Name: imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells
Uploaded: 2015-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells at JoVE.com

This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.

우리는 인간의 신경 아세포종 SH-SY5Y 세포에서 지방 칼슘 이벤트를 이미징에 대한 자세한 절차를 제시한다. 이러한 절차는 많은 세포 유형에서 8-10 화상 내 Ca 2 + 신호들에 적용될 수있다. 세포의 1. 준비 <ol><li> 문화 세포들은 공급 업체의 웹 사이트에 나와있는 지침에 따라 이미지를 만들 수 있습니다. </li><li> 촬상 전에 며칠 수확 한 세포는 ㎖의 0.25 % 트립신 / EDTA (2-3 분)를 이용하여 조직 배양 플라스크에서 성장. 박리 후, 트립신을 불 활성화 배양액의 동일 부피를 추가한다. </li><li> 접시 당 3-7 X 104 세포의 밀도로 유리 바닥 촬상 요리에 시드 및 혈구 세포를 이용하여 세포 수를 수행. 이미징 실험 셀을 선택 그들은 60 %의 합류 (2-3 일)에 도달하면. </li></ol> 솔루션 및 시약 2. 준비 <ol><li> 버퍼링 칼슘 함유 HEPES 준비(MM)로 이루어지는 염 용액 (칼슘 -HBSS) : 135의 NaCl, CaCl2를, 하나의 MgCl 2, 10 HEPES, 10 글루코스 5.4의 KCl, 2; pH가 7.4 NaOH로 실온 (RT)에서. 4 ° C에서 포도당과 상점의 추가없이 칼슘 -HBSS를 준비; 사용하기 직전에이 용액에 포도당을 추가합니다. </li><li> 형광 칼슘 지표 칼-520 (1 ㎜)의 막 투과 형태의 가용화, CI-IP (3) (200 μM) 및 EGTA 20 % 플루로 닉 F-127을 함유하는 디메틸 술폭 시드 (100 mM)을 (DMSO). -20 ℃에서, 수분 및 차광 에펜 도르프 튜브 및 저장소로 나누어지는 이러한 시약. </li></ol> 3.로드 세포 막 - 투과, 칼-520 CI-IP 3 EGTA <ol><li> 칼슘 -HBSS에서 각각 5 μM 및 1 μM의 최종 농도로 투과 막 (520) 및 캘-CI-IP (3)의 원액을 희석함으로써 &quot;로딩 완충액&quot;을 준비한다. </li><li> 기음 CUlture 매체와는 칼슘 -HBSS 3 회 미디어를 대체하여 세포를 씻어. </li><li> 칼슘을 제거 -HBSS과 어둠 속에서 실온에서 60 분 동안 로딩 버퍼에 세포를 배양한다. </li><li> 로딩 버퍼를 제거하고 칼슘 -HBSS 3 회 미디어를 대체하여 세포를 씻어. <ol><li> 원하는 경우,이 단계에서, 다음로드 칼슘 -HBSS 5 μM의 최종 농도 원액을 희석함으로써 EGTA / AM과 함께 세포 어두울 RT에서 30-60 분 동안 세포를 배양한다. 이 배양 한 다음, 3.5 단계로 진행하기 전에 세포에게 칼슘 -HBSS로 3 회 씻어. </li></ol></li><li> 로드 시약의 탈 에스테르 화를 허용하는 30 분 동안 칼슘 -HBSS 세포를 부화. </li><li> 촬영 직전, 최종 배양 중에 화장실에 유출했을 수있는 염료를 제거하기 위해 &quot;신선한&quot;칼슘 -HBSS와 칼슘 -HBSS를 교체합니다. </li></ol> 4. 칼슘 </sup&gt; 이미지 획득 <ol><li> 100X APO TIRF의 목적 상 침수 오일의 작은 방울 (NA 1.49)를 놓습니다. </li><li> 거꾸로 현미경의 무대에 영상 접시를 탑재하고 투과광을 사용하여 초점 세포를 가지고. 이것은 촬영 중에 이동을 막도록 접시 촬상을 확보하는 것이 중요하다. </li><li> 고속 EMCCD 카메라를 사용하여 형광 방출 (λ&gt; 내지 510nm)을 캘-520를 자극하고 수집하기 위하여 488 nm의 레이저로 세포를 밝히는. 주 : 현미경을 운영 소프트웨어 패키지는 사용자가 레이저 빔이 어느 ( &quot;WF&quot;음원 정보)보다 중앙 또는 (TIRF 여기 용) 대물 위로 개구의 극단 에지에 도입 될 수 있도록 집속 렌즈를 번역 할 수있다. </li><li> EMCCD 소프트웨어를 사용하여, 칼슘 로컬 이벤트를 캡처하는 데 필요한 시간 해상도로 데이터를 수집하기 위해서 전체 512 X 512 화소로부터 촬상 필드를 감소시킨다. 