저자는 비교 척추의 생물학 과정의 관리에서 역할에 대한 시러큐스 대학교 박사 매릴린 커에서 생물학 학부를 인정하고 싶습니다. 알버스톤 연구실은 노화에 대한 건강 / 국립 연구소의 국립 연구소에서 국립 치과와 Craniofacial 연구 보건 / 국립 연구소의 연구소뿐만 아니라 부여 R01AG031922에서 부여 R21DE019223에 의해 지원됩니다.

1. cDNA 플라스미드 대상의 변환 부품 I : 플라스미드의 변환 (소요 시간 : 3 시간 플러스 하룻밤 배양) <ol><li> 42 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 SOC 영양소 국물 (반응 당 500 μL) </li><li> 얼음 유능한 세포를 해동 </li><li> 25 μL 관할 세포에 플라스미드 1 μL 추가 </li><li> 20 분 동안 얼음 플레이스 </li><li> 45 초 동안 42 ° C의 물을 욕조에 열 충격 세포 </li><li> 바로 이분을 위해 얼음에 세포를 장소 </li><li> 세포의 각 유리병 42 ° C 영양 국물 500 μL 추가 </li><li> ° C 분당 255 회전에서 2 시간 동안 (RPM) 37시 쉐이크 </li><li> Luria Bertani (LB) 한천 플레이트 접시에 75 μL 변환 믹스 </li><li> 부화 플레이트 37 ° C에서 거꾸로 하룻밤 </li></ol> 부 II : E. 콜리 문화 (소요 시간 : 15 분 플러스 하룻밤 배양) <ol><li> 문화 튜브에 각각 반응 나누어지는 3 ML의 LB의 국물과 50 MG / ML 암피실린 3 μL를위한 </li><li> 한천 플레이트에서 1 박테리아 콜로니을 다쳤고, 각 문화 튜브에 추가 </li><li> 37 문화 튜브를 흔들어 ° C를 255 RPM 하룻밤에 </li></ol> 파트 III : 플라스미드 준비 (소요 시간 : 1.5 시간) <ol><li> 5 프라임 FastPlasmid 미니 키트 (카탈로그 # 2300000)를 사용하여 야간 문화 플라스미드 분리 </li><li> 준비 플라스미드의 존재를 확인하려면, ethidium의 브로마이드 물들일 1 % 트리스 - 아세테이트 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (태) 겔의 키트에서 eluted DNA를 실행 </li></ol> 2. 원위치 발굴 - 표시 RNA 프로브 합성에서 부품 I : 플라스미드의 선형화 (소요 시간 : 2.5 시간) <ol><li> 1.5 ML의 microfuge 관에서 결합 : <table border="1"><tbody><tr><td> 플라스미드 준비 </td><td> 20 ML </td></tr><tr><td> 제한 효소 * </td><td> 2 ML </td></tr><tr><td> 버퍼 ** </td><td> 10 ML </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 10X (BSA) </td><td> 10 ML </td></tr><tr><td> 디에틸 Pyrocarbonate (DEPC) 물 </td><td> 58 ML </td></tr><tr><td></td><td> 100 ML </td></tr></tbody></table></li><li> 37 ° C 2 시간 동안 부화 * 플라스미드에 따라 다릅니다 ** 제한 효소에 따라 다릅니다 </li></ol> 부 II : 전사 (소요 시간 : 3 시간) <ol><li> 1.5 ML의 microfuge 관에서 결합 : <table border="1"><tbody><tr><td> 플라스미드 선형 </td><td> 4 ML </td></tr><tr><td> 10X 전송 버퍼 ** </td><td> 4 ML </td></tr><tr><td> Digoxigenin 라벨 믹스 </td><td> 4 ML </td></tr><tr><td> 효소의 * </td><td> 2 ML </td></tr><tr><td> RNase 억제제 </td><td> 2 ML </td></tr><tr><td> DEPC 워터 </td><td> 24 ML </td></tr><tr><td></td><td> 40 ML </td></tr></tbody></table></li><li> 1 