이 작품은 생명 과학의 징계에서 호주 연구 협의회 (ARC DP0988227)과 생명 과학 연구 이니셔티브 그랜트, 시드니의 대학에 의해 지원됩니다. 장비 패치 클램프 증폭기는 EPC 8 생명 과학, 시드니 대학의 징계에서 시작 기금에 의해 투자되었다. 장비 InstruTECH LIH 8 +8 데이터 수집 시스템은 레베카 L. 쿠퍼 재단과 생명 과학, 시드니 대학의 징계에서 시작 기금으로부터 자금 구입했습니다. 우리는 그들의 통찰력있는 제안과 의견을 익명의 검토를 감사하고 싶습니다.

1. 일반 설정 및 조직 준비 <ol><li> 30 분 (의 스트레스 수준을 줄이기 위해 목표)를 위해 어둠 속에서 마우스를 유지합니다. 기다리는 동안, 세포 용액 1 L를 준비합니다. 첫 번째 밀리 Q 물 반 리터에 탄산 수​​소 나트륨 1.9 g을 용해. 의 pH는 95 % O 2 5 % CO 2와 버블 링에 의해 7.4로 유지됩니다. 5 분 후, 밀리 Q 물과 1 L까지 정상, 중탄산 나트륨 용액에 추가 밀리 Q 물 100 ㎖에 에임스 보통 8.8 g을 녹이고 잘 섞는다. 실험의 나머지 carboxygenated이 솔루션을 유지한다. </li><li> carboxygenated 에임스 보통 250 mL를 취하여 전기 생리학의 유체 재관류 시스템을 셋업 설정합니다. 솔루션 carboxygenated 유지한다. </li><li> 균일하게 얼룩 재관류 챔버의 바닥 위에 진공 그리스의 얇은 층을. 커버 슬립으로 밀봉하고 공기 꽉 있는지 확인합니다. 그리스 (직경 1 ~ 2 ㎜)의 소량을 가지고 정상에 위치하고하단 챔버의 끝. 이 공 장소에서 그리드 (백금 프레임 치실로 묶인)를 보유하고 망막에 너무 열심히 눌러 방지 할 수 있습니다. 플랫폼에 챔버를 고정하고 두 구멍을 맞 춥니 다. </li><li> 동물 자궁 전위에 의해 희생 후 2 분, 그리고에 대한 isoflurane을 우선으로하는 마취입니다. 빨리 작은 가위 (곡선 블레이드)의 한 쌍의 눈을 제거 carboxygenated 세포 외액으로 가득 페트리 접시에 배치 한 다음 작은 비커에 carboxygenated 세포 외액 깨끗이 씻어. </li><li> 해부 현미경, 19 게이지 바늘을 사용하여 각막에 삽입 구멍 (가장자리에서 1 ~ 2 ㎜)합니다. 다른 아이에 대해 반복합니다. 이 중요한 단계는 모두 망막의 산소를 허용하는 신속해야한다. 의 가장자리에 평행하게 절단하여 홍채 가위의 작은 쌍을 하나의 각막을 제거합니다. 다음으로, 미세 집게 한 쌍의 조리개와 렌즈를 제거합니다. 다른 아이에 대해 반복합니다. 포함하는 비이커에 한 아이 컵을 전송세포 솔루션을 carboxygenated. </li><li> 메스 블레이드, 전체 마운트를 평평하게하고 망막 당 두 개의 전체 - 마운트를 얻을 수 있도록, 반에 한 아이 컵을 잘라. 무뚝뚝한 해부 프로브를 사용하여 색소 상피 나 가볍게 닦아내 당겨 망막을 조심스럽게 분리합니다. 일단 분리, 망막은 매우 투명합니다. 볼록한 표면은 광 수용체 측에 참고. 오목한 표면은 신경절 세포 측면이며 끈적 유리체 유머의 존재로 인해 자체에 붙어 있습니다. </li><li> 미세 집게 한 쌍, 오라 세라로 분리 된 망막 조직 주변의 가장자리를 잡고 미세 집게의 또 다른 쌍 오라 세라를 잡아, 망막의 중심을 향해 당겨. 이 과정은 정교한 절차이며 몇 가지 시도 걸릴 수 있습니다. 성공하면 ORA 참나무, 모양체 및 유리체 유머는이 프로세스에 의해 제거되고 망막의 곡률 (즉, 아첨) 감소된다. </li><li> 가장자리를 트리밍하고 당에 전송위로 향 신경절 세포와 융합 챔버. 그리스 공에 그리드를 배치하여 장소에 조직을 누릅니다. 나중에 사용하기 위해 다른 아이 컵과 나머지 조직을 놓습니다. 망막 박리에 대한 유사한 절차 미들과 Protti 16 Pottek 등으로 설명되어 있습니다. 17. </li><li> 직립 현미경으로 녹음 챔버를 장착합니다. 