또한, 우리는 그들의 우수한 기술 지원을위한 인간의 심방 조직과 클라우디아 Liebetrau, 카트린 Kupser 및 라모나 나겔의 제공에 하이델베르크 대학에서 심장 외과 감사합니다. 그의 도움이 제안과 칼슘 2 + 과도 측정을 설정하는 동안 조언도 앤디 W. 트래포드에 특별한 감사합니다. 그들은 세포의 전기 생리학 및 심근 분리의 기본 기술과 기술을 배우기 위하여 저희에게 제공하는 기회를 기술의 드레스덴 대학 : 저자는 약리학 및 독물학의 부 (어슐러 까마귀 머리)의 구성원에게 그들의 깊은 감사를 표현하고 싶습니다. 저자의 연구는 독일 연구 재단 (Do769/1-1-3), 심방 세동 역량 네트워크를 통해 독일 연방 교육 연구부 (01Gi0204) 심장 혈관 연구에 대한 독일의 센터를 통해 유럽 연합에 의해 지원됩니다 유럽​​ 연합 (EU)심방 세동의 번역 연구 ropean 네트워크 (EUTRAF, FP7 - 건강 - 2010 년 대규모 적분 프로젝트 제안 번호 261057)과 유럽 북미 심방 세동 연구 연합 (ENAFRA) 매그 Leducq (07CVD03)의 교부. 비디오 파일에 나와있는 회로도 개요는 Servier의 의료 기술을 사용하여 제작되었습니다.