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다 </li><li> 효소의 * 2 μL 추가 </li><li> 1 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다 </li><li> DNase 2 μL 추가 </li><li> 37 품어 ° C를 20 분 * 플라스미드에 따라 다릅니다 ** 효소와 다름 </li></ol> 파트 III : 강수 (소요 시간 : 하룻밤 사이에 부화 1 시간 5 분 플러스 2 시간 원심 분리기하고 다시 정지) <ol><li> 0.2M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 4 μL 추가 </li><li> 4M 염화 리튬의 5 μL 추가 </li><li> 얼음 차가운 100 % 에탄올 150 μL 추가 </li><li> 하룻밤에 -80 ° C에서 2 시간 동안 부화 </li><li> 4 ° C, 가만히 따르다 거리에 뜨는 30 분 14,000 rpm으로 원심 분리기 </li><li> 7분에 대한 건조 펠릿 </li><li> 20 μL의 DEPC 물에 다시 중지 </li><li> 37 품어 ° C를 5 분 </li></ol> 파트 IV : 분별화은 - 프로브 크기가 0.6 킬로바이트보다 큰 경우에만 수행 (소요 시간 : 대개, 프로브의 크기에 따라 20여 분 다름 없음) <ol><li> 1.5 ML의 microfuge 관에서 결합 : <table border="1"><tbody><tr><td> RNA 프로브 </td><td> 20 ML </td></tr><tr><td> DEPC 워터 </td><td> 12 ML </td></tr><tr><td> 중탄산 </td><td> 4 ML </td></tr><tr><td> 나트륨 탄산염 </td><td> 4 ML </td></tr><tr><td></td><td> 40 ML </td></tr></tbody></table></li><li> 60 ° C의 물을 욕조에 품어. 방정식에서 배양 시간을베이스 : 시간 (min.) = (KB 시작 - 킬로바이트을 원하는가) / (KB X를 시작 0.11 x는 킬로바이트를 원하는) 평균 원하는 크기 = 0.6 킬로바이트 </li></ol> 파트 V : 최종 강수량 (소요 시간 : 5 분하룻밤 부화, 1 시간 백인 군대가 플러스 2 시간)을 원심 분리기 및 겔 전기 영동을 다시 중단 1 시간 <ol><li> 40 μL DEPC 물을 추가 </li><li> 8 μL 아세트산 나트륨을 추가 </li><li> 1.04 μL 빙초산 추가 </li><li> 240 μL 얼음 차가운 100 % 에탄올 추가 </li><li> 하룻밤에 -80 ° C에서 2 시간 동안 부화 </li><li> 4 ° C, 가만히 따르다 거리에 뜨는 30 분 14,000 rpm으로 원심 분리기 </li><li> 7분에 대한 건조 펠릿 </li><li> 20 μL의 DEPC 물에 다시 중지 </li><li> 섞어 소용돌이 </li><li> riboprobe의 존재를 확인하려면, ethidium의 브로마이드와 1 %의 태 젤 자국에 다시 정지 솔루션을 실행 </li></ol> 3. 원위치 하이브리드화에서 전체 마운트 부품 I : 태아의 고정 및 Proteinase K의 소화 (소요 시간 : 수정 하룻밤 플러스 4시간 저장 다음날, 2.5 시간 창고에서 파트 II까지) <ol><li> zebrafish 배아를 개최 수집하고 4 박 4 % paraformaldehyde (PFA)에서 해결 ° C </li><li> 인산염에서 수정 배아를 씻어은 10 분마다 트윈 - 20 (PBSt) 3 회 0.1 %를 포함하는 호수 버퍼 </li><li> 세부적으로 밀고 집게를 사용하여 실험 시약 수동 dechorionate 배아 (필요한 경우)에 태아의 노출을 보장하기 위해 </li><li> 한 시간 만이라도 각 세척을 25 % 등급 일련의 세탁과 PBSt의 50 % 메탄올에 의해 배아를 탈수 후 -20 ° C에서 100 % 메탄올에 저장 </li><li> 때 사용할 준비가 50 % (2 회) 25 % (1 회) 10 분마다 PBSt의 메탄올로 세척하여 PBSt에서 배아를 rehydrate. 마지막으로 100 % PBSt 10 분만에 각 2 번 씻는다. 