5 ML / 분 - 즉시 3의 비율 carboxygenated 세포 용액 (35.5 ° C)와 망막의 지속적인 관류를 설정합니다. 접지 전극이 제자리에 있는지 확인하십시오. </li><li> 현미경에 부착하면 조직의 시각화를 허용하는 디지털 카메라입니다. 전체 세트는 최대 공기 테이블 (충격 흡수) 이상과 패러데이 케이지 (블록 외부 정적 및 비 정적 전기 분야) 내부에 앉아있다. </li><li> 광원 (적외선,&gt; 850 nm의)와 40X 목적으로 켜고, 신경절 세포의 세포 기관에 초점을 가져온다. 녹화기에 대한 전체 마운트의 중심 지역 찾기땡. </li><li> 제상 K의 고정 된 유리 병 + 기반의 세포 내 용액 (300 μL, pH가 = 7.4) 포함 (단위 : mm) K-글루코 : 140, HEPES 산 : 10, MgCl 2 4.6 ATP-나 + 4, GTP-나 + : 0.4 EGTA : 10. 모든 시약은 시그마 - 알드리치에서 구입했습니다. </li></ol> 2. 망막 신경절 세포의 패치 세포 기관 <ol><li> 먼저 불이 붕규산 유리 모세관 튜브의 끝을 연마 한 후 두 개의 가열 단계 (- MΩ 8 5 저항)와 유리 미세 전극 풀러와 함께 그들을 잡아 당깁니다. </li><li> 세포 내 용액에 루시퍼 노란색의 3 μL (최종 농도 0.2 %)를 추가, 잘 혼합하고 원심 분리기. 다음으로, 30 G 재사용 피하 주사 바늘을 ​​한 후, 1 ML의 주사기로 솔루션의 최고 85 %를 전송할 0.22 μm의 F 조 ilter 장치에 연결합니다. 냉장. </li><li> 홀더에서 레코딩에 사용되는 것과 유사한 팁 크기, 유리 피펫을 수정하고 micromanipula를 사용하여 현미경 아래로 이동토르. 그것은 내 경계 막 표면에 작은 보조개를 할 때까지 40X 목표 아래, 천천히 피펫을 낮 춥니 다. 그것은 조직의 작은 금액을 잡는다까지 천천히 피펫을 진행하고 신경절 세포의 세포 기관을 노출하는 작은 구멍을 찢어 위로 및 / 또는 옆으로 이동합니다. 작은 구멍, 이상이 망막 네트워크의 무결성 수준이 유지됩니다. 원하는 경우, sulforhodamine 101 (SR101, 0.5-1 μM) 형광 현미경에 15을 사용하여 손상된 신경 레이블을 세포 매체에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 세포 내 용액 10 μL - 8로 깨끗한 피펫을 입력합니다. 앰프의 머리 스테이지에 부착 된 홀더에 삽입하고 염소화 실버 염화물 전극이 침수되어 있는지 확인합니다. 만약 먼지 및 / 또는 공기 거품은 / 존재 버린다. </li><li> 모든 장비를 켭니다. 우리는 전압 클램프 사기꾼에서 전체 셀 녹음을 달성하기 위해 PatchMaster에 의해 통제 EPC 8 패치 클램프 증폭기를 사용하여형상. 고속 모드에서 전류 클램프 녹음 할 수 있도록 다른 앰프도 사용할 수 있습니다. 피펫 용액에 긍정적 인 압력을 적용하고 유지합니다. 오히려 난민 무 축삭 세포 또는 아교 세포보다 신경절 세포 그래서 가장 가능성이 큰 세포체와 셀을 선택합니다. 천천히가 막 표면에 작은 보조개를 만드는, 그래서 피펫 팁을 낮출 중지하고 압력을 놓습니다. 60 MV - 즉시에 개최 가능성을 낮 춥니 다. gigaseal (GΩ)가 그들 사이에 달성되면, 조심스럽게 전체 세포 패치 클램프 구성을 달성하기 위해 멤브레인을 깰 빨아. 이 절차는 너무 많은 부정적인 압력이 적용되는 경우, 연결이 새는되고 섬세한 작업이며 너무 작은 경우, 멤브레인이 그대로 유지됩니다. </li><li> 시간이 지남에, 루시퍼 노란색은 세포의 형태를 시각화 수 있도록 셀을 채울 것입니다. 안정되어있는 경우,이 설정 최대 30 분 이상 지속해야한다. </li></ol> 3. Dynami를 사용하여 신경절 세포의 기록C 클램프 <ol><li> 첫째, 전류 - 전압 테스트 (에서 - 75 + 35 MV 매 10 mV 범위)이 PatchMaster를 사용하여 실행됩니다. 