참고 : 예를 들어, 중앙 쿼드256 X 256 픽셀의 인수는 66 FPS로 수집 속도를 속도가 빨라집니다. 더 나아가 격리 자르기 모드 기능을 사용하여 500 FPS로 EMCCD 카메라의 프레임 레이트를 증가하는 것도 가능하다. </li><li> 자동, 기본 활동의 몇 초를 기록 세포에 자외선 플래시를 제공하고 다른 10 ~ 30 초 동안 계속해서 기록하도록 소프트웨어를 구성 할 수 있습니다. 주 : UV 플래시 현미경의 후면 포트에 다이크로 익 미러를 통해 반사 UV 도입 크세논 아크 광원을 사용하여 전달된다. UV 플래시의 지속 시간과 강도는 지역 칼슘 2 + 이벤트의 원하는 주파수를 연상 경험적으로 조정됩니다. </li><li> 이미지가 오프라인 분석을 위해 스택으로 파일을 저장합니다. </li></ol> 5. 자동 칼슘 이미지 분석 참고 :보고, 프로세스, 많은 상용 소프트웨어 패키지를 사용하여 캡처 된 데이터를 분석 할 수 있습니다. 그러나 빠르게 식별을 자동화하는 알고리즘을 개발했다지역의 칼슘 신호의 D 분석. 이 알고리즘에 사용되는 시공간 필터의 상세한 설명은, ΔF / F 0 및 식별 / 분석 루틴의 발생 11에서 찾을 수있다. 이 알고리즘은 오픈 소스 소프트웨어 플랫폼 파이썬에서 실행하기 위해 개발되었으며 의해 함께 샘플 실험 데이터 및 상세한 사용자 명령과 함께 획득 될 수있는 전자 메일로 해당 저자 (ismith@uci.edu). <ol><li> 파일을 변환하는 다중 평면 .TIFF 파일 형식으로 사용자가 작성한 알고리즘로 가져올 수 있습니다. </li><li> 분석 알고리즘이 들어있는 폴더를 찾아 두 번 다음 Run.exe을 클릭합니다. </li><li> .TIFF 파일을 선택 분석합니다. </li><li> 열기 대화 상자에서 분석 매개 변수를 선택합니다. 샘플 데이터에 대한 기본 매개 변수에 대한 그림 2A를 참조하십시오. </li><li> 흑색 레벨을 결정하는 것은 하나는 N을 수행 시야 부분에 커서를 이동하여 화상 스택 엇갈리게구약 셀을 포함한다 (그림 2B 참조) 또는 수동 &#39;으로 설정 블랙 레벨&#39;프롬프트를 사용하여 블랙 레벨을 입력하여. </li><li> 소프트웨어 (그림 2C-F)에 의한 분석 다음 화면에 네 개의 창을 준수하십시오. C는 세포에서 형광을 휴식의 흑백 이미지 분석되고있다. 이 영상에 흰색 사각형 이벤트에 장착 두 차원 가우시안 함수의 중심 위치로 결정 이벤트 위치입니다. </li><li> 각 이벤트 위치를 클릭하거나 이벤트 사이의주기에 커서 키를 누르십시오. 이렇게하면 배경 감산, 가우스 윈도우 D. 이러한 사이트 업데이트에 각각 형광 비율 변경 (ΔF / F 0) 부드럽게 참고 : 레드 이벤트가 인접 사이트 현지화 활동에서 &#39;블리드를 통해&#39;에서 특정 사이트에서 발생하지 결정된다 강조했다. 선택된 부위에서 형광 신호가 검출 초과 여기서 청색 하부 트레이스 나타낸다검은 선이 특정 사이트에서 발생하는 이벤트를 식별하는 반면, 임계 값 (적색에 해당하는 이벤트를 강조). </li><li> 빨간색을 클릭 이벤트의 시간적 진화를 표시 창 E와 함께 장착 가우스 함수의 공간 프로필과 이벤트의 공간 프로파일이 시간 과정을 통해 평균 표시 창 F를 업데이트 이벤트를 강조했다. </li><li> 수동 유물 분석을 거부 할 수 있도록 확인 된 이벤트를 검토합니다. 오른쪽 빨간색을 클릭하여 이러한 이벤트를 삭제 이벤트를 강조했다. 참고 : 우리의 손에, CA는 하나의 IP (3) R 채널을 통해 2 + 플럭스는 ΔF / F 0 내지 약 0.11로 신호를 불러 일으키는, 그래서 이것보다 상당히 작은 감지 된 &#39;이벤트&#39;는 오탐 (false positive)이 될 가능성이 높다. </li><li> 저장 CellR을 관심의 세포 주위에 그려 &#39;을 선택하여 셀 단위로 당에 데이터 또는 수출&#39;Excel로 저장 &#39;을 선택하여 데이터 내보내기17 ;. 주 : 데이터는 원본 이미지 스택과 같은 폴더에 저장됩니다. </li></ol>

