이 작품은 환경 건강 과학의 국립 연구소에 의해 지원되었다 [K22ES012264에 AJRB]와 미국 암 협회 InstitutionalResearch 그랜트 [ACS - IRG - 00 - 173-04] 조종사 projectaward [AJRB에]. 우리는하지 말아야 할 걸의 예를 들어, 원고 특히 비디오와 아담 브라운에 대한 의견의 중요한 독서에 대한 주교의 실험실의 구성원을 또한 감사드립니다. 우리는 우리에게 해부 비디오 촬영을위한 카메라 설정 그의 해부 범위 / 비디오의 사용을 허용을위한 Greehey 어린이 암 연구소의 박사 도널드 맥유언 감사합니다. 우리는 선명하게 우리의 microdissection 도구의 수리를 위해 코르테 악기에서 Daron 브라운 감사합니다.

1. 눈 밖에서 관계없는 조직을 제거 <ol><li> 35mm 접시의 뚜껑에 1X PBS 하거라. 수준은 뚜껑의 입술 아래에 있어야합니다. </li><li> 35mm 접시에 저장 튜브에서 바로 포셉, 전송 아이 (들)을 사용합니다. 1 : 눈이 두 가지 이유로 PBS에 빠져들 수 있습니다. 당신이보고 쉽게 제거 2 수 있도록 외부 조직의 눈을 멀리 &quot;떠&quot;것입니다. 정지 상태에서 해부하는 동안 눈을 자연스럽게 당신은 반대보다는 이런 형상 작업 수 있도록, 자사의 구형 형태를 유지합니다. </li><li> 직각 포셉 (45 ° 15 °)의 두 쌍을 이용하여 부드럽게 (각막쪽으로 IE) 성미 조직을 떼어, 가능한 한 많은 근육과 결합 조직으로 제거합니다. 일부 결합 조직은 남아있게됩니다. 노력 가능한 거의 같은 눈알을 쥐어 짜기로하여야한다. </li><li> 스프링 가위에 대한 15 ° 포셉을 무역. 45 °의 집게와 함께 지속적인 눈을 가지고 있지만, 나머지 근육 및 결합 조직뿐만 아니라 시신경을 떼어 버리기 봄 가위를 사용합니다. * 도움말 : 트림 다음 성미 조직을 밀어 가위의 바깥쪽 가장자리를 사용하여 (corneo - scleral 나누어 방향)합니다. 모든 외부 조직이 눈에에서 제거되었습니다 때까지 계속합니다. </li></ol> 2. 각막과 렌즈를 제거 <ol><li> 최대 직면하고있는 각막으로 각막의 중심에 작은 배를 공략하기 위해 45 °의 집게를 사용합니다. </li><li> 봄 가위를 사용하여 플랩의 바닥에 작은 절개를합니다. 플랩을 가자. </li><li> 눈을 개최하는 것은 여전히​​ 집게와 가위로 낮은 날개를 삽입하고 수직 절개와 corneo - scleral 나누어 방향으로 절단합니다. 각막과 홍채가 모두 절단되도록 홍채 아래 낮은 블레이드를 유지하려고합니다. corneo - scleral 분열 모든 방법을 절단하지 마십시오. 눈에 삽입 가위 보관하십시오. </li><li> 당신의 45 °의 집게를 사용하여, 신중하게 가위가 corneo - scleral 나눌 평행되도록 시선을 회전하고 작은 절개를합니다. 천천히 주위를 작은 incisions 모든 방법을 만들고, 눈 360 ° 회전. 다시 말하지만, 홍채와 각막 모두 절단되도록 홍채 아래 봄에 가위의 아래쪽 블레이드를 유지하려고합니다. 멀리 눈의 나머지 부분에서 꽃창포와 각막을 들어 그들을 폐기. </li><li> 그 측면에 눈을 기울이기 및 렌즈를 강제로, 눈의 뒷부분 이분의 일에 부드럽게 아래로 누르십시오. 렌즈를 폐기하십시오. 나머지 세안 컵의 내부는 부드럽고 불투명 보여야 신경 망막에 의해 줄지어있다. </li></ol> 3. 쿼터 4 결과 결과 세안 컵, - &quot;petaled&quot;꽃 같은 구조를 <ol><li> 눈 세안 컵의 개통은 몸에 직각입니다 같은 위치에 있어야합니다. 꾸준한와 위치 세안 컵에 45 °의 집게를 사용하십시오. </li><li> 당신 앞에 당신의 봄 가위를 들고 그들이 당신의 몸에 수직 있으며, 열린 눈 컵의 상단 가장자리에 봄 가위의 아래쪽 블레이드를 삽입합니다. 당신의 45 °의 집게를 사용하여 조심스럽게 단일 직선 절단이 시신경 헤드쪽으로 corneo - scleral 분열에서 만들 수 있도록 아이 컵을 맞춥니다. 