큰 나는 + 전류 (&gt; 1 NA)있는 경우에만 나중에 시험을 진행합니다. 난민 무 축삭 세포가 패치 드문 경우에, 그 경우, 이후 현재 주사 행동 잠재력의 기차에 응답하지 않습니다 유의하십시오. </li><li> 오픈 LabVIEW와 사용자 정의 서면 Neuroakuma 프로그램을 실행 다음, 다양한 전도 파형을로드합니다. 8 (- 8 통계적 목적을 위해 6)을 반복 번호를 설정합니다. 각각 75 MV - 0에서 흥분성과 억제 컨덕턴스의 반전 잠재력을 설정합니다. 테스트 흥분성과 억제 컨덕턴스 중 하나와 일치하는 쌍을 선택합니다. 흥분성 전도성 트레이스 (녹색) 및 억제 전도성 트레이스 (빨간색) 하단 패널에 표시됩니다. </li><li> 다시 PatchMaster로 이동 현재 클램프 모드를 선택, 바로 &#39;CC + 통신 FAST&#39;현재 클램프 모드로 앰프를 전환합니다. 이 모드는 ACC 할 수 있습니다urately 막 전위의 급격한 변화를 따릅니다. 막과 피펫 사이 좋은 물개가 유지되는 경우, 거의 / 전혀 보정이 필요하지 않습니다, 그렇지 않으면 녹음이 오래 지속되지 않습니다. Neuroakuma에서 &quot;레코드&quot;버튼을 누릅니다. 세포 반응은 (일반적으로 행동 잠재력의 phasic 버스트 그림 1A)와 상단 패널에 나타납니다. 작은 / 응답이 관찰되지 않는 경우가 강한 응답을 생성 할 때까지 작은 단위로 증가, 처음 컨덕턴스 낮은 스케일링 셀에 전류를 주입. 과도한 전류가 주입 세포를 죽일 수 있습니다. 일단 테스트가 완료되어, 전도성 파형의 새로운 쌍을 선택 생리적, 인공 컨덕턴스의 모든 쌍 이상 반복합니다. 실시간으로 주입 생리 전류 (I)를 기반으로합니다 : I (t) = G 당일 (T) × (V m (T) - V 당일) + G INH (T) × (V m (T) - V INH) </li></ol> 컨덕턴스 (NS에서 G) 싸이가 될 수naptic 또는 인공. 흥분성과 억제 성 시냅스 전도 파형 (TTX, 1 μM) 제어 상태에서 다른 시각적 자극에 반응하고 테트로도톡신의 존재 Protti, 디 마르코, 황, Vonhoff, 구엔과 솔로몬 (미발표 결과)에 의해 수행 이전의 실험에서 수집 된 . 인공 전도 파형은 알파 기능을 사용하여 모델링 하였다. V m은 (MV)에 기록 막 잠재력이다. V EXC와 V INH는 각각 흥분성과 억제 컨덕턴스의 반전 가능성을 나타내는 반면 G EXC와 G INH는 각각 흥분성과 억제 컨덕턴스를 나타냅니다. 시간은 밀리 t이다. 샘플링 속도가 40 kHz입니다. I S = I 0 (t / α) E-αT 위의 방정식은 알파 기능 (, 전류의 피크 1 / α = 시간 (초 -1) I 0 = 최대 전류)입니다. 상승 시간과 시냅스의 감쇠 시간현재는 α 4에 의해 결정됩니다. 억제 전도의 지연이 여기의 시작 (그림 2D)를 기준으로 지연을 감소 바뀌 었습니다 동안 흥분 전도는 불변이었다. <ol start="4"><li> 세포의 몸이 그대로 유지되도록 녹음 한 후, 조심스럽게 피펫을 철회. 즉시 인산염 완충액 0.1 M 세 10 분 세척 한 다음 30 분에 대한 4 % 파라 포름 알데히드의 조직을 고정합니다. 냉동 다음과 같은 일 또는 주 이내에 염색 항체를 수행합니다. </li></ol> 4. 루시퍼 노란색 채워진 망막 신경절 세포에 대하여 항체 염색 <ol><li> 차 염소 안티 - 토끼 IgG를 (희석 = 1:500로 여섯 번째 날에, 하룻밤 염색, 상온에서 루시퍼 노란색 가득 신경절 세포 (5 일 기본 안티 - 루시퍼 노란색 토끼 IgG를 (희석 = 1:10,000)에 대한 항체 염색 )). 형광 보존 매체에 망막을 탑재 젖은. 손톱 P와 함께 미끄러 인감 커버olish. </li><li> 라이카 사양-II 공 촛점 현미경 (그림 1B)를 사용하여 세포 형태의 공 초점 사진을 촬영합니다. 축삭의 존재는 신경절 세포의 확인을 할 수 있습니다. </li></ol>