실험 프로토콜은 로컬 윤리위원회의 승인을 모든 환자가 서면 동의를 제공해야 할 필요가있다. 우리의 연구는 의료 학부 만하임 윤리위원회, 하이델베르크 대학교 (# 2011-216N-MA)에 의해 승인 된 인간의 복지에 대한 모든, 기관 국가 및 국제 지침을 준수 하였다. 모든 환자는 서면 동의를 주었다. 0. 인간의 심방 조직을 얻는 이식 심폐 바이 패스를위한 오픈 심장 수술을받은 환자의 일상 도관의 과정에서, 오른쪽 심방의 끝은 일반적으로 제거되고 심방 심근의 분리에 사용할 수 있습니다. BDM, 수축 억제제, 심근 C 방지, 절제 후 조직 샘플은 2,3 - butanedione monoxime을 (표 I 포함 + 무료 전송 솔루션은 멸균 칼슘 2 50 ML 팔콘 튜브에 즉시 전송됩니다) ontracture. 30 ~ 45 분 사이의 전송 시간으로, 우리는 고립 된 심방 심근의 수와 질 모두에 대해 냉각 또는 산소의 명확한 이점을 인식하지 않았다. 실험실 일반 교통에 가능한 한 빨리해야한다. 긴 수송 시간은 피할 수없는 경우, 4에서 전송 ° C 산소 용액에 유리할 수 있습니다. 1. Prearrangements <ol><li> 재킷 비커 (표 II)의 온도를 제어하는 thermocirculator에 전환합니다. 비커 내부의 온도가 37 ° C.와 동일해야합니다 전체 분리 과정을 통해 비커 내에서 일정한 온도를 유지하기 위해 유리 뚜껑 비커를 다룹니다. </li><li> 세 개의 유리 비커에 콜라게나 제 I 및 프로테아제 XXIV의 무게를 실온에서 보관하십시오. 효소는 사용 직전에 희석 될 것입니다. </li><li> 칼슘의 저장소 20 ML 4에서 페트리 접시에 + 무료 솔루션 ° C. </li><li>칼슘의 저장 250 ML 37 물 목욕 + 무료 솔루션 ° C. </li></ol> 2. 조직의 청소 <ol><li> 페트리 접시 (~ 10 cm 직경)로 전송 솔루션과 함께 조직 샘플을 전송하고 약 가위를 사용하여 지방 조직을 제거합니다. </li><li> 조직 샘플의 무게. 200과 600 mg의 세포 분리에 사용됩니다. 나머지 조직은 나중에 생화학 적 분석을 위해 액체 질소에 냉동 수 있습니다. </li><li> 20 ML 칼슘이 들어있는 페트리 접시에 조직 샘플을 전송 4에서 + 무료 솔루션 ° C (단계 1.3 참조)의 크기는 약 1mm 3 작은 덩어리로 조직 샘플을 잘라. </li><li> 다음 단계는 100 % O 2 37 ° C에서 지속적인 가스 처리에서 실행해야합니다. 피펫 팁은 강력한 버블 링을 방지하고 지속적인 공기 흐름을 생성하기 위해 산소 튜브에 배치 할 수 있습니다. </li><li> 에서 칼슘 2 + 무료 솔루션과 함께 조직 덩어리를 전송재킷 비커에와 자석 교반 막대 약 3 분 동안주의 깊게 약동하십시오. </li><li> 교반을 중지하고 조직 덩어리가 몇 초 동안 정착 할 수 있습니다. 나일론 메쉬 (200 ㎛, 표 II)를 통해 상층 액을 조심스럽게 변형. 집게를 사용하여 비커에 메쉬 절제된 조직 덩어리를 반환합니다. </li><li> 칼슘과 보충 비커 + 무료 솔루션 및 세척 단계에게 2.4 2.5 두 번 반복합니다. </li></ol> 3. 첫 번째 효소 소화 <ol><li> 콜라게나 제와 단백질 분해 효소를 포함하는 20 ML 효소 솔루션 E1 (표 I)와 조직 덩어리를 다시 중지하고 10 분 동안주의 깊게 약동하십시오. </li><li> 20 μM 칼슘 2 +의 최종 농도를 얻기 위해 10 mM의 염화칼슘 2 용액 40 μl를 추가합니다. </li><li> 35 분 조직 덩어리의 대부분은 비커에 남아있는 방식으로 나일론 메쉬 (200 ㎛, 표 II)를 통해 조심스럽게 상층 액을 변형 한 후. 나머지를 반환메쉬 비커에 조직 덩어리 비가 내렸다. </li></ol> 4. 두 번째 효소 소화 <ol><li> 난 단지 20 ML 효소 솔루션 E2 포함 된 콜라게나 제 (표 I) 다시 조직 덩어리를 resuspend을. 바로 20 μM 칼슘의 최종 농도를 얻기 위해 10 mM의 염화칼슘 2 용액 40 μl를 추가합니다 +. </li><li> 두 번째 소화 용 가위 동안 더욱 가끔 조직의 혈전을 잘라합니다. </li><li> 5 분 후 세포의 분리를 확인 파스퇴르 피펫을 사용하여 샘​​플을 채취. 막대 모양의 줄이있는 심근이 나타날 때까지 2-3 분마다 반복합니다. </li><li> 교반을 중지하고 조직 덩어리는 약 20 ~ 30 초 동안 정착 할 수 있습니다. </li><li> 50 ML 팔콘 튜브 (관)에 나일론 메쉬 (200 ㎛, 표 II)를 통해 조심스럽게 상층 액을 변형. 