이 작업은 후베이 핵심 연구소 개설 프로젝트(보조금 번호 2021KFY055), 후베이성 자연 과학 재단(보조금 번호 2020CFB240) 및 중앙 대학 기초 연구 기금(보조금 번호 2042020kf0065)의 지원을 받았습니다.

모든 단계는 달리 지시되지 않는 한 실온에서 수행됩니다. 사용된 모든 C57BL/6J 마우스는 우한대학교 동물실험센터에서 입수하였으며, 모든 관련 실험은 우한대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받았다. 생쥐의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
1. 눈의 적출 및 고정
<ol><li>생쥐를 이산화탄소 질식으로 안락사시키고 이빨이 없는 핀셋을 사용하여 안구를 부드럽게 적출합니다.</li>
	<li>인산염 완충 식염수(PBS)로 안구를 한 번 헹굽니다.</li>
	<li>현미경으로 각막에 주사기 바늘로 안구를 뚫습니다(접안렌즈 WF: 10x/22, 연속 배율 대물렌즈: 0.67x-4.5x) 안구로의 고정을 가속화하고 고정 효율을 향상시킵니다.</li>
	<li>4% 파라포름알데히드(PFA)를 함유한 24웰 플레이트로 옮깁니다.</li>
	<li>안구를 4% PFA에 45분 동안 고정한 다음 1x PBS로 옮겨 과잉 PFA를 즉시 제거합니다(3회 세척, 5분/회).</li>
</ol>2. 망막 분리 및 평탄화
<ol><li>안구를 유리 슬라이드로 옮기고 해부 현미경(접안렌즈 WF: 10x/22, 연속 배율 대물렌즈: 0.67x-4.5x) 아래에 놓습니다.</li>
	<li>한 손으로 집게를 잡고 각막의 가장자리를 고정하여 안구 움직임을 방지합니다. 다른 손으로 해부 가위를 잡고 각막 공막 윤부를 통해 약 1mm 깊이의 각막 주위를 자릅니다. 수정체와 유리체를 제거합니다.</li>
	<li>시신경을 중앙에 놓고 해부 가위를 사용하여 4 개의 사분면을 따라 방사상으로 망막을 절단하여 망막 반경의 약 2/3에 도달합니다.</li>
	<li>톱니 집게를 사용하여 공막 가장자리 중 하나를 클램프하십시오. 다른 손으로 톱니가 없는 집게로 공막의 가장자리를 잡고 공막이 톱니가 있는 집게에 의해 고정되는 곳에서 공막 바닥으로 이동합니다. 망막을 조심스럽게 껍질을 벗기십시오.</li>
	<li>피펫(200 μL)을 사용하여 PBS를 빼내어 망막을 플러시하고 적신 다음 작은 흡수성 종이로 과도한 PBS를 제거합니다. 필요한 경우 작은 강모 브러시로 망막을 부드럽게 평평하게 만듭니다.</li>
	<li>차가운 메탄올(-20°C 냉동고에서 예냉)을 망막 내부 표면에 한 방울씩 천천히 피펫팅합니다(망막이 메탄올로 완전히 덮일 수 있는 한 메탄올의 부피는 고정되지 않음). 망막이 하얗게 변하고 끈기가 증가합니다.</li>
	<li>망막을 부드럽게 평평하게하고 작은 강모 브러시로 잔류 색소 막과 유리체와 같은 불순물을 제거합니다. 작은 강모 브러시를 사용하여 망막을 뒤집고 위에서 언급 한 과정을 반복하십시오.</li>
	<li>메탄올-처리된 망막을 24-웰 플레이트의 웰로 옮기고, 메탄올에 담근 상태로 유지한다.</li>
	<li>즉각적인 면역 염색을 위해 -20°C에서 1-2시간 동안 보관하거나 망막을 메탄올에 그대로 두고 장기 보관을 위해 -20°C에서 보관하십시오.</li>
	<li>24-웰 플레이트로부터 메탄올을 제거하고, 망막을 1x PBS로 헹구었다.</li>
</ol>3. RGC의 면역형광 염색
<ol><li>망막을 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 24웰 혈구 응집 플레이트로 조심스럽게 옮기고, 5% PBS-TX-BSA (1x PBST 용액 100mL에 용해된 소 혈청 알부민 분말 5g; PBST는 1 x PBS 2,000mL에 Triton X-100 10mL를 첨가하여 형성됨)를 실온에서 4시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 차단합니다. 신경절 쪽을 위로 유지하십시오.</li>
	<li>PBS-TX-BSA를 제거하고, 1:400 희석액을 사용하여 선택된 1차 항체(기니피그 항-RBPMS 항체) 100 μL를 첨가하여 4°C에서 48-96시간 동안 망막을 배양합니다.</li>
	<li>1차 항체를 제거하고, 실온에서 진탕하면서 1x PBS로 망막을 3회(각각 20분) 헹구었다.</li>
	<li>1:400 희석액을 사용하여 해당 2차 항체( 재료 표 참조), 시아닌 Cy3 affiniPure 당나귀 항기니피그 IgG(H+L)와 함께 4°C에서 밤새 부드럽게 흔들면서 망막을 배양합니다.</li>
	<li>1x PBS로 망막을 세 번(각 20분) 헹굽니다.</li>
	<li>신경절 세포층이 위를 향하도록 슬라이드에 망막을 평평하게 놓고 피펫으로 망막 주위에 적절한 양의 형광 소광제를 떨어뜨린 다음 슬라이드를 커버슬립으로 덮습니다(기포가 생기지 않도록 주의). 알림: 적절한 양의 항형광 소광제를 결정하려면 전체 망막을 덮고 있는지 확인하십시오. 그런 다음 망막이 뜨지 않고 슬라이드를 덮고 쉽게 움직입니다.</li>
	<li>슬라이드가 움직이지 않도록 밀봉제로 슬라이드 전체를 밀봉하십시오. 샘플을 -20°C에서 보관하고 빛으로부터 보호하십시오.</li>
	<li>형광/컨포칼 현미경을 사용하여 망막을 이미지화합니다.</li>
</ol>

