 전지는 그림 1에 표시된 전압 구불 구 일련의 자극했다. 구불 구의 빈도는 목욕 솔루션 # 3 (DVF)와 다른 모든 솔루션에 0.5 Hz에서 5 Hz에서했습니다. 20 MM 칼슘 2 + 함유 목욕 솔루션 # 2 및 DVF 목욕 솔루션 # 3 I 나 - CRAC의 빠른 과도 개발 신청 후 CA - CRAC의 느린 개발을합니다. (B), 대표 현재 흔적이 + 무료 3 MM MG 2 + 함유 목욕 솔루션 # 1 (CA 2 전압 경사로 동안 기록&quot;누설&quot;), 20 MM 칼슘 2 + 함유 목욕 솔루션 # 2 (20 CA), 그리고 목욕 솔루션 # 3 (DVF)을. (C, D), I CA - CRAC (C)와 나 - CRAC (D)의 전류 - 전압 관계 20 MM의 전압 - 경사로 중에 칼슘 2 + 함유 목욕을 기록 전류에서 &quot;누출&quot;현재를 빼서 얻은 솔루션 # 2 (20 CA), 그리고 목욕 솔루션 패널에 표시된 # 3 (DVF) (B).

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	<li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-operated+CRAC+channels:+function+in+health+and+disease.">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li><li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRAC+channelopathies.">CRAC channelopathies.</a> Pflugers Arch. , (2010).</li><li>Lewis, R. S., Cahalan, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2++and+transmembrane+Ca2++current+in+human+leukemic+T+cells.">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li><li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current+(ICRAC)+due+to+local+calcium+feedback.">Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback.</a> J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).</li><li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+calcium-dependent+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current.+Store-dependent+and+-independent+mechanisms.">Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms.</a> J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).</li><li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+potentiation+of+store-operated+calcium+channels+in+T+lymphocytes.">Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).</li><li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+characterization+of+currents+through+store-operated+CRAC+channels+and+Mg2+-inhibited+cation+(MIC)+channels.">Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels.</a> J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).</li><li>Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+channel+properties+and+regulated+expression+of+Ca(2+)+release-activated+Ca(2+)+(CRAC)+channels+in+human+T+cells.">Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells.</a> J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , (1995).</li><li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments.">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이러한 세포의 내생 CRAC 현재 진폭이 작은 셀 크기 (쉬고 인간 T 세포의 직경은 5-8 μm의 범위에있는)에 의한 소형이기 때문에 인간의 T 세포를 휴식에 CRAC 전류 electrophysiological 조사 어려운 작업입니다. 여기에서 우리는 확실하게 주변 혈액 mononuclear 세포로부터 격리 쉬고있는 인간의 T lymphocytes에 CRAC 전류를 기록하기위한 단계별 절차를 제시한다. 이 기술은 우리가 더 나은 정상 및 병적인 면역 세?...

<table><tbody><tr><td>RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep Density Medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15705</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100X solution)</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 vitamin solution (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7256</td><td></td></tr><tr><td>1640 amino acids solution (50X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapt&amp;#8211;thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Inositol trisphosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19766</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Lanthanum Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>262072</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td>63-540</td><td></td></tr><tr><td>EPC 10 patch clamp amplifier with headstage</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator </td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective</td><td>Olympus Corporation</td><td>1X71</td><td></td></tr><tr><td>Windows Computer</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pulse software</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin Scientific Graphing and Analysis Software</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patch pipette puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Narashige&amp;rsquo;s Microforge</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Silicon O-rings </td><td>McMaster-Carr</td><td>111 S70</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 25 mm </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 mm 25CIR.-1</td><td></td></tr></tbody></table>

whole-cell recording of calcium release-activated calcium (crac) currents in human t lymphocytes