비커에 메쉬 구속 조직 덩어리를 반환합니다. </li><li> 20 ML 스토와 비커의 조직 덩어리를 다시 일시 중지합니다GE 용액 (표 I) 10 더 디스펜서로 20 ML 혈청 피펫을 사용하여 부드러운 기계적 분쇄하여 세포를 떼어 놓다. 거품 세포의 생존과 품질에 해로운 때문에 거품 형성을 방지하려고합니다. </li><li> 50 ML 팔콘 튜브 (튜브 B)에 나일론 메쉬 (200 ㎛, 표 II)를 통해 조심스럽게 상층 액을 변형. </li></ol> 5. 최종 칼슘의 최종 준비 및 조정 + 농도 <ol><li> 10 분 95 XG에서 팔콘 튜브와 B (단계 4.5 및 4.7 참조​​)를 모두 원심 분리기. </li><li> 흡인에 의해 조심스럽게 두 튜브에서 뜨는을 제거합니다. 펠렛을 방해하지 않도록합니다. 상층 액을 버린다. </li><li> 1.5 ML 스토리지 솔루션 (표 I) 각 (상온)에서 모두 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 두 번 각 팰콘 10 mM의 염화칼슘 용액 7.5 μL를 추가하고 신중하게 약동하십시오. 각 단계 후 10 분 동안 품어. </li><li>0.2 mm의 최종 칼슘 2 + 농도를 얻기 위해 10 mM의 염화칼슘 용액 15 μl를 추가합니다. </li></ol> 6. 형광 칼슘 2 + - 표시 플루오 오전 3시 (그림 1) 근육 세포의로드 <ol><li> 2 ML의 microcentrifuge 튜브 (에펜 도르프 튜브)에 세포 현탁액의 1.5 ML (튜브 및 / 또는 관 B)를 전송합니다. </li><li> 다음 단계는 형광 칼슘 2 + 표시 플루오 3의 빛의 감도를 고려에서 실행해야합니다. </li><li> 플루로 닉 F-127 (표 3) 원액 (20 % 무수 DMSO에 W / V)를 얻을 수있는 44 μL에 플루오 3 막 투과 아세 톡시 메틸 에스테르 유도체 (플루오로-3 AM, 표 III)의 50 μg을 용해 1 ㎜ 플루오-3는 최대 1 주 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다 원액, 오전. </li><li> 15 μl를 추가 플루오 3 1.5 세포 현탁액의 ML (단계 6.1 참조)와 교반을 포함하는 microcentrifuge 관에 원액 오전주의. </li><li> 광학적으로 불투명 한 상자에 10 분 동안 세포 현탁액을 품어. </li><li> 간단히 약 6,000 rpm에서 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소하고 1.5 ML 목욕 용액 (표 IV)에서 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 실험을 시작하기 전에 드 에스테르 화 약 30 분 세포 현탁액을 남겨주세요. </li></ol> 7. 동시에 패치 클램프 Epifluorescent 칼슘 2 + 측정 패치 클램프 측정이 리뷰의 주요 주제 아니기 때문에, 우리는이 기술의 깊이 설명에 더 많은을 제공하는 다른 간행물에 관심있는 독자를 참조하십시오. 11-14 완성도를 위해서 우리가 측정 할 수있는 프로토콜의 간단한 요약을 제공합니다 활동 전위 또는 L-형 칼슘 2 + 전류의 동시 칼슘 2 + 과도 녹음과 함께 두. 실험을하는 동안 근육 세포는 목욕 soluti입니다와 37 ° C에서 superfused 있습니다신속한 재관류 시스템 (Octaflow IITM, ALA 과학 악기, NY)를 사용하여 (표 IV)에. 전압 클램프 실험, K + 전류는 목욕 솔루션에 4-아미노 피리딘 (5 mmol / L)와 BaCl 2 (0.1 mmol / L)를 추가로 차단됩니다. 붕 규산염 유리 미세 전극을 사용하고 피펫 용액 (표 V)로 가득 할 때 MΩ 2-5 저항 팁을해야합니다. 플루오 3에 더하여 (6 단계 참조) 근육 세포의로드 오전 플루오 3는 피펫 용액 (표 V)에 포함되어 있습니다. 형광은 488 nm에서 흥분과 방출되는 빛은 (&lt;520 nm의) [칼슘 2 +] 나는 가정으로 변환됩니다 <img alt="식 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> 여기서 K D 플루오 3 일정 = 해리 (864 NM), F = 플루오로-3 형광;. F 최대 = 칼슘 각 실험의 끝에 얻어진 + 포화 형광 12 전기 신호 epifluorescent 칼슘 2 + 신호 모두를 동시에 기록됩니다. 활동 전위는 1.2 임계 강도의 1 밀리 전류 펄스를 사용하여 전류 클램프 모드에서 0.5 Hz로 자극된다. L-타입 칼슘 2 + - 전류 100 밀리가 빠른 나 + 전류, 다음을 비활성화 할 -80 MV의 지주 잠재력과 -40 mV에서 100 밀리 초 램프 펄스를 사용하여 전압 클램프 모드에서 측정 0.5 Hz에서 +10 mV에서 테스트 펄스.