망막 신경절 세포 연구를 위한 마우스 망막 분리 및 메탄올 치료

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+types+of+retinal+ganglion+cells:+Current+status+and+implications+for+neuronal+classification.">The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li><li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma.">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).</li><li>Au, N. P. B., Ma, C. H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation,+microglia+and+implications+for+retinal+ganglion+cell+survival+and+axon+regeneration+in+traumatic+optic+neuropathy.">Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy.</a> Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).</li><li>Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cells+resistant+to+advanced+glaucoma:+A+postmortem+study+of+human+retinas+with+the+carbocyanine+dye+DiI.">Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).</li><li>Vidal-Sanz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+glaucomatous+damage:+anatomical+and+functional+data+from+ocular+hypertensive+rodent+retinas.">Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).</li><li>Kole, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+(ATF3)+protects+retinal+ganglion+cells+and+promotes+functional+preservation+after+optic+nerve+crush.">Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 61 (2), 31 (2020).</li><li>Nadal-Nicol&#225;s, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells:+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas.">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).</li><li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+protein+with+multiple+splicing:+A+new+marker+for+retinal+ganglion+cells.">RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li><li>Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+strategies+for+retinal+immunohistochemistry.">Fixation strategies for retinal immunohistochemistry.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).</li><li>Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moniliform+deformation+of+retinal+ganglion+cells+by+formaldehyde-based+fixatives.">Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).</li><li>Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pfl&#252;ger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+methods+for+three-dimensional+reconstructions+from+confocal+images:+I.+Tissue+shrinking+and+axial+scaling.">Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).</li><li>Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+wide-ranging+panel+of+antigens+in+the+rat+retina+by+immunohistochemistry:+Comparison+of+Davidson's+solution+and+formalin+as+fixatives.">Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+A+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+fixation+of+the+whole+bodies+of+fish+by+a+double-fixation+method+with+formalin+solution+and+Bouin's+fluid+or+Davidson's+fluid.">Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).</li><li>Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+commercial+and+three+home-made+fixatives+for+the+substitution+of+formalin:+A+formaldehyde-free+laboratory+is+possible.">Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible.</a> Environmental Health. 11, 59 (2012).</li><li>Tang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+visualize+the+goblet+cell-associated+antigen+passages+and+identify+goblet+cells+in+the+intestine,+conjunctiva,+and+airway.">An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway.</a> Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).</li><li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li><li>Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+post-fixation+on+visualising+vimentin+in+the+retina+using+immunofluorescence+method.">The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method.</a> Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization.">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li><li>Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+methanol+to+preserve+retinas+for+immunostaining.">Using methanol to preserve retinas for immunostaining.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).</li><li>Kalesnykas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cell+morphology+after+optic+nerve+crush+and+experimental+glaucoma.">Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).</li><li>Parrilla-Reverter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-course+of+the+retinal+nerve+fibre+layer+degeneration+after+complete+intra-orbital+optic+nerve+transection+or+crush:+a+comparative+study.">Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study.</a> Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).</li></ol>