모든 상처는 corneo - scleral 나눌 수직이어야하며 지정하지 않는 한, 그것으로 절단되지 않고 가능한 시신경의 머리에 가까이 가야한다. </li><li> 신체와의 수직을 유지, 세안 컵 180 ° 회전합니다. 두 번째 수직 인하를 만들기 위해 단계 3.2 기술을 사용합니다. </li><li> 세안 컵 회전하고 두 개 더 상처를 만들기 위해 3.2에 설명된 기법을 반복합니다. 네개의 상처는 가능한 한 떨어져 90 °에 가깝게한다. 어떤 변화가있을 것입니다 그래서 눈을 완벽하게 원형이 아니라고 유의하십시오. </li></ol> 4. 8 꽃잎 꽃 같은 구조의 결과, 절반으로 네 개의 &quot;꽃잎&quot;의 각 컷 <ol><li> 35mm 접시에서 깨끗한 슬라이드에 등분 세안 컵을 전송합니다. 최대 직면한 세안 컵으로 45 °의 집게와 함께 그 아래 특종. 조심스럽게 액체를 밖으로 들고 깨끗한 슬라이드에 배치하십시오. </li><li> 직각 포셉 두 쌍을 이용하여 부드럽게까지 직면하고있는 신경 망막과 안구를 엽니다. 제거하지 마십시오 신경 망막 - 그것이 당신이 그것에 대해 작동하지 않습니다 그래서 눈을는 구면 형상의 일부를 유지하는 데 도움이됩니다. 또한 실수로 다음과 같은 절차에 손상되지 않도록 RPE를 보호합니다. </li><li> 꽃잎 중 하나가 당신의 몸에 수직 때까지 슬라이드를 회전합니다. </li><li> 당신의 15 °의 집게를 사용하여 부드럽게 꽃잎의 모서리를 잡아. 꽃잎의 코너가 아니라 신경 망막 또는 각막 RPE해야합니다. 그것의 곡률을 유지 수 있도록 부드럽게 모퉁이에 올려요. </li><li> 꽃잎과 슬라이드 사이에 스프링 가위 하단의 칼날을 넣습니다. 당신의 가위를 선 하나, 직선, 직각 절단이 시신경 헤드쪽으로 corneo - scleral 분열에서 만들 수있을 것이다. 가능한 withou으로 시신경의 머리에 가까운 컷t는 그것으로 절단. 이 슬라이드에 누워있게 꽃잎의 가자. </li><li> 슬라이드 90도 회전 °, 다음 꽃잎이 몸에 직각이되도록. 4.5 단계를 반복합니다. </li><li> 두 번 더 단계를 4.5과 4.6를 반복합니다. 그 결과 구조는 8 꽃잎 꽃과 같이 표시됩니다. </li></ol> 5. 신경 망막을 제거 <ol><li> 표본에 1X PBS의 피펫 100-200 μL. 이것은 RPE의 그걸 벗겨 당신과 떨어져 고집에서 신경 망막을 방지할 수 있습니다. </li><li> 일반적으로 신경 망막은 느슨하게 RPE에 첨부되어 있습니다. 그러나, 그것은 단지 신경 망막 아니라 RPE를 제거하는 연습과 기술을 않습니다. 직각 포셉의 다른 쌍의과 (누른) 안구의 나머지 부분을 안정화하면서 부드럽게 직각 포셉 한 쌍의있는 신경 망막의 꽃잎을 파악. 멀리 눈의 나머지 부분에서 신경 망막을 당겨. 전체 신경 망막이 제거되었습니다 때까지이 절차를 계속합니다. * 도움말 : &#39;눈&#39;을 앵커로 시신경의 머리에 15 ° 포셉의 팁을 스틱. 그러면 신경 망막 아래에 청소에 45 °의 집게를 사용하여 그것을 발사하고 멀리. 이것은 corneo - scleral 나누어 방향으로 시신경의 머리에서 신경 망막을 해제하는 것이 가장 일반적이다. 홍채의 느슨한 잔해를 멀리 당겨주십시오. 조리개는 아주 끈적하고 그렇지 않으면 RPE에 붙어받을 수 있습니다. </li><li> 1X PBS로 표본을 씻어. 피펫 100-200 표본에 1X PBS의 μL 그것을 다시 빨아. PBS를 폐기하십시오. 먼지와 부스러기를 제거하는 필요한 반복합니다. </li></ol> 6. 슬라이드에서 여러분에게 표본 (들)을 마운트 <ol><li> 직사각형 모양의 새 슬라이드에 90 % 글리세롤의 피펫 80-90 μL. 글리세롤의도, 직사각형 얼룩을 할 수있는 피펫 팁의 측면을 사용합니다. (이 한 슬라이드에 두 RPE를 설치하는 절차입니다.) </li><li> 표본에 따라 15 ° 포셉의 낮은 팔을 넣습니다. 