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Res. 66, 1277-1286 (1990).</li><li>Hove-Madsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+fibrillation+is+associated+with+increased+spontaneous+calcium+release+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+human+atrial+myocytes.">Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes.</a> Circulation. 110, 1358-1363 (2004).</li><li>Molina, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+adenosine+monophosphate+phosphodiesterase+type+4+protects+against+atrial+arrhythmias.">Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).</li></ol>

워딩 턴 생화학 공사는 비디오 파일의 생산 비용을 포함하여 게시를 지원했다. 출자자은 연구 설계의 역할, 데이터 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비가 없었다.

여기에서 우리는 오픈 심장 수술을받은 환자에서 얻은 심방 부속기에서 인간의 심방 근육 세포의 분리 방법을 설명합니다. 세포질 칼슘의 측정이 근육 세포를 사용하기 위해서는 + 우리는 스토리지 솔루션에서 EGTA를 생략하여 앞에서 설명한 방법 4-11 적응. 이미 1970 년에 그것은 근육 세포가 + 소화하는 동안 칼슘의 존재 해리 있지만, 그들 모두가 따라서 수축과 비 생존. 16, 17에 있었다는 것을 관찰되었고, 세포의 분리는 칼슘 2 + 무료 솔루션에서 수행됩니다. 그러나 칼슘의 생리적 농도의 재 도입 + 빠른 칼슘 2 + 유입과 세포의 죽음을 초래. 이것은 원래 짐머만과 훌스에 의해 관류 마음에서 관찰되었다 칼슘 2 + 역설 현상으로 설명하고있다. 7.0의 pH 감소 등의 절연 매체의 18 수정 &lt;타우린 20 또는 칼슘 2 + (단계 3.2 및 4.1 참조), 21뿐만 아니라 스토리지 솔루션 22을 포함 EGTA 격리 된 근육 세포의 저장을 소량의&gt; 19 추가 한모금은 칼슘 2 + 역설 17.을 방지하기 위해 제안되었다 그러나, 그것은 또한 칼슘 2 + EGTA를 통해 버퍼링 L-타입 칼슘의 진폭 + 전류에 의한 칼슘 2 + 과도 진폭과 칼슘 2 + 과도 이상성 붕괴의 결과를 감소하는 것으로 알려져있다. 23 그러므로 우리는 EGTA 생략 일반적인 속성과 monophasic 붕괴와 칼슘 2 + 과도를 얻기 위해 전체 분리 과정을 통해. 칼슘의 세포를 보호하기 위해 + 역설 우리는 0.2 밀리미터까지 단계적 방식의 스토리지 솔루션의 최종 칼슘 2 + 농도를 증가했다. 콜라의 선택은 아마도 성공 심근 절연을위한 가장 중요한 단계입니다. 기존 콜agenases은 클로 스트 리듐 속의 세균 histolyticum에서 얻은 원유 준비하고 다른 단백, polysaccharidases 및 리파제의 숫자뿐만 아니라 콜라가 포함되어 있습니다. 그들의 일반적인 구성 collagenases에 따라 다른 유형으로 나뉩니다. 24 워딩 턴 콜라 유형 I 및 II가 성공적으로 우리의 현재 기술 프로토콜에서 인간의 심방 근육 세포의 분리. 4-10,15,25-30에 사용 된 우리는 콜라게나 제의 사용을 권장합니다 우리는 또한 교원질 유형 II를 사용하여 가능한 세포의 수용 양을 얻을 수 있었지만, I를 입력합니다. 그러나 단 한 번의 콜라 유형 내에서 효소의 활동에 관한 중요한 배치 별 변화가있다. 이러한 변화는주의 일괄 선택 및 분리 절차를 최적화하기 위해 다양한 배치의 테스트를 필요로합니다. 워딩 턴 생화학 공사 (에서 온라인으로 사용할 일괄 선택 도구 <a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / CLS / match.php)는 인간의 심방 근육 세포의 분리에 적합한 것으로 표시되었습니다 조성 사용할 배치를 찾는 데 사용할 수 있습니다. 현재 우리는 콜라가 250 U / MG 콜라 활동, 345 U / MG caseinase 활동, 2.16 U / MG clostripain 활동과 0.48 U / MG 트립신 활동 (제비 # 49H11338)와 I를 입력하십시오. 이 논문에 설명 된 절차를 사용하여 얻은 세포 패치 - 클램프 연구, 칼슘 2 + 과도 측정하고 또한 모두. 15 조합을 8 시간에서 사용할 수 있습니다,이 세포는 전기장 자극에 대한 응답으로 세포의 수축을 측정 할 수 있도록 또는 전기 자극 패치 - 클램프 피펫 (게시되지 않은 관찰)를 사용.