저자는 이 연구의 객관성에 영향을 미칠 수 있는 소속, 회원 자격, 자금 또는 재정 보유에 대해 알지 못합니다.

고정은 망막을 보존하기 위한 필수 단계이며, 이는 형태학을 기반으로 한 후속 RGC 조사에 영향을 미칠 수 있습니다. 성공적인 고정은 망막을 고정 매체에 노출시키는 순간 망막의 구조와 상태를 빠르게 포착하며, 이는 추가 분석에 중요합니다. 포름 알데히드는 조직 및 세포 고정 및 보존을위한 가장 일반적인 고정제 중 하나로 간주되어 왔지만, 포름 알데히드만으로는 일부 조사에서 최적의 화학...

망막 신경절 세포(Retinal ganglion cell, RGC)는 망막에 있는 유일한 투영 뉴런으로, 외부 시각 정보를 통합하여 뇌에 전달한다1. 녹내장 및 외상성 시신경병증과 같은 많은 신경퇴행성 질환은 비가역적 손상과 RGC의 손실을 특징으로 한다 2,3. RGC의 형태학적 및 정량적 변화를 분석하는 것은 신경퇴행성 질환이 어떻게 발생하고 진행되는지를 결정하는 중요한 단계입니다 4,5.
간접 면역형광 분석은 단백질 분포 및 세포 계수를 모니터링하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 실험실에서 망막의 생리학적 및 병리학적 상태를 평가하기 위해 RGC에 대한 실험적 연구에서 전체 마운트 망막 면역염색법이 일반적으로 사용됩니다6. 전체 망막에서 RGC 정량화에 사용되는 가장 일반적인 마커는 Brn3a, 다중 스플라이싱을 갖는 RNA 결합 단백질(RBPMS) 등을 포함합니다 7,8. RGC의 양과 분포를 특성화하려면 고품질의 전체 마운트 망막 면역염색이 필요합니다. 일반적으로, 면역염색 프로토콜에서, 망막은 항체에서 배양되기 전에 화학적 고정제에 담근다. 이상적인 고정제는 세포의 모양, 항체에 대한 에피토프의 접근성 또는 친화도, 또는 조직의 선형 치수를 변화시키지 않아야 한다 9,10.
망막의 복잡한 구조로 인해 망막의 취약성 및 접힘과 같은 문제뿐만 아니라 세포 수축 및 불분명한 핵을 포함한 몇 가지 일반적인 어려움이 전체 마운트 망막 패치를 만들 때 발생하기 쉬우며 이는 실험 연구에 부정적인 영향을 미칩니다. 또한, 모든 망막이 즉시 면역염색되는 것은 아니며, 특히 귀중한 기원의 값비싼 가격을 가진 형질전환 마우스의 망막의 경우 추가 사용을 위해 여분의 망막 샘플을 보존해야 합니다.
적절한 고정액은 조직을 신속하게 고정하고, 조직 자가분해를 피하고, 조직 세포의 정상적인 형태와 구조를 보존하고, 단백질 및 기타 물질의 항원성을 유지할 수 있다10. 현재, 포름알데히드계 고정술은 분리된 망막, 반절제된 안구, 안구 전체를 포함한 다양한 조직에서 널리 사용되고 있다10. 조직 수축과 세포의 형태학적 변화는 포름알데히드에 담근 후 직면하게 되는 두 가지 중요한 문제이다11. 또한, 망막 및 표적 세포의 본래 특성의 보유를 최대화하기 위해 변형된 고정 제형이 점점 더 등장하고 있다 9,10. 다른 망막 고정 치료는 망막 구조, 단백질 면역원성, 형광 여기 및 감쇠 소멸 주기에 다르게 영향을 미칠 수 있습니다12,13. 데이비슨 용액으로 고정된 망막은 포르말린으로 고정된 망막에 비해 형태학적으로 더 온전하지만, 데이비슨 용액은 소교세포 마커-이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 112와 같은 일부 항체와의 호환성이 떨어진다. 망막의 깨지기 쉬운 특성을 고려할 때 연구자들은 망막 무결성과 표적 세포의 특성 및 형태가 장기 보관 후에 변할지 여부를 자연스럽게 궁금해할 것입니다. 그러나 수개월 보관 후 망막 및 RGC 세포 형태에 대한 고정 용액의 가능한 효과는 거의 보고되지 않았습니다. 망막 고정의 최적화는 RGC의 평가 및 보존에 중요합니다.
우리는 전체 마운트 쥐 망막 염색에 사용하는 신뢰할 수 있고 기술적으로 간단한 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 우리의 방법은 망막 조직의 장기 보관의 필요성과 형광단 형성 또는 분해의 특정 측면을 고려하여 RGC 조사를 위한 망막의 적절한 준비 및 보관을 강조합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well cell culture cluster</td>