정확한 타이밍 PBSt / 메탄올 세척을위한 중요하지 않다 </li><li> 어두운 안료를 제거하는 PBSt에 10 % 과산화수소 용액, 필요한 경우에 블리치 배아. 배아는 배아의 연령에 따라 약 10-20 분 과산화수소 용액에 부화해야하며, microfuge 튜브의 뚜껑이 공기 압력의 빌드 - 업 방지하기 위해 열린 남아 </li><li> 50 MG / ML Proteinase K와 다이제스트 배아가 배아의 연령에 따라, 3-15 분 동안 PBSt에서 1:5000 희석 </li><li> 다음 다시 수정의 30 분 4퍼센트 PFA의 배아, 그리고 5 분 각각에 대해 PBSt 3 번 씻어 </li></ol> 부 II : Riboprobes의 하이브리드화 (소요 시간 : 3 시간 플러스 하이브 리다이 제이션을위한 야간, 1.5 시간 파트 III에 다음날) <ol start="9"><li> 2~3시간에 대한 preheated 70 ° C 물 목욕에 prehybridization 솔루션 (PHS)와 배아를 Prehybridize </li><li> , PHS를 제거 70 ° C 하룻밤에 품어 0.5 ML의 하이브 리다이 제이션 솔루션과 1.5 μL 이전 합성 Digoxigenin 표시된 riboprobes를 추가합니다. 온도 riboprobe 대상에 따라 몇도 이내에 수시로 바뀔 수 있습니다 </li><li> 그 다음날, 70 배아를 씻어 ° C 십분 각 2X 살린 - 나트륨 구연 산염 (SSC)의 PHS 75 % 50 %, 25 %의 등급 솔루션 후 68시 30 분 0.2X SSC의 세척 ° C </li><li> 상온 10 분 각 Maleic 산성 버퍼 (MAB) 2 회 세척 </li></ol> 파트 III : 안티 Digoxigenin (α - 발굴) 항체 인큐베이션 (소요 시간 : 3 시간 더하기 차단하는 숙박, 2.5 시간 파트 IV에 다음날) <ol start="13"><li> 12 잘 접시에 배아를 전송 </li><li> 상온에서 최소 3 시간 동안 1-2 ML 차단 솔루션에 사전 차단 배아 </li><li> 동시에,이 솔루션에서 차단 솔루션의 두 번째 볼륨을 준비하고 안티 - digoxigenin 항체를 1:2000 diluting하여 항체를 사전 차단 </li><li> 사전 블록을 제거하고 1-2 ML 사전 차단 α - 발굴 솔루션을 추가, 4 밤새 품어 ° C </li><li> 그 다음날, MAB에서 배아를 씻으십시오. 배아 처음 5 분 MAB에 부화 허용, 다음 버퍼 변경을 수행하는 두 십분 한 삼십분 한 60분 간격에 대한 부화. 정확한 타이밍이 필요하지 않습니다 </li><li> 오분 알카라인 인산 가수 분해 효소 (AP) 버퍼에 각 태아에게 3 회 와시 </li></ol> 파트 IV : 스테 이닝 및 최종 처리 (소요 시간 : 얼룩을 위해 하루 1 시간 사용 riboprobe에 따라 글리세롤의 세척, 글리세롤 세척 당 6-10시간의 시작 4 시간은 글리세롤에 저장되어있을 수 있습니다) <ol start="19"><li> 얼룩이 충분 때까지 배아에 1-2 ML의 얼룩 솔루션을 추가 호일로 접시를 포장하고, 정기적으로 (매 20 분)에 염색법 확인 </li><li> 얼룩 반응을 중지 5 분마다 PBSt 2 회와 배아 와시 </li><li> 배경 얼룩을 제거하는, 100 % 메탄올에 다음 25%에서 십분 세척 (1 시간) 50 % (2 회) PBSt에서 메탄올을 사용하여 배아를 탈수 </li><li> 배아는 상온에서 최소 2 시간 동안 100 %의 메탄올에 부화 허용 </li><li> 50 % 십분 세척 (2 회) 25 % (1 회) PBSt에서 메탄올을 사용하여 PBSt에 Rehydrate 다음 백퍼센트에 PBSt 2 번 씻어 </li><li> 스테인드 E를 전송4 등급 세척 일련의, 그리고 저장을 사용하여 PBSt에 80 % 글리세롤 솔루션 mbryos, ° C. </li></ol> 요리법 : <ul><li> LB 한천 플레이트 - 10g의 LB 한천 + 250 ML 증류수, 압력솥이 때 시원한 각 배양 접시에 15-20 ML 따뜻한 솔루션을 부어, 250 μL 암피실린를 추가, 한천이 응고 수 </li><li> LB의 국물 - 12.5 g의 LB 스프 + 200 ML 증류수, 압력솥은 사용하기 전에 냉각 허용 </li><li> 1% 태 젤 - 0.4 g 아가로 오스, 40 ML 1X 태, 2 μL ethidium의 