부드럽게 해부 슬라이드에서 표본을 리프트. </li><li> 천천히 글리세롤로 표본을 낮추십시오. 부드럽게 당신은 표본 아래에서 그들을 나가면 포셉은 호기심. </li><li> 반복 다른 표본에 대한 6.1-6.3 단계를 반복합니다. </li><li> 긴 측면이 몸에 직각되도록 슬라이드를 회전합니다. 귀하의 커버 유리를 잡고 45 °가 슬라이드를 감동되도록 슬라이드 각도. 그들이 터치 때까지 글리세롤의 얼룩쪽으로 그것을 이동합니다. 커버 유리와 슬라이드 사이의 연락 유지, 서서히 슬라이드의 가장자리쪽으로, 멀리 얼룩의 커버 유리를 이동합니다. 슬라이드의 긴 측면과 커버 유리 최대 라인 수 있도록 그들이 평행하고 있습니다. 당신의 엄지와 집게손가락 사이에 커버 유리의 모서리를 잡아. </li><li> 다른 손에 15 °의 집게를 선택하십시오. 팔 사기꾼의 커버 유리의 위쪽 (무료) 모서리 크레이들. 아주 천천히, 커버 유리를 낮추십시오. 연락이 커버 유리와 글리세롤 사이에 만들어진 경우, 중지하고 마이 그 레이션하는 글리세롤 기다립니다. 이 낮추고 RPE 전체 마운트가 완전히 덮여 때까지 기다리고를 반복합니다. 이것은 기포를 캡처에서 높은 점성 글리세롤을 방지하는 것입니다. COVERGLASS 아래로 누르지 마 - 글리세롤은 접착력이 매우 가난하고, 그 아래에서 뽑는 것입니다. </li><li> 명확한 매니큐어로 커버 유리 슬라이드 만나는 주위에 페인트. </li><li> 건조에 빈 랙 상단에 슬라이드를 삽입합니다. </li></ol> 7. 대표 결과 : 이 절차의 결과는 꽃처럼 보이는 공정 대칭되어야 구조해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. wildtype C67Bl/6J 마우스에서 전체 마운트 RPE. 검은색 또는 agouti 동물의 RPE는 컬러 갈색 어두운이어야하며 부드러운 표면을 가지고해야합니다. 그것은 꽃잎의 지형에 기복을 통지하기 위해 정상입니다. 어떤주는 표본의 착색은 RPE와 기본 맥락막 모두의 착색의 변수 밀도 때문에 다소 변수가있을 수 있습니다. 화이트 화살표 hypopigmented &quot;채널&quot;을 가리 키 -이 정상이며, 안구의 기본 vasculature 때문입니다. RPE와 기본 맥락막 모두에 물리적 손상이 파란색 화살표를 가리 킵니다. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 희석 마우스 전체 마운트 RPE가. 희석 동물에서 수확 표본 거의 투명한에서 카페 프 lait에 색깔이 다양하고 한 표본 여기에 검은 동그라미로 표시, 그 안에서 다양성을 가지고 같습니다. 일반적으로 어린 동물에서 수확 RPE는 가볍고 아르 세 동물의 수확들은 어두운 있습니다. 블랙 화살표 hypopigmented 나타나는 기본 vasculature의 일부를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. Phalloidin의 얼룩은 RPE에 물리적 손상을 감지하는 데 사용할 수 있습니다. Phalloidin의 얼룩은 분명히 상피의 육각형 모양을 보여주는 세포 세포막을 설명합니다. 검은 마우스 (A) 예. 희석 마우스 (B) 예. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 희석 마우스 제대로 해부 RPE. (A) 괄호 및 / 또는 접는 좌굴가 발생할 수 있습니다 너무 넓은 데요 각막의 여백을 나타냅니다. 블랙 서클 내에서 눈 뒤쪽에서 제거되지 않은 외부 조직의 과도한 금액을 볼 수 있습니다. 샘플은 희석 동물에서이기 때문에 그들은 특히 분명합니다. 하단 왼쪽에있는 꽃잎은 부분적으로 이상 접혀 있습니다. (B)이 전체 마운트 바람개비의 모양을하고 있습니다. 블랙 화살표 만들어진 상처의 일부를 나타냅니다. 시신경 헤드쪽으로 corneo - scleral 디비드에서 상처의 대부분은 직경에 맞게되지 않습니다. (C) 블랙 화살표 인하가 접선에 수직 직경과 라인에서 만들어진해야하는 방법을 나타냅니다.