			<td>Costar</td>
			<td></td>
			<td>Eyeball fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well hemagglutination plate</td>
			<td>Labedit Company</td>
			<td></td>
			<td>Incubation antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>Citotest</td>
			<td></td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescent quenching mountant</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G1401</td>
			<td>Slow down fluorescence quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>GC305010</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td></td>
			<td>Apply 40x objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>RWD Life science Co.,LTD&#160;</td>
			<td>77001S</td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>20210624</td>
			<td>GC&#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>SecheVite</td>
			<td></td>
			<td>Sealing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles&#160;</td>
			<td>Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Accelerate the fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G1101</td>
			<td>Eyeball fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G0002</td>
			<td>Rinse the eyeball&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)</td>
			<td>PhosphoSolutions</td>
			<td>Cat. #1832-RBPMS</td>
			<td>For immunofluorescence. Used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>706-165-148</td>
			<td>For immunofluorescence. Used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight scissors</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells

망막의 투영 뉴런인 망막 신경절 세포(RGC)는 외부 시각 정보를 뇌로 전파합니다. RGC의 병리학 적 변화는 수많은 망막 퇴행성 질환과 밀접한 관련이 있습니다. 전체 마운트 망막 면역염색은 망막의 발달 및 병리학적 상태를 평가하기 위해 RGC에 대한 실험적 연구에서 자주 사용됩니다. 어떤 상황에서는 형질전환 마우스의 샘플과 같은 일부 귀중한 망막 샘플을 RGC의 형태나 수에 영향을 미치지 않고 장기간 보관해야 할 수도 있습니다. 신뢰할 수 있고 재현 가능한 실험 결과를 위해서는 효과적인 보존 배지를 사용하는 것이 필수적입니다. 여기에서 우리는 망막 전체 장착 준비 및 장기 보관을 위한 보조 고정 배지로서의 메탄올의 효과를 설명합니다. 간단히 말해서, 분리 과정에서 차가운 메탄올(-20°C)을 망막 표면에 피펫팅하여 조직을 고정하고 투과성을 촉진한 다음 망막을 면역염색하기 전에 차가운 메탄올(-20°C)에 보관할 수 있습니다. 이 프로토콜은 RGC 조사에 유용하고 실용적인 망막 분리 워크플로 및 조직 샘플 보관 프로토콜을 설명합니다.