<ol>
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C., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+GFP-expressing+cell+populations+in+the+intact+retina.">Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina.</a> J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).</li></ol>

모든 절차는 먼저 시드니 대학의 동물 관리 윤리위원회의 승인을, 그리고 과학적인 목적을위한 동물의 관리 및 사용을위한 실천 호주 코드의 지침 (국민 건강과 호주의 의학 연구위원회에 따라 수행 하였다 ).

여기에서 우리는 비와 여기와 망막 신경절 세포의 출력 억제의 상대적 타이밍의 영향을 평가하는 동적 클램프의 사용을 보여줍니다. 동적 클램프는 살아있는 신경 세포에 생리 학적 기록 또는 인공 시냅스 컨덕턴스를 소개하는 컴퓨터 시뮬레이션을 사용합니다. 이 방법은 컨덕턴스가 수정 및 신경 반응에 미치는 영향을 계산하는 신경 세포에 주입 할 수있는 대화 형 도구를 제공합니다. 전도 파?...

망막은 안구의 뒤쪽을 안감에 가까운 투명한 신경 조직이다. 많은 연구는 첫 번째 영상 처리 단계와 시냅스 신호 전달 메커니즘을 조사하기 위해 모델로 망막을 사용합니다. 전체 마운트 준비 망막 네트워크 절개 후 그대로 남아 있기 때문에, 그것의 생리적 반응은 생체 내 조건에서 매우 유사로 시냅스 상호 작용을 연구하는 이상적인 시스템을 나타냅니다. 따라서, 그 뉴런의 속성이 패치 클램프 기술 (테크닉에 대한 리뷰를 들면, 6,9,13 참조)를 사용하여 연구 할 수있는 격리 된 망막을 사용하여. 약물 에이전트가 여러 사이트에 행동으로 특정 회로와 신경절 세포 반응에 신경 전달 물질의 정확한 공헌의 확인은, 그러나, 일반적으로 방해합니다. 빛에 망막 신경 세포의 생리적 반응, 자연 자극, 세포 내 액체로 가득 유리 피펫과 함께 기록 할 수 있습니다. 패치 CL을 사용하여앰프 기술, 빛의 자극에 신경 반응은 막 전위 변동 (현재 클램프) 또는 전류 (전압 클램프)로 기록 할 수 있습니다. 다른 전압에서 막 잠재력을 보유하고 사후 전도성 분석을 구현하여, 그것을 억제 및 흥분성 시냅스 입력하기 5,12를 분리 할 수 있습니다. 실험의이 유형은 일반 목욕 ​​중간에 다른 신경 전달 물질과 신경 반응에 대한 수용체의 기여를 분리하는 다른 약물 에이전트의 존재에서 수행 할 수 있습니다. 많은 실험실에서 연구의 풍부한 급상승 출력과 자극의 크기와 같은 속성, 명암, 공간과 시간적 주파수, 방향, 방향 및 기타 자극 변수에 대한 흥분성과 억제의 입력 의존도를 특징. 이 실험 방법은 스파이크 출력과 자극 특성의 함수로서 시냅스 입력 사이의 관계에 대한 정보를 제공하지만은,세포의 흥분에 특정 세포 유형과 시냅스 입력의 기여의 해석은 간단하지 않습니다. 이는 일반적으로 흥분성과 억제를 모두 입력이 자극 특성에 따라 다양하기 때문에, 그것은 이러한 입력 중 하나의 변화가 신경 세포의 스파이크에 미치는 정확한 영향을 평가하는 것은 불가능하기 때문이다. 이러한 제한을 우회 할 수있는 다른 방법은 출력을 급상승 개별 시냅스 입력의 공헌의 중요한 평가를 허용 동적 클램프 레코딩을 수행하는 것입니다. 동적 클램프 기법은 셀에 전류를 직접 주입 할 수 있으며 주어진 시간에 전류 주입의 양이 그 시간 1,2,3 (검토를 위해, 7,14 참조)에 기록 된 막 잠재력에 따라 달라집니다. 그것은 수정 된 전류 클램프 셋업입니다 녹음 아래 셀 특수 하드웨어를 구성하는 장비, 소프트웨어 사이의 실시간, 빠른 피드백의 상호 작용그리고 컴퓨터가 달성된다. 셀에 전류 주입의 양이 따라 계산됩니다. 따라서,이 방법의 장점은 셀이 전도 파형의 다른 조합으로 자극 할 수 있고, 그 반응은 시냅스 입력을 중재하는 수용체의 활성화를 모방하는 것입니다. 예를 들어, 작은 장소에 대한 흥분 전도의 주입에 대한 응답과 작은 스폿 흥분성과 억제 컨덕턴스의 주입 반응의 비교는 세포 반응에 대한 억제의 영향에 대한 정보를 제공합니다. 마찬가지로, 생리 학적 기록 컨덕턴스의 다른 조합은 스파이크 출력에 영향을주는 방법에 자극 따라 흥분성 및 / 또는 억제 컨덕턴스의 변화에​​ 공개하는 공동 주입 할 수 있습니다. 