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	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+smooth+muscle.">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).</li><li>Hagenston, A. 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S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+automated+detection,+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging.">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li><li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane:+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate.">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li><li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels:+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution.">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

우리는 여기에 설명 형광 칼슘 2 + 지표를 사용하여 배양 된 포유 동물 세포에서 지방의 칼슘 이벤트를 이미징 프로토콜. 또한, 우리는 식별 및 수집 된 데이터의 분석을 자동화하는 직관적 인 사용자 인터페이스와 알고리즘을 설명합니다. 여기에 설명 된 절차는 형광 칼슘 지표 칼-520을 이용하지만, 그러한 FLUO-3, FLUO-4, FLUO-8 및 오레곤 그린 BAPTA-1 등 다른 많은 칼슘...

칼슘 이온 (칼슘)는 도처 유전자 발현, 분비 및 시냅스 가소성 1 오래 지속 변경 사항을 포함 생물학적 과정의 다양한 범위를 조절한다. 칼슘은 다양한 방식으로 행동 할 수있는 방법 중 하나는 칼슘의 다른 공간과 시간 패턴을 통해 세포가 생성 할 수있는 신호를 보낸다. 세포질에서 예를 글로벌 고도 부드러운 근육 조직이 작은 반면에 [칼슘] 트리거 수축, 지역화 된 과도 고도 (현지 칼슘 마이크로 도메인)은 학습과 기억 (3)에 필수적인 유전자 발현을 자극한다. 무료 세포질은 [칼슘 2 +] ~ 100 nm의 휴식에 유지되지만 빠르게 칼슘 통해 세포질로 칼슘의 유입 다음과 같은 몇 가지 마이크로 몰로 세포막에 의해 위치 2+ -permeable 이온 채널을 상승 할 수있다 세포 내에서의 칼슘의 해방tores. 우리 연구소는 소포체 (ER) 막에있는 칼슘 릴리스 채널을 형성하는 이노시톨 1,4,5-trisphosphate 수용체 (IP 3 R)에 초점을 맞추고있다. 수용체의 사이트를 활성화 세포질에 모두 IP (3)과 칼슘의 결합하면, IP (3) R 채널은 칼슘이 ER 루멘 내에서 압수 해방 열립니다. 칼슘 이온의 방출이 공간적으로 (칼슘 2 + 퍼프 4) 칼슘 2의 로컬 세포질 마이크로 도메인을 생성하는 IP 3 루피의 작은 클러스터로 제한 상태로 유지하거나, IP 3 루피의 이웃 클러스터의 근접 정도에 따라 할 수있다 칼슘 유도 된 칼슘 -release (CICR) 5,6의 과정을 통해 여러 퍼프 사이트를 모집하여 세포 전체에 전파. 고급 현미경 imagi과 함께 첸 7 로저에 의해 개발 된 형광 작은 분자 칼슘 지표 염료의 도입,기술을 ng를, 칼슘 신호에 대한 우리의 이해를 촉진 크게있다. 현미경에 사용되는 카메라의 최근 진보는 지금과 같은 전례없는 공간과 시간 해상도 퍼프로 과도 지역 칼슘 이벤트를 이미징 할 수 있습니다. 현재 EMCCD 카메라&gt; 500 프레임 초 -1 (FPS) 및 상보 형 금속 산화 반도체의 새로운 세대에서 128 X 128 픽셀 이미징 할 (CMOS) 카메라가 약간 높게의 비용보다 높은 화소 해상도 및 더 빠른 속도를 제공 할 소음 수준. 총 내부 반사 (TIRF) 현미경과 함께 그것은 이미지에 이제 하나의 칼슘 채널 이벤트 8,9 가능하다. 실무적 수동 처리, 시각적 식별 및 분석 렌더링 자동화 알고리즘 개발에 부담을 배치 대용량 데이터 세트 (분당을 약 1 기가 바이트)를 생성하는 동안이 방법은, 동시에 채널 / 이벤트 수백 이미징을 허용한다. 2 + 지표를 사용하여 그대로 포유류 세포에서 지방의 칼슘 신호를 영상화하기위한 절차 및 프로토콜을 제시한다. 우리는 더 TIRF 기존 넓은 필드 에피 형광 (WF) 현미경 모두 몇 군데 지역 칼슘 이벤트의 식별 및 분석을 자동화 오픈 소스 환경 파이썬으로 개발 한 알고리즘을 보여줍니다. 우리는 IP 칼슘 신호를 -generated 3의 맥락에서 이러한 방법을 설명하지만, 그들은 [칼슘 2 +] 칼슘의 다양한 중 표면에있는 2 + -permeable 이온 채널을 발산 세포질에서 로컬 변경 사항을 연구하기 쉽게 의무가 있습니다 막 또는 세포 내 소기관 8-10.