브로마이드, 부하 7 μL 플라스미드 (cDNA 대상의 플라스미드 변환) 또는 3 μL riboprobe 4 μL DEPC 물 (현장 발굴 - 표시 RNA 프로브 합성에서) + 1 μL 로딩 염료, 5 μL DNA 사다리 </li><li> Prehybridization 솔루션 50 % 포름 아미드, 배 SSC, 9.2mM 구연산, 1 % 트윈 - 20 </li><li> 하이브 리다이 제이션 솔루션 prehybridization 솔루션 플러스 500 μg / ML tRNA 50 μg / ML의 헤파린 </li><li> MAB - 100mM Maleic 산성, 150mM NaCl, 0.2M NaOH, 0.1 % 트윈 - 20, 7.5 산도 </li><li> MAB에 차단 솔루션 - 3 부품 MAB, 1 일부 10% Boehringer 차단 시약 1 일부 열 양고기 혈청을 비활성화 </li><li> 9.5에 AP 버퍼 60mM 트리스 - HCL의 산도, 60mM NaCl, 30mM MgCl 2, 0.1 % 트윈 - 20 </li><li> 얼룩 솔루션 - 5 - 브로모 -4 - 클로로 - 3 - 인돌릴 인산염 (BCIP) 및 니트로 파란색 tetrazolium (NBT) AP 버퍼 </li></ul> 4. 대표 결과 제대로 수행되면, NBT, BCIP, 그리고 알칼리성 인산 가수 분해 효소의 반응은 자주색 얼룩으로 zebrafish 배아에 나타납니다 보라색 침전물을 형성합니다. Riboprobes는 이전에 다음 ID로 관심의 유전자에 해당하는 cDNA의 합성해야합니다. 따라서, 그것은 어떤 얼룩 시각 관심의 유전자가 특정 발달 단계에서 베꼈는데되어있는 zebrafish의 영역을 나타냅니다 체결하실 수 있습니다. fgf8a (Reifers 외, 1998,,. 그림 2) deltaC (오츠 외, 2005).이 과정의 목적을 위해 riboprobes는 aldh1a2 (; Begemann 외, 2001;. 그림 1 이전 raldh2)에서 합성되었다; myod1 (와인버그 외, 1996.) shha (. 크라우스 외, 1993), pax2a (브랜드 외, 1996;. 그림 3)과 myl7 (이전 cmlc2;. Yelon 외, 1999) cDNA. 얼룩은 정중선과 somites, tailbud, myotome, 뇌, 심장을 포함한 해부 학적 구조를 예상했다. Ace/fgf8a의 돌연변이가 이러한 구조의 많은 결함을 가지고 것으로 예상했다. 얼룩이 쉽게 표준 해부 현미경을 사용하여 시각되었습니다. (Schoenwolf 2009.; D&#39; 코스타 외, 2009;, Schmoldt 외, 2009. 클락, 2003) 추가 소스는 여기에 설명된 것과 유사한 기법을 기원에 대한 자세한 내용 및 문제 해결을 포함합니다. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig1.jpg" alt="그림 1" /> aldh1a2 특정 riboprobes와 hybridized되어 그림 1. zebrafish 배아 24 시간 게시물 수정. 구체적인 얼룩은 눈, hindbrain, 가슴 지느러미 봉오리 primordia 및 somites에서 볼 수 있습니다. 앞쪽에이 최고입니다, 후부는 바닥입니다. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. fgf8a위한 프로브 특정 함께 hybridized되었습니다 발전 13 체절 단계에서 zebrafish 배아. 구체적인 얼룩은 telencephalon, 지느러미 diencephalon, midbrain - hindbrain 경계, somites 및 tailbud에서 본 것입니다. 복부의 왼쪽이며, 지느러미는 올바른 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. pax2a, 신경 시스템을 시각화하는 데 유용 강력한 마커에 대한 riboprobe의 특정과 hybridized되었습니다 22 시간 게시물 수정의 zebrafish 배아. 구체적인 얼룩은 맥락막의 균열 (fissure), midbrain - hindbrain 경계, 귀의 소포 및 척수에있는 뉴런에서 볼 수 있습니다. 왼쪽 앞쪽에와 도설 볼 수 있습니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