본 연구에서는 동적 클램프 기술은 상대적으로 진폭과 망막 신경절 세포의 발화 특성에 시냅스 입력 타이밍의 영향을 설명하는 데 사용됩니다. 다양한 컨덕턴스제어 상태 또는 약물 에이전트의 존재 생리 실험에서 얻은 입력으로 고용되었다. 또한, 알파 기능에 따라 인공 컨덕턴스는 시냅스 입력이 뉴런으로 통합하는 방법을 조사하기 위해 사용되었다. 따라서이 전도의 다양한 종류가 약리학이나 계산 같은 신경절 세포에 주입하는, 어느 생리적 생성이 입력에 대한 응답이 너무 비교가 될 수 있도록하는 다양한 기술입니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Inhalation Anaesthetic</td>
			<td>Pharmachem</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ames Medium with L-Glutamate (Powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Gluconate, Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution (4.9 mol/l)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Powder, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Preserving Media</td>
			<td>BioFX Laboratories Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm)</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0794</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Stage Glass Microelectrode Puller</td>
			<td>Narishinge Japan</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipuls 2</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV 0.22 &mu;m Filter Unit</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G</td>
			<td>Smith &amp; Nephew (Australia)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Inline Solution Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Model SH-27B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Automatic Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-344B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Stereomicroscope SZ61</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0-30 V 2.5 A DC Power Supply</td>
			<td>Dick Smith Electronics</td>
			<td>Q1770</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Microscopic Camera ProgResMF cool</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator MP-225</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch Clamp Amplifier EPC 8</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System</td>
			<td>HEKA Elektronik</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer: DELL</td>
			<td>Dell Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementing dynamic clamp with synaptic and artificial conductances in mouse retinal ganglion cells