<table><tbody><tr><td>Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520/AM</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21130</td><td></td></tr><tr><td>ci-IP&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;(D-23-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-Isopropylidene-6-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-&lt;em&gt;myo&lt;/em&gt;-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester</td><td>SiChem</td><td>cag-iso-2-145-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO/20% pluronic F127</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>EGTA/AM</td><td>Invitrogen</td><td>E-1219</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass-bottom imaging dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells

세포질 칼슘 2 + 이온은 유전자 전사, 전기 흥분과 세포 증식으로 광범위한 프로세스를 제어, 거의 모든 종류의 세포에서 세포 활동의 다양한 측면을 조절한다. 칼슘 신호의 다양성과 특이성은 현지 과도 칼슘 마이크로 도메인 분의 기간에 걸쳐 발생하는 세포 전체의 진동과 파도에 이르기까지 칼슘 신호는 서로 다른 시간과 공간 규모 이상 행동을 생성하는 메커니즘에서 유래 (칼슘 퍼프) 지속 (밀리 초). 전자의 최근 진보는 CCD는 (EMCCD) 카메라는 지금&gt; 500 프레임 초 -1 (FPS)의 속도로 128 X 128 픽셀의 공간 해상도를 가진 지역의 칼슘 신호의 영상을 허용 곱한. 이 접근법은 매우 평행 한 번의 실험에서 채널 또는 퍼프 사이트 수백 동시에 모니터링 할 수있다. 그러나, 데이터의 방대한 양의 생성 (약 1 기가 체육R 최소) 2 + 이벤트 불가능한 로컬 CA의 시각적 식별 및 분석을 렌더링합니다. 여기에 우리가 설명하고 수집, 탐지를위한 절차를 설명하고, 넓은 필드 에피 형광 (WF) 및 총 내부 반사를 모두 사용하여 칼슘 2 + 지표로드 그대로 포유류 세포에서 칼슘에게 2+ 신호를 매개 성 3 로컬 IP 분석 형광 (TIRF) 현미경. 또한, 우리는이 지역의 칼슘 신호의 식별 및 분석을 자동화 오픈 소스 소프트웨어 환경 파이썬에서 개발 한 알고리즘을 설명합니다. 알고리즘은 서브 픽셀 해상도의 칼슘 방출 사이트 편재; 데이터의 사용자 리뷰를 할 수 있습니다; 엑셀과 호환 표의 진폭 및 속도 데이타와 함께 형광 신호의 비율의 시간 시퀀스들을 출력한다.