T lymphocytes 년, CA 2 고갈 + 세포내 칼슘 2 + 저장소, plasmalemmal 칼슘 2 활성화에 + 채널을 리드 칼슘 출시가 활성화된 칼슘 (CRAC) 채널을했다. CRAC 채널은 T 세포 증식 및 유전자 발현의 조절에 중요​​한 역할을한다. T 세포의 비정상적인 CRAC 채널 기능이 심한 결합 면역 결핍과 면역 질환 1, 2에 연결되어 있습니다. 인간 T 세포의 CRAC 채널 기능을 공부하는 것은 정상적인 면역 반응을 조절 새로운 분자 메커니즘을 발견하고 관련 인간 질병의 원인을 풀다 수 있습니다. 멤브레인 전류의 Electrophysiological 녹음 기능 채널 특성과 규제의 가장 정확한 평가를 제공합니다. Jurkat T 세포, 인간의 백혈병 T 세포 라인에 CRAC 채널 전류의 Electrophysiological 평가는 처음 3 전 20 년 이상 수행했다, 그러나 정상적인 인간의 T 세포에 CRAC 전류 측정이 어려운 과제 남아있다. 정상적인 T 세포의 CRAC 채널 전류를 기록의 어려움은 혈액 파생 T의 lymphocytes가 Jurkat T 세포보다 크기가 훨씬 작고, 따라서 내생 전체 세포 CRAC 전류가 진폭 매우 낮게있다는 사실에 의해 혼합 수 있습니다. 여기, 우리가 정기적으로 칼슘 2를 기록하는 데 사용하는 + 나 + 나 건강한 자원 봉사자의 말초 혈액에서 분리된 인간의 T 세포를 휴식에 CRAC 채널을 통해 전류. 단계별 절차를 제공 방법은 여기에 설명된 Jurkat T 세포에서 CRAC 전류를 기록하고 인간의 T 세포 4-8을 활성화에 사용되는 절차에서 채택되었습니다.

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Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium CRAC Currents in Human T Lymphocytes

우리는 칼슘 출시가 활성화된 칼슘의 전체 세포 패치 클램프 녹음 (CRAC) 말초 혈액 mononuclear 세포 - 파생 인간 T의 lymphocytes의 전류에 대한 단계별 절차를 제공합니다.

인간의 T Lymphocytes에서 칼슘 출시가 활성화된 칼슘의 전체 세포 기록 (CRAC) 해류

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated ...

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Biology

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

16.0K 조회수.  University of California, Davis. 우리는 칼슘 출시가 활성화된 칼슘의 전체 세포 패치 클램프 녹음 (CRAC) 말초 혈액 mononuclear 세포 - 파생 인간 T의 lymphocytes의 전류에 대한 단계별 절차를 제공합니다.

비디오: Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium CRAC Currents in Human T Lymphocytes

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

연구

신경과학

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리<sup&gt; 2 +</sup&gt; 과도하고 막 전류

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

생물학

Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to assess calcium signaling by band-pass flow cytometry. This protocol is designed to measure calcium responses in primary murine T-cells using full spectrum flow cytometry. Total splenocytes are labeled with the ratiometric calcium indicator dye Indo-1, along with a panel of fluorochrome-conjugated antibodies to cell surface molecules. Leveraging the capabilities of full spectrum flow cytometry provides a platform for utilizing a wide array of cell surface stains in combination with Indo-1. Cells are then analyzed in real-time at 37 &#176;C before and after the addition of an anti-CD3 antibody to stimulate the T-cell receptor. After unmixing the spectral signals, the ratio of calcium-bound to calcium-free Indo-1 is calculated and can be visualized over time for each gated population of splenocytes. This technique can allow for the simultaneous analysis of calcium responses in multiple cell populations.

Calcium influx, a measure of T-cell signaling, is an effective way to analyze responses to T-cell receptor stimulation. This protocol for multiplexing Indo-1 with panels of antibodies directed at cell surface molecules takes advantage of the highly flexible capabilities of full spectrum flow cytometry.

Full Spectrum Flow Cytometry에 의한 Primary Murine T-cell의 T 세포 수용체 유도 칼슘 유입 분석

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

면역학 및 감염병학

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

<meta charset="utf8"></head><body>T 세포에서 Ca2+ 마이크로도메인을 검출하기 위한 고분해능 이미징 기법

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Unraveling the Initial Activation of the Adaptive Immune Response for Therapeutic Intervention

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

일차 T 세포에서 초기 Ca2+ 마이크로도메인 이미징

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia susceptibility, core myopathies and centronuclear myopathy. Because of the diverse phenotypes linked to RYR1 mutations it is fundamental to characterize their functional effects to classify variants carried by patients for future therapeutic interventions and identify non-pathogenic variants. Many laboratories have been interested in developing methods to functionally characterize RYR1 mutations expressed in patients&#39; cells. This approach has numerous advantages, including: mutations are endogenously expressed, RyR1 is not over-expressed, use of heterologous RyR1 expressing cells is avoided. However, since patients may present mutations in different genes aside RYR1, it is important to compare results from biological material from individuals harboring the same mutation, with different genetic backgrounds. The present manuscript describes methods developed to study the functional effects of endogenously expressed RYR1 variants in: (a) Epstein Barr virus immortalized human B-lymphocytes and (b) satellite cells derived from muscle biopsies and differentiated into myotubes. Changes in the intracellular calcium concentration triggered by the addition of a pharmacological RyR1 activators are then monitored. The selected cell type is loaded with a ratiometric fluorescent calcium indicator and intracellular [Ca2+] changes are monitored either at the single cell level by fluorescence microscopy or in cell populations using a spectrofluorometer. The resting [Ca2+], agonist dose response curves are then compared between cells from healthy controls and patients harboring RYR1 variants leading to insight into the functional effect of a given variant.