원하는데로 학생 알려진 유전자 발현 패턴의 시각화를 통해 해부 개발 유전자의 역할을 이해하는 데 도움을 비교 척추의 생물학 실험실 과정에 사용되었다. 과정의 첫번째 부분을 위해, 학생들은 그들이 충분한 시간이, 공부 이해 비교 및​​ 대비 척추의 해부학 수 있도록 여러 가지 chordate의 taxa를 대표하는 생물체에 대한 해부를 수행했습니다. 과정의 두 번째 부분에 대한 소개로, 학생들은 zebrafish 개발과 해부학을 설명하는 공식적인 강의를 제공했다. 기원 실험의 방법과 예상 결과도 논의되었습니다. 학생들은 다음 somitogenesis과 발전의 프림 - 6 단계에서 라이브 zebrafish을 받았고, 2 5 일 포스트 수정 (DPF)의 해부 현미경으로 검사합니다. 이것은 학생들에게 zebrafish 배아는 생김새의 더 나은 이해와 ontogeny 이상 발생하는 형태학의 변경 사항의 유형을 제공하는 것이었다. 다음 실험실 세션에서, 학생들은 좋겠는 이전에 다음 ID로 수행했다하는 zebrafish 배아를 부여했다. 그들은 관심의 각 유전자 (riboprobe 사용)에 대한 유전자 발현 패턴을 연구하고 설명하도록 요청했다. 좋겠어에 사용되는 배아는 heterozygous ace/fgf8a 라인의 구성원 사이에 matings에서 파생되었습니다. Mendelian 상속에 따르면, ace/fgf8a의 matings에서 배아의 25 %가 homozygous 돌연변이로이 과정에서 집중 해부 구조의 많은 결함을 전시 것으로 예상했다. 알버스톤 실험실에 게시된 보고서 및되지 않은 관찰 결과에 따르면, 뇌 및 부적 절한 심장 루핑의 결함뿐만 아니라 somites 결함 (.; 알버스톤과 Yelick, 2005; 개인 관측 브랜드 외, 1996)으로 예상했다. 학생들은 제시 각 유전자 발현 패턴에 대한 모든 표본, 야생 종류 (heterozygous 동물이 개발의 초기 단계에서 야생 타입 형제로부터 구별할 수 있습니다) 및 homozygous 돌연변이를 조사하도록 요청했다. 그들은 그들의 결과를 설명하는 실험실 보고서를 작성하도록 요청하고, 결함이있는 유전자 발현은 해부 학적 기형을 시켰던 수 있습니다 방법은 해부학과 유전학의 지식을 바탕으로했다. 학생들은 흥분과 호기심이 실험실 연습을받을 것 같았다. 대부분의 이전 좋겠 사용하지 못한 매우 과정의이 부분에 관심이 있었다. 학생들은 흥미로운 zebrafish 배아의 유전자 표현의 다양한 패턴을 발견, 일부도 설명 얼룩 패턴은 웃는 얼굴로 잘 알려진 디자인과 기호, 그들을 연결하여 시각. 그 결과 검사 결과는 학생들이 소원 프로토콜과 특정 해부 학적 구조 유전자의 표현에 대한 일반적인 이해를했다 보여주었다. . Huelsken 외, 2002,,. Geetha - Loganathan 외, 2008a;.. Geetha - Loganathan 외, 2008b 학생은 또한 유전자의 특정 기능을 이해하는 데 필요한하던 연구실 (스틱니 외, 2000 동안 소원을 사용하는 공부 ). 그것은 일부 학생들이 제한된 배경 신호 경로에 대한 지식과 관심의 유전자를했다, 그러나 분명했다. 