패치 클램프 기술과 + 핸들링 이상 격리 된 심근을 필요로 세포의 칼슘의 탐사와 심장 이온 채널의 전기 생리학 특성을 공부합니다. 이들은 일반적으로 소화 효소에 심장 조직 샘플의 체외 노출 (콜라, 히알루, 펩티드 등)에 따라 얻을 수 있습니다. 1955 2 가능한 심장 근육 세포의 분리의 첫 번째 보고서 이후 프로토콜의 큰 양 마우스, 쥐, 토끼, 개, 기니 돼지와 인간을 포함한 다른 종에서 하나의 심방과 심실 심근를 수확하기 위해 개발되었습니다. 이 리뷰에서 우리는 인간의 심방 근육 세포의 분리에 초점을 맞 춥니 다. 우리는 워딩 턴 생화학 공사, 미국 (에서 제공하는 &quot;워딩 턴 조직 해리 가이드&quot;를 참조하십시오 다른 종에서 근육 세포의 분리 절차에 관한 <a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com을</a> ). 외. 3에 설명 된 방법에서 파생됩니다 패치 클램프 실험뿐만 아니라, 동시에 세포 내 칼슘 2 + 측정뿐만 아니라 적당한 심방 근육 세포를 얻을 수 있습니다. 4-11

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> &nbsp;</td>
 <td> &nbsp;</td>
 <td> &nbsp;</td>
 <td>Transport solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A3059</td>
 <td>Storage solution: 1%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BDM</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>31550</td>
 <td>Transport solution: 30</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-b-Hydroxy-butyric acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6501</td>
 <td>Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td>Transport solution: 20 
 Ca2+-free solution: 20 
 Enzyme solution E1 and E2: 20 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1251</td>
 <td>Storage solution: 70</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Transport solution: 10 
 Ca2+-free solution: 10 
 Enzyme solution E1 and E2: 10 
 Storage solution: 20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KH2PO4</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P5655</td>
 <td>Transport solution: 1.2 
 Ca2+-free solution: 1.2 
 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO4</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M9397</td>
 <td>Transport solution: 5 
 Ca2+-free solution: 5 
 Enzyme solution E1 and E2: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MOPS</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M1254</td>
 <td>Transport solution: 5 
 Ca2+-free solution: 5 
 Enzyme solution E1 and E2: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3014</td>
 <td>Transport solution: 100 
 Ca2+-free solution: 100 
 Enzyme solution E1 and E2: 100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taurin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>86330</td>
 <td>Transport solution: 50 
 Ca2+-free solution: 50 
 Enzyme solution E1 and E2: 50 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase I</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>4196</td>
 <td>Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease XXIV</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8038</td>
 <td>Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml*</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Transport solution: 7.00 
 Ca2+-free solution: 7.00 
 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 
 Storage solution: 7.40</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Transport solution: 1 M NaOH 
 Ca2+-free solution: 1 M NaOH 
 Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH 
 Storage solution: 1 M KOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table I. Solutions.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon mesh (200 &mu;m)</td>
 <td>VWR-Germany</td>
 <td>510-9527</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Jacketed reaction beaker</td>
 <td>VWR</td>
 <td>KT317000-0050</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table II. Specific equipment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl-sulphoxide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2650</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-3 AM (special packaging)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F-1242</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F-127</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>P6867</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Bath solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-aminopyridine*</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A78403</td>
 <td>Bath solution: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BaCl2*</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>342920</td>
 <td>Bath solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2 &times; 2H2O</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C5080</td>
 <td>Bath solution: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td>Bath solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H9136</td>
 <td>Bath solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Bath solution: 4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl &times; 6H2O</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M0250</td>
 <td>Bath solution: 1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3014</td>
 <td>Bath solution: 140</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Probenecid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8761</td>
 <td>Bath solution: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Bath solution: 7.35</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Bath solution: 1 M HCl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Pipette solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-aspartat K+-salt</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2025</td>
 <td>Pipette solution: 92</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E4378</td>
 <td>Pipette solution: 0.02</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP-Tris</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G9002</td>
 <td>Pipette solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H9136</td>
 <td>Pipette solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Pipette solution: 48</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9187</td>
 <td>Pipette solution: 1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2383</td>
 <td>Pipette solution: 4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-3**</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F3715</td>
 <td>Pipette solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>7.20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>1 M KOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and membrane currents