그림 1A는 CI-IP 3로드 인간의 신경 모세포종 SH-SY5Y 세포에서 칼-520 형광 휴식의 WF 이미지를 보여줍니다. 사진 릴리스로 100 밀리 초 UV 플래시 이러한 세포의 노출은 I-IP 3 (그림 1A에 흰색 원으로 주목) 이산 사이트에서 일시적인 칼슘 2 + 퍼프를 이끌어 냈다. 이 사이트에서 측정 된 형광 추적을 서서히 방출 사이트에서 확산 칼슘 2로 훨씬 느?...

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Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

10.7K 조회수.  University of California, Irvine. Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

비디오: Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

두피 네트워크 개발에 기능성 칼슘 이미징

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

연구

신경과학

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

발생학

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

로컬 Ca2 + 신호 막 대상 Ca2 + 지표에 의해 경작된 한 세포에의 해 부

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

바이러스에 감염된 인간 장 오가노이드 단층의 칼슘 이미징

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory activity, actin dynamics, inflammatory responses, stem cell proliferation, and many other uncharacterized cellular functions. As such, mapping calcium signaling dynamics within the intestinal epithelium can provide insight into homeostatic cellular processes and unveil unique responses to various stimuli. Human intestinal organoids (HIOs) are a high-throughput, human-derived model to study the intestinal epithelium and thus represent a useful system to investigate calcium dynamics. This paper describes a protocol to stably transduce HIOs with genetically encoded calcium indicators (GECIs), perform live fluorescence microscopy, and analyze imaging data to meaningfully characterize calcium signals. As a representative example, 3-dimensional HIOs were transduced with lentivirus to stably express GCaMP6s, a green fluorescent protein-based cytosolic GECI. The engineered HIOs were then dispersed into a single-cell suspension and seeded as monolayers. After differentiation, the HIO monolayers were infected with rotavirus and/or treated with drugs known to stimulate a calcium response. An epifluorescence microscope fitted with a temperature-controlled, humidified live-imaging chamber allowed for long-term imaging of infected or drug-treated monolayers. Following imaging, acquired images were analyzed using the freely available analysis software, ImageJ. Overall, this work establishes an adaptable pipeline for characterizing cellular signaling in HIOs.

저자 스포트라이트: 장 상피 신호의 바이러스 파괴 조사 – 연구 통찰력 및 향후 방향 

This protocol describes an approach for performing calcium imaging in virus-infected human intestinal organoids and offers an approach to analysis.

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

면역학 및 감염병학

Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral (dorsal root ganglia) and central tissues (cortex, subventricular zone, organoid) that are dynamically studied in terms of calcium shifts. The model chosen to illustrate the results is the retina, a simple tissue with complex cellular interactions. Calcium is a universal messenger involved in most of the important cellular roles. We explain in a step-by-step protocol how retinal neuron-glial cells in culture can be prepared and evaluated, envisioning calcium shifts. In this model, we differentiate neurons from glia based on their selective response to KCl and ATP. Calcium permeable receptors and channels are selectively expressed in different compartments. To analyze calcium responses, we use ratiometric fluorescent dies such as Fura-2. This probe quantifies free Ca2+ concentration based on Ca2+-free and Ca2+-bound forms, presenting two different peaks, founded on the fluorescence intensity perceived on two wavelengths.

Cell calcium imaging is a versatile methodology to study dynamic signaling of individual cells, on mixed populations in culture or even on awakened animals, based on the expression of calcium-permeable channels/receptors that gives unique functional signatures.

칼슘 이미징 기술로 뉴런-글리아 회로의 변화 시각화

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral ...

<meta charset="utf8"></head><body>T 세포에서 Ca2+ 마이크로도메인을 검출하기 위한 고분해능 이미징 기법

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Unraveling the Initial Activation of the Adaptive Immune Response for Therapeutic Intervention

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

일차 T 세포에서 초기 Ca2+ 마이크로도메인 이미징

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

이미징 로컬 CA

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두피 네트워크 개발에 기능성 칼슘 이미징

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

로컬 Ca^{2 +} 신호 막 대상 Ca^{2 +} 지표에 의해 경작된 한 세포에의 해 부

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징

칼슘 이미징 기술로 뉴런-글리아 회로의 변화 시각화

일차 T 세포에서 초기 Ca²⁺ 마이크로도메인 이미징