이러한 개념에 대한 자세한 내용은 기초 강의 향후 비교 척추의 생물학 과정에있는 소망의 사용에 오신 것을 환영합니다 외에도 수 있습니다 좋겠어. 프로토콜은 일반적으로 과정의 일정에 따라 연속 4 일 걸리므로, 학생은 수업 및 강사는 나머지에 대한 책임 있어야합니다에서 실험의 일부를 완료하실 수 있습니다. 교육 도우미는 모든 앞의 단계를 수행하는 동안 우리의 비교 척추 생물 수업에서 학생들은 실험실에서 얼룩 반응을 완료했습니다. 그것이 수행 수업 시간에 원하는 학생을 위해 선호하는 경우, 프로토콜은 클래스의 기간에 따라 여러 실험실 세션을 통해 수행할 수 있습니다 subunits로 나눌 수 있습니다. 여기 연구실 회의 한 번만 일주일에 의한되면서 학생들이 전체 프로토콜을 수행하는 것이 가능하지 않으면, 학생들이 사용 riboprobe에 따라 클래스의 시작 부분에 얼룩 솔루션을 추가할 수 있고, 얼룩이 완료했습니다 한 시간. 그것이 개발에 얼룩을 위해 소요되는 시간은 각 riboprobe 및 실험 조건의 다양한 크게 다르며, 그리고 수업 전에 정해진해야합니다. 특히, 학생은 실험실에있는 얼룩을 개발 될 경우, 교원은 교실 밖에서 상당한 시간과 노력을 요구할 것입니다 모든 이전 단계에 대해서는 책임을지지 않습니다. 원하는 경우, 소원을 짧은 대안은 그러나 현재로서는, 발달 유전자에 대한 zebrafish 특정 항체가 쉽게 사용할 수 없습니다, 단백질 지방화를 시각화하는 항체 레이블을 사용하여 immunohistochemistry 수 있습니다. 또 다른 옵션은 다른 척추 동물의 소원을 수행하는 것입니다ND는 학생들이 다른 생물에서 같은 유전자의 표현 패턴을 비교했습니다 (.; 아라 마키 외, 2007;. 이머징 모델 생물 2008; Pizard 외, 2004 신흥 모델 생물, 2010). 사용 overarching 목표는 비교 척추의 생물학 과정에서 분자 생물 학적 기법 해부 개발을 연구하는 데 사용되는 방법을 학생들에게 보여주는 좋겠어요. 또한 유전자 발현뿐만 아니라 발달 기형뿐만 아니라 진화의 변화가 발생할 수 있습니다 방법 변경에 대해서 추측 학생들을위한 기회를 제공했습니다. 진화 발달 생물학 (종종 &quot;에보 (Evo) - devo&quot;이라고 함)과 같은 공식, 연구의 빠르게 성장하는 분야는 개발을 통해 유전자형 및 표현형를 연결하고, 진화 변화의 잠재적인 기계론의 기지를 명료하게하다하는 것을 목표로하고있다. 이 분야의 상승으로 더 많은 생태학, organismal 생물학 및 physiologists들은 연구에 분자 기술을 채용하고 있습니다. 우리는 비교 척추의 생물학 과정에있는 소망의 사용이 연구에 현재의 기술 및 개념적 발전과 날짜, 및 생물 학적 subfields를 결합하여 상위 수준의 생물학 과정의 더 나은 수평 정렬을 촉진하기 위해 교과 과정을 유지하는 데 도움이됩니다 주장하고있다. 또한,이 통합 방식은 좀 더 다양 교육과 미래 학제 과학 연구의 진흥에 선도적인 학생 한 과정에서 생물 학적 연구 기법의 구색를 배울 수있는 기회를 제공할 것입니다.