패치 클램프 기법과 심장 세포의 칼슘의 탐사와 심장 이온 채널의 전기 생리학 특성의 연구는 + 처리 이상 격리 심근이 필요합니다. 또한, 이러한 기술을 사용하여 환자의 근육 세포를 조사 할 수있는 가능성은 심방 세동 (AF)와 같은 심장 질환의 분자 기초를 해명하는 귀중한 요구 사항입니다. 여기에 1 우리는 모두에 적합한 인간의 심방 근육 세포의 분리 방법을 설명 패치 클램프 연구와 세포 내 칼슘 2 + 농도의 동시 측정. 첫째, 오픈 심장 수술을받은 환자에서 얻은 심방 부속기는 작은 조직 덩어리 ( &quot;청크 방법&quot;)로 잘게 + 무료 솔루션 칼슘에 씻어 수 있습니다. 그런 다음 조직 덩어리가 20 μM 칼슘 2 + 솔루션을 포함하는 콜라게나 제와 단백질 분해 효소로 소화된다. 그 후, 고립 된 근육 세포는 하브 있습니다조직 현탁액의 여과 및 원심 분리하여 STED. 마지막으로, 세포 스토리지 솔루션에 칼슘 2 + 농도는 0.2 mm까지 단계적으로 조정됩니다. 우리는 간단히 +와 칼슘 2 + 분리 과정에서 버퍼링도 활동 전위와 막 전류의 대표 녹음을 제공하고, 모두 함께 동시에 칼슘 2 + 과도 측정이 고립 된 근육 세포에서 수행과 칼슘의 의미를 설명합니다.