Retinal ganglion cells (RGCs) are the only projection neurons in the retina, and they integrate and transmit outside visual information to the brain1. Many neurodegenerative diseases such as glaucoma and traumatic optic neuropathy are characterized by irreversible damage and loss of RGCs2,3. Analyzing the morphological and quantitative changes of RGCs is a crucial step in determining how neurodegenerative diseases develop and advance4,5.
Indirect immunofluorescence assay is a widely accepted method to monitor the distribution of proteins and cell counting. In the laboratory, whole-mount retinal immunostaining is commonly used in experimental studies on RGCs to evaluate the physiological and pathological conditions of the retina6. The most common markers used for RGC quantification in the whole retina include Brn3a, RNA binding protein with multiple splicing (RBPMS), and so on7,8. Characterizing the amount and distribution of RGCs requires high-quality whole-mount retinal immunostaining. Generally, in immunostaining protocols, the retina is immersed in chemical fixatives before being incubated in antibodies. Ideal fixatives should not change the shape of cells, the accessibility or affinity of the epitopes for antibodies, or the linear dimensions of the tissue9,10. 
Due to the complex structure of the retina, problems such as retinal fragility and folding, as well as some common difficulties including cell shrinkage and unclear nuclei, are prone to occur when making a whole-mount retinal patch, which has a negative impact on experimental research. In addition, not all retinas are immunostained immediately, especially when it comes to the retinas of transgenic mice with expensive prices that are of precious origin, necessitating the preservation of the extra retinal samples for further use.
The appropriate fixative solution can fix the tissue quickly, avoid tissue autolysis, preserve the normal morphology and structure of the tissue cells, and keep the antigenicity of proteins and other substances10. At present, formaldehyde-based fixation has been widely used in various tissues, including separated retinas, hemisected eyecups, and whole eyeballs10. Tissue shrinkage and the morphological alteration of cells are the two critical challenges encountered following immersion in formaldehyde11. In addition, modified fixation formulations are increasingly emerging to maximize the retention of the original properties of the retina and the target cells9,10. Different retinal fixation treatments may affect the retinal structure, protein immunogenicity, fluorescence excitation , and attenuation quenching cycle differently12,13. Retinas fixed with Davidson's solution are more morphologically intact compared to those fixed with formalin, but Davidson's solution is less compatible with some antibodies, such as microglial marker-ionized calcium binding adaptor molecule 112. Considering the fragile nature of retinas, researchers would naturally wonder whether the retinal integrity, as well as the properties and morphology of the target cells, will change after long-term storage. However, the possible effects of fixation solution on retinal and RGC cell morphology after storage for several months have rarely been reported. The optimization of retinal fixation is critical for the evaluation and preservation of RGCs. 
We provide a detailed description of a reliable and technically straightforward method that we use for whole-mount murine retinal staining. Our method emphasizes the proper preparation and storage of retinas for RGC investigation, taking into account the need for the long-term storage of retinal tissue as well as specific aspects of fluorophore formation or degradation.

저자 스포트라이트: 망막 신경절 세포 연구를 위한 메탄올 기반 전체 장착 준비  

망막 신경절 세포 조사를 위한 메탄올 기반 전체 마운트 준비

The research aims to provide a modified retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for investigating RGCs. Retinas are fragile and folding, which limits experimental research when making a whole-mount retinal patch. In addition, all retinas do not require immediate immunostain.Sometimes, extra retina samples need preservation for further use. We provide a detailed description of a reliable and technically straightforward method of whole-mount retina stain that emphasizes the proper preparation and the need for the long-term storage of retinas for RGC investigation. We will continue to work on the basic research of degenerative optic neuropathies.Further, the molecular mechanism of optic nerve injury and accident regeneration and potential clinical targets for diagnosing and treating neurodegenerative disease will be explored.