신경절 세포는 망막의 출력 뉴런하고 그들의 활동은 특정 신경 회로에서 발생하는 여러 시냅스 입력의 통합을 반영합니다. 전압 클램프 전류 클램프 구성에서 패치 클램프 기술은, 일반적으로 신경 세포의 생리적 특성을 연구하고, 자신의 시냅스 입력을 특성화하는 데 사용됩니다. 이러한 기술의 응용 프로그램이 매우 유익하지만, 그들은 여러 가지 한계를 포즈. 예를 들어, 흥분성과 억제 입력의 정확한 상호 작용이 응답 출력을 결정하는 방법 정량화하기가 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 또한 전도 클램프 1, 2, 3이라는 수정 된 전류 클램프 기법, 동적 클램프를 사용하고 신경 세포의 흥분에 흥분성과 억제 시냅스 입력의 영향을 조사 하였다. 이 기술은 셀에 현재의 주입을 필요로 그 당시의 막 잠재력의 실시간 피드백에 따라 달라집니다. injecteD 전류가 소정의 흥분성과 억제 시냅스 컨덕턴스, 자신의 반전 잠재력과 세포의 순간 막 잠재력에서 계산됩니다. 실험 절차에 대한 자세한 내용은, 동적 클램프 기법의 전체 셀 구성과 고용을 달성하기 위해 세포를 클램핑 패치는이 비디오 문서에서 설명된다. 여기, 우리는 통제 조건이나 약물의 존재 생리 실험에서 얻은 다양한 전도 파형 마우스 망막 신경절 세포의 반응을 보여줍니다. 또한, 우리는 세포의 반응을 조사하기 위해 알파 함수를 사용하여 생성 된 인공 흥분성과 억제 컨덕턴스의 사용을 보여줍니다.

신경절 세포 반응을 억제 입력의 다른 소스의 기여도는 다양한 전도 파형의 응용 프로그램을 통해 설명된다. 이 파형은 정상 조건에서 차단 동작 만 억제 망막의 interneurons의 일부 잠재적 인 세대. 그림 2A는 주입에 대한 대표적인 반응을 보여주는 TTX, 전압 게이트 나 + 채널 차단제의 면전에서 서로 다른 밝기의 자극으로 하였다 흥분성과 억제 전도 파형은 정상 상태에서 회색 ...

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Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

이 비디오 문서에서는 세포 기관을 패치하는 셋업 절차 및 방법 전체 마운트 마우스 망막의 신경절 세포에서 동적 클램프 레코딩을 구현하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 흥분성과 억제 시냅스 입력의 정확한 기여도 조사 및 신경 스파이크에 대한 상대적인 크기와 타이밍을 할 수 있습니다.

마우스 망막 신경절 세포의 시냅스와 인공 컨덕턴스와 동적 클램프 구현

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K 조회수.  University of Sydney. 이 비디오 문서에서는 세포 기관을 패치하는 셋업 절차 및 방법 전체 마운트 마우스 망막의 신경절 세포에서 동적 클램프 레코딩을 구현하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 흥분성과 억제 시냅스 입력의 정확한 기여도 조사 및 신경 스파이크에 대한 상대적인 크기와 타이밍을 할 수 있습니다.

비디오: Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

연구

신경과학

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

형광 염료와 성인 Zebrafish의 망막 신경절 세포의 퇴행성 라벨링

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

광학 일관성 단층 촬영: 마우스 망막 신경 절 세포에서 Vivo에서 화상 진 찰

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic multiplicity). Synaptic multiplicity is plastic and changes throughout development and in different physiological conditions, being an important determinant for the efficacy of synaptic transmission. Here, we outline experiments for estimating the degree of multiplicity of synapses terminating onto a given postsynaptic neuron using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices. Specifically, voltage-clamp recording is used to compare the difference between the amplitude of spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSCs) and miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). The theory behind this method is that afferent inputs that exhibit multiplicity will show large, action potential-dependent sEPSCs due to the synchronous release that occurs at each synaptic contact. In contrast, action potential-independent release (which is asynchronous) will generate smaller amplitude mEPSCs. This article outlines a set of experiments and analyses to characterize the existence of synaptic multiplicity and discusses the requirements and limitations of the technique. This technique can be applied to investigate how different behavioral, pharmacological or environmental interventions in vivo affect the organization of synaptic contacts in different brain areas.

Here, we present a protocol for evaluating the functional synaptic multiplicity using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices.

전기 생리학 전체 셀 패치 클램프를 사용 하 여 시 냅 스 다양성의 평가

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

망막 신경절 세포 연구를 위한 마우스 망막 분리 및 메탄올 치료

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

저자 스포트라이트: 망막 신경절 세포 연구를 위한 메탄올 기반 전체 장착 준비  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

망막 신경절 세포 조사를 위한 메탄올 기반 전체 마운트 준비

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...