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	<li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzo(a)pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice.">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li><li>Reliene, R. H. l. a. v. a. c. o. v. e., Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice.">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li><li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice.">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li><li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion.">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li><li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo.">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , (2010).</li><li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-,+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development.">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li><li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity.">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li><li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+phenotype+and+the+RPE:+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt?.">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?.</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

RPE는 상동 - 감독 수리 생체내 분석에서 P 유엔 분석의 사이트입니다. P 유엔 분석은 상동 - 감독 수리의 주파수에서 다른 DNA의 손상의 효과 1,2 및 DNA 손상 신호 및 복구 유전자 3,4,5을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 분석은 RPE 1 단일 셀 이벤트를 감지, 매우 민감합니다. 또한 개발 6 중 상동 - 감독 복구 이벤트의 타이밍의 차이를 감지...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>straight forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4903</td>
<td>tip: .08 x .04 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>45&deg; forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5005</td>
<td>tip: .05 x.01 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>15&deg; "up" forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5045A</td>
<td>tip: .1 x.06 mm material: INOX</td>
</tr>
<tr>
<td>spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5604</td>
<td>comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel</td>
</tr>
<tr>
<td>binocular dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ziess</td>
<td>Discovery V.8</td>
<td>use reflected light source</td>
</tr>
<tr>
<td>phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A22283</td>
<td>Alexa Fluor 546</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium

망막 안료 상피 (RPE)는 단지 photoreceptors을 (막대 및 원뿔)이 들어있는 신경 망막, 아래, 포유 동물 눈의 뒤쪽에 자리잡고 있습니다. RPE는 밀접하게 그냥 위에있는 신경 망막과 색소 세포 cuboidal과 동료의 monolayer입니다. 이 협회는 망막 질환을 공부하고 연구하기 위해 큰 관심의 RPE를합니다. RPE는 상동 - 감독의 DNA 수리, P 유엔 분석의 생체내 분석에의 사이트입니다. 작은 크기로 인해 해부하다 (직경 3.5mm 정도)와 구면 모양 마우스 눈 특히 어렵습니다. 이 문서 상세 RPE의 전체 마운트에 발생하는 안구의 해부를위한 절차를 설명합니다. 이 절차에서는, 우리는 눈 구면 구조에 대해 함께보다는 일을하는 방법을 보여줍니다. 간단히, 결합 조직, 근육, 그리고 시신경이 안구의 뒤쪽에서 제거됩니다. 그런 다음, 각막과 렌즈가 제거됩니다. 다음 전략적 상처가 남아있는 조직의 중요한 평평화에 결과를 만들 수 있습니다. 마지막으로, 신경 망막은 부드럽게 여전히 기본 맥락막과 공막엔에 첨부되어 그대로 RPE를 공개, 해제 해제됩니다. 이 모든 마운트는 P 유엔 분석 또는 RPE 조직의 immunohistochemistry 또는 immunofluorescent 평가를 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

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Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

마우스 눈 해부의 정식 데모는 망막 안료 상피의 전체 마운트의 결과.

망막 안료 상피의 전체 마운트를위한 마우스 아이의 해부

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

dissection-mouse-eye-for-whole-mount-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

49.0K 조회수.  Greehey Children's Cancer Research Institute and Department of Cellular and Structural Biology. 마우스 눈 해부의 정식 데모는 망막 안료 상피의 전체 마운트의 결과.

비디오: Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

망막 안료 상피 생리학과 Pathophysiology 연구를위한 실험 모델

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

연구

신경과학

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

성인 전체 마운트 준비 Drosophila</em장 섬유 염료 주입을위한> 복부 신경 코드

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

전체 마운트 근육 분석에 의한 재현성 마우스 좌골 신경 크러시와 중생의 후속 평가

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

전신 탈염 신경 근육 정션 분석을위한 트랜스 대 복부 근육의 해부

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

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The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

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The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

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Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

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In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

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The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

망막 신경절 세포 연구를 위한 마우스 망막 분리 및 메탄올 치료

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

저자 스포트라이트: 망막 신경절 세포 연구를 위한 메탄올 기반 전체 장착 준비  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

망막 신경절 세포 조사를 위한 메탄올 기반 전체 마운트 준비

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...