using whole mount in situ hybridization to link molecular and organismal biology

현장 하이브리드화의 전체 마운트 (소원) 전체 마운트 표본 내의 특정 mRNA의 성적의 지방화를 통해 유전자 발현을 연구하는 데 사용되는 분자 생물학 연구소에서 일반적인 기법입니다. 이 기술은 (알버스톤와 Yelick, 2005 적응) 시러큐스 대학에서 상위 수준의 학부 비교 척추의 생물학 실험실 교실에서 사용되었습니다. 비교 척추의 생물 실험실 코스의 처음 두 3가 학생들에게 주로 전통적인 해부와 모델의 사용을 통해 다양한 chordate의 taxa를 대표하는 여러 생물의 발생학 및 총 해부학을 공부하는 기회를 주었다. 코스의 마지막 부분 소원이 zebrafish 배아에서 수행어진 분자 기법을 고용 척추 개발의 관찰을 통해 해부학을 가르치고하는 혁신적인 접근 방식을 참여. heterozygous fibroblast의 성장 인자 8 (fgf8a) 돌연변이 라인, 에이스가 사용되었습니다. Mendelian 상속으로 인해, 에이스 제작 야생 유형, heterozygous 및 1시 2분 1초 비율 homozygous ace/fgf8a의 돌연변이를 intercrosses. 정중선과 같은 심장, somites, tailbud, myotome, 그리고 두뇌와 같은 해부 학적 구조를 개발 알려진 표현식 패턴과 RNA 프로브가 사용되었습니다. 원하는데로 학생들이 수업 시간에 얼룩 반응을 수행과 함께, 13 체절과 프림 - 6 단계에서 zebrafish를 사용하여 수행되었습니다. 개발의 다른 단계에 zebrafish 배아의 연구는 학생들에게 이러한 해부 학적 구조 ontogeny 이상의 변화 모습을 관찰하는 능력을했다. 또한, 일부 ace/fgf8a의 돌연변이가 부적 절한 심장 반복하고, 체절과 두뇌 개발에 결함이 표시됩니다. 이 실험실에있는 학생들은 모두 외부 해부학뿐만 아니라 유전자 발현 패턴을 사용하여 여러 장기 시스템의 정상적인 발전을 관찰했다. 그들은 또한 부적 절한 해부 개발과 유전자 발현을 (즉, putative 돌연변이) 표시 배아를 파악하고 설명했다. 이미 필요한 장비를 소유하지 기관이나 연구소 및 curricular 혁신을위한 자금이 부족한 지도자 들어, 시약 및 장치의 금융 비용으로 시간과 노력이 부분에 필요한 것입니다 고려하는 요소 수 관계 설정의 강사. 그럼에도 불구하고, 우리는 교실 실험실 설정이 유형의 소망의 사용이 발달 유전 해부학 사이의 중요한 연결을 제공할 수 있다고 주장. 기술 진보와 분자 수준에서 organismal 개발을 연구하는 능력보다 쉽게​​, 저렴하고, 점점 인기가되면서, 많은 진화 생물학, 생태학, 그리고 physiologists는 분자 생물학 분야의 연구 전략에 의존하고 있습니다. 비교 척추의 생물학 연구실 교실에서 사용하면 좋겠 분자와 해부학 하나의 코스 내에 수렴하는 방법의 한 예입니다. 이것은 상위 수준의 대학 학생들에게보다 다양 교육과 미래 학제 과학 연구의 진흥에 선도적인 현대 생물 학적 연구 기법을 연습할 수있는 기회를 제공합니다.

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Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브 리다이 제이션 (좋겠어)는 해부를 척추 이외에 상위 레벨의 본과 비교 척추의 생물학 과정에 사용되었다. 이것은 학생들이 한 과정 내에서 분자와 organismal 생물학의 연구를 연결뿐만 총 해부학과 같은 유전자 발현 패턴을 연구하는 기회를 주었다.

전체 마운트를 사용하여 현장에서</em분자 생물학과 Organismal를 링크> 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

21.5K 조회수.  Syracuse University. 전체 마운트 현장에서 하이브 리다이 제이션 (좋겠어)는 해부를 척추 이외에 상위 레벨의 본과 비교 척추의 생물학 과정에 사용되었다. 이것은 학생들이 한 과정 내에서 분자와 organismal 생물학의 연구를 연결뿐만 총 해부학과 같은 유전자 발현 패턴을 연구하는 기회를 주었다.

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Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

칙의 전체 마운트 항체 스테 이닝을위한 방법

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

전체 산<em&gt; 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의&gt; 하이브리드

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

자동을 사용하여 염색체의 높은 처리량 물리적 매핑<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

형광등과 결합 염색체 복제 타이밍<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; 현장에서</em전체 마운트 태아 및 세포 조직학에서&gt; 하이브리드는 해양 Elasmobranchs을위한 적응

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

높은 해상도 전체 마운트<em&gt; 제자리에서</em유전자 발현 및 기능을 연구하는 제브라 피쉬 배아에서&gt; 하이브리드

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

전체 마운트를 사용하여 현장에서 하이브 리다이 제이션