해부 후 망막은 편평한 네잎 클로버처럼 보일 것입니다. 이 연구에서는 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 메탄올을 첨가한 후 망막이 하얗게 변했습니다(그림 1). 한편, 망막은 부드러움에서 유연하고 평평한 것으로 바뀌었습니다. 다음으로, RGC는 anti-RBPMS8로 라벨링되었습니다. 컨포칼 현미경(접안렌즈: 10x, 대물렌즈: 40x)을 사용하여 전체 마운트 망막(n = ...

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메탄올은 망막 전체 마운트 제제 및 장기 보관을 위한 보조 고정 배지로 사용할 수 있으며, 이는 망막 신경절 세포의 조사에 유용합니다.

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

이 연구는 RGC를 조사하는 데 유용하고 실용적인 수정된 망막 분리 워크플로 및 조직 샘플 저장 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다. 망막은 깨지기 쉽고 접혀 있어 전체 마운트 망막 패치를 만들 때 실험적 연구를 제한합니다. 또한 모든 망막은 즉각적인 면역 염색이 필요하지 않습니다.때때로, 여분의 망막 샘플은 추가 사용을 위해 보존이 필요합니다. 우리는 RGC 조사를 위한 망막의 적절한 준비와 장기 보관의 필요성을 강조하는 전체 마운트 망막 염색의 신뢰할 수 있고 기술적으로 간단한 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 우리는 퇴행성 시신경 병증의 기초 연구를 계속할 것입니다.또한, 시신경 손상 및 사고 재생의 분자 메커니즘과 신경퇴행성 질환의 진단 및 치료를 위한 잠재적인 임상 표적을 탐구할 것입니다.

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Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

1.8K 조회수.  Renmin Hospital of Wuhan University. 이 연구는 RGC를 조사하는 데 유용하고 실용적인 수정된 망막 분리 워크플로 및 조직 샘플 저장 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다. 망막은 깨지기 쉽고 접혀 있어 전체 마운트 망막 패치를 만들 때 실험적 연구를 제한합니다. 또한 모든 망막은 즉각적인 면역 염색이 필요하지 않습니다.때때로, 여분의 망막 샘플은 추가 사용을 위해 보존이 필요합니다. 우리는 RGC ?...

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Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

연구

신경과학

Mouse Retina Isolation and Flattening

After fixing the enucleated eyeball of the euthanized mouse, transfer it to a glass slide and place it under a dissecting microscope. Using forceps, clamp the margin of the cornea to prevent eyeball movement. With the dissecting scissors, cut around the cornea at a depth of approximately one millimeter through the cornea scleral limbus, and then remove the lens and vitreous body.Holding the optic disc at the center, cut the retina radially along the four quadrants, reaching approximately 2/3 of the retina's radius. Clamp one of the scleral edges using toothed forceps. Hold the sclera edge with untoothed forceps and move from the toothed forceps toward the sclera base.Carefully peel the retina. Wet the retina with 200 microliters of PBS using a pipette. Remove excess PBS using absorbent paper, and flatten the retina with a small bristle brush if needed.Slowly add cold methanol drop-by-drop onto the retina's inner surface until it covers completely. Once the retina turns white and develops increased tenacity, gently flatten the retina and remove impurities, such as residual pigment membranes and the vitreous body, with a small bristle brush. After inverting the retina, treat it with methanol as previously demonstrated, and transfer it into a well of 24 well plate, Soak it in methanol and store it at 20 degrees Celsius for one to two hours for immediate immunostaining.Then rinse the retina with PBS after removing methanol from the plate. The retinol ganglion cells of the retinas before and after methanol treatment were visualized using confocal microscopy, which indicated that the 12 months of methanol preservation did not affect the RGC immunostaining.