그림 2a는 고립 된 인간의 심방 근육 세포에서 세 가지 대표적인 예를 보여줍니다. 우리는 CellFinder 현미경 슬라이드 (에 세포 현탁액 (단계 5.5) 10 μL 피펫 세포 수율 계량 <a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html을</a> ). 16.5 ± 3.1 cells/10 μL (n은 = 29) 대 5.1 ± 2.3 cells/10 μL : 그림 2B의 평균 세포 수율은 분명히 만성 AF (CAF)의 낮은 세포 수율 경향 환자 샘플 (튜브가 있음을 나타냅니다 (N = 10)는 각각 SR 및 카페에서, p &lt;0.05; 관 B : 17.9 ± 3.9 cells/10 μL (N = 29) 대 5.9 ± SR과 카페에서 2.0 cells/10 μL (n은 = 10), 각각, p = 0.107). 활동 전위 측정 및 세포질 칼슘 2 + 과도의 동시 녹음의 대표적인 예는 그림 3에 나와있다. 조사 세포, T의 약 90 %에그는 액션 잠재적 인 트리거 칼슘 2 + 릴리스는 명확하고 일반 세포의 수축을 발생합니다. 이전에보고 된 세포의 무결성에 대한 허용 지표 휴식 막 잠재력은 -73.9에 대한 평균 ± 2.7 MV (N = 10분의 23 근세포 / 명)와 -77.7 ± 1.8 MV (N = 8분의 19 근세포 / 환자 )는 각각 SR, 커피 (p&gt; 0.05) 인치 15 그림 4는 전압 문 L-타입 칼슘 2 + 전류와 세포질 칼슘 2 + 과도의 대표 동시 녹음을 보여줍니다. 비 선택적 β-아드레날린 수용체 작용제 isoprenaline (1 μM)의 적용은 그대로 β-아드레날린 성 신호 전달 폭포를 제안, I 칼슘, L 및 세포질 칼슘 2 + 과도 모두의 진폭을 증가시킵니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> 에프igure 1. 근육 세포 플루오 3의 흐름도는 (단계 6.1-6.5 참조) 프로토콜을로드 오전. M / V, 질량 / 부피. <img alt="그림 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> 그림 2. 스토리지 솔루션에서 한 한시간, 고립 된 인간의 심방 근육 세포. B는 스토리지 솔루션에서 세포의 10 μL에서 계산 셀 수율의 ± SEM (단계 5.5 참조)를 의미합니다. 여기서 n은 각 그룹 내에서 준비의 수를 나타냅니다. * P &lt;0.05. <img alt="그림 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> 액션 잠재적 인 트리거 칼슘 2 동 율동에서 심방 근육 세포에서 + - 과도 (CAT) 및 CHR의 그림 3. 대표 기록술폰산 심방 세동 환자. 최고 : 주입 된 자극 (0.5 Hz에서)에 사용되는 현재의 막 (I M). 아래의 : 막 전위 (V M), 및 트리거 된 고양이 (아래)의 동시 녹음. (보이트 등의 허가를 Replotted. 2012) 15 <img alt="그림 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> L-타입 칼슘 2 isoprenaline (1 μM) 효과의 그림 4. 대표 녹음 + 전류 트리거 칼슘 부비동 리듬과 만성 심방 세동 환자에서 심방 근육 세포에서 + - 과도 (CAT). 최고 : 전압 클램프 프로토콜 (0.5 Hz에서). 아래 : 현재 총 순 막 동시 녹음 (I M), 주로 L-타입 칼슘 2 + 전류 (가운데) 및 트리거 된 고양이 (아래) 반영합니다. (보이트의 허가를 Replotted,외. 2012) 15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="표 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> 표 I. 솔루션을 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="표 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> 표 2. 특정 장비. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="표 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> 표 3. 플루오-3와 근육 세포의로드 물질하십시오. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="표 4" fo:conteNT 너비 = &quot;2.5 인치&quot;FO : SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot;/&gt; 표 IV. 패치 클램프 목욕 솔루션입니다. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="표 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> 패치 클램프 * 표 V. 피펫 솔루션입니다.

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Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

우리는 세포 내 칼슘에 사용할 수있는 인간의 심방 근육 세포의 분리를 설명<sup&gt; 2 +</sup전기 생리학 패치 - 클램프 연구와 함께&gt; 측정.

칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리<sup&gt; 2 +</sup&gt; 과도하고 막 전류

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

isolation-human-atrial-myocytes-for-simultaneous-measurements-ca2

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

20.2K 조회수.  University of Duisburg-Essen. 우리는 세포 내 칼슘에 사용할 수있는 인간의 심방 근육 세포의 분리를 설명 2 + 측정.

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Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

성인 쥐 심장 Myocytes의 차 문화

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

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Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

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Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

이미징 CA의 기술 2 + 인간 정자의 시그널링

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

손쥐 심방과 심실 Cardiomyocytes의 절연 및 KV 채널 레코딩

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

개발 및 특성화의<em&gt; 체외</em&gt; 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; 전</sub&gt; 및 질소 산화물 생산

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

성인 마우스에서 동방 노드 근육 세포의 분리, 문화 및 기능 특성화하는 방법

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

동시 매핑 및 인간 미토 콘 드리 아 DNA에 Ribonucleotides의 정량

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...