Here methods used to study the functional effect of RYR1 mutations endogenously expressed in Epstein Barr Virus immortalized human B-lymphocytes and muscle biopsy derived satellite cells differentiated into myotubes are described.

내인성 표현 인간의 RYR1 변종의 기능적 특성화

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia ...

의학

Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety assessment models is a critical step during drug development. Currently, cardiac safety assessment is still highly dependent on animal studies. However, animal models are plagued by poor translational specificity to humans due to species-specific differences, particularly in terms of cardiac electrophysiological characteristics. Thus, there is an urgent need to develop a reliable, efficient, and human-based model for preclinical cardiac safety assessment. Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have emerged as an invaluable in vitro model for drug-induced cardiotoxicity screening and disease modeling. hiPSC-CMs can be obtained from individuals with diverse genetic backgrounds and various diseased conditions, making them an ideal surrogate to assess drug-induced cardiotoxicity individually. Therefore, methodologies to comprehensively investigate the functional characteristics of hiPSC-CMs need to be established. In this protocol, we detail various functional assays that can be assessed on hiPSC-CMs, including the measurement of contractility, field potential, action potential, and calcium handling. Overall, the incorporation of hiPSC-CMs into preclinical cardiac safety assessment has the potential to revolutionize drug development.

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have emerged as a promising in vitro model for drug-induced cardiotoxicity screening and disease modeling. Here, we detail a protocol for measuring the contractility and electrophysiology of hiPSC-CMs.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에 대한 미세 전극 어레이 및 패치 클램프 기록의 기술적 응용

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...

<meta charset="utf8"></head><body>채널 활성화 연구를 위한 단세포 칼슘 이미징

Single-Cell Calcium Imaging for Studying the Activation of Calcium Ion Channels

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and chemicals et al. It primarily relies on microscopy imaging technology and the related Ca2+ indicator Fura-2/AM (AM is the abbreviation for Acetoxymethyl ester). Inside the cells, Fura-2/AM is hydrolyzed by esterases into Fura-2, which can reversibly bind with free cytoplasmic Ca2+. The maximum excitation wavelength shifts from 380nm to 340nm (when saturated with Ca2+) upon binding. The emitted fluorescence intensity is quantitatively related to the concentration of bound Ca2+. By measuring the 340/380 ratio, the Ca2+ concentration in the cytoplasm can be determined, eliminating errors caused by variations in the loading efficiency of the fluorescent probe among different samples. This technology allows for real-time, quantitative, and simultaneous monitoring of Ca2+ changes in multiple cells. The results are stored in &#8220;.XLSX&#8221; format for subsequent analysis, which is fast and generates intuitive change curves, greatly improving the detection efficiency. From different experimental perspectives, this article lists the use of this technology to detect Ca2+ signals in cells with endogenous or overexpressed channel proteins. Meantime, different methods for activating cells were also showed and compared. The aim is to provide readers with a clearer understanding of the usage and applications of single cell Ca2+ imaging.

<meta charset="utf8"></head><body>칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging

This article presents a method for real-time, quantitative monitoring of calcium ion (Ca2+) concentrations in cells using single-cell Ca2+ imaging with the Fura-2/AM dye. This technique enables efficient dye loading and accurate calculation of Ca2+ levels through fluorescence intensity ratios, making it a simple and rapid approach for research applications.

칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging

Single cell Ca2+ imaging is essential for the study of Ca2+ channels activated by various stimulations like temperature, voltage, native compound and ...

인간의 T Lymphocytes에서 칼슘 출시가 활성화된 칼슘의 전체 세포 기록 (CRAC) 해류

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Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리

Full Spectrum Flow Cytometry에 의한 Primary Murine T-cell의 T 세포 수용체 유도 칼슘 유입 분석

이미징 로컬 CA

일차 T 세포에서 초기 Ca²⁺ 마이크로도메인 이미징

일차 T 세포에서 초기 Ca²⁺ 마이크로도메인 이미징

일차 T 세포에서 초기 Ca²⁺ 마이크로도메인 이미징

내인성 표현 인간의 RYR1 변종의 기능적 특성화

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에 대한 미세 전극 어레이 및 패치 클램프 기